结合治疗Cinobufotalin和吉非替尼有力的预防肺癌的效果

文摘

本研究旨在评估的有效性cinobufotalin结合吉非替尼治疗肺癌。A549细胞接受吉非替尼、cinobufotalin或cinobufotalin +吉非替尼。MTT测定,annexin-V / PI染色和流式细胞术,TUNEL染色,DCFH-DA染色、免疫印迹、实时rt - pcr进行调查的协同抑制作用cinobufotalin结合吉非替尼对A549细胞的生长。结果表明,cinobufotalin主体性与吉非替尼显示抑制细胞的生存能力和增强的组合组的细胞凋亡。Cinobufotalin结合吉非替尼诱导显著增强活性氧(ROS)的生产伴随着细胞周期阻滞在S期逮捕,表现为细胞周期蛋白的,差别upregulation p21和对这些细胞周期素E, CDK2。此外,cinobufotalin +吉非替尼下调HGF和c-Met的水平。总之,cinobufotalin结合吉非替尼阻碍A549细胞的生存能力,促进细胞凋亡,表明联合治疗可能是一个新的有前途的治疗肺癌患者对吉非替尼耐药。

1。介绍

肺癌是全世界最典型的癌症之一,有超过200万每年新发病例和170万人死亡(1),其中nonsmall细胞性肺癌(NSCLC)占所有肺癌的85% (2]。表皮生长因子受体突变,致癌的司机突变发生在10 - 44%的肺腺癌。近几十年来,除了传统的治疗方法如手术、化疗、放疗,表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)已广泛用于治疗非小细胞肺癌患者(3]。除了提高患者的无进展生存,EGFR-TKIs比化疗的毒性更小(4]。先前的研究已经报道,吉非替尼EGFR-TKIs的第一代,对肿瘤的有效与表皮生长因子受体激活包括表皮生长因子受体L858R突变和EGFR del-19 [5,6]。然而,即使NSCLC患者最初窝藏基因突变对吉非替尼,耐药性不可避免的发展(7]。

Toschi等人认为,非小细胞肺癌耐第一代EGFR-TKIs有关异常cell-mesenchymal表皮转换因子(c-Met)活动8]。c-Met已被证明是唯一高proreceptor结合的肝细胞生长因子(HGF)。异常在NSCLC c-Met活动可以通过基因突变和高放大或调节HGF的表达。HGF c-Met,绑定后的自身磷酸化c-Met激活多种细胞内信号通路,促进肿瘤进展,入侵和转移(9]。在肺癌异常c-Met活动导致耐吉非替尼,对吉非替尼的敏感性可能通过抑制恢复c-Met信号(7]。

目前,中药已经吸引了太多的关注,因为它强有力的抗癌治疗中的应用。Cinobufotalin (huachansu)的皮肤分泌物中提取以卵泡中的解毒的好处,促进血液循环,消除血瘀(10]。多项研究表明,cinobufotalin可以调节免疫功能,促进肿瘤细胞凋亡(11]。Cinobufotalin结合化疗药物已经显示出强有力的抗癌效果在各种癌症,如肝癌、胰腺癌、肺癌和肝癌(12]。然而,它还未确定是否cinobufotalin结合吉非替尼可用于肺癌的治疗。

,本研究评估的有效性cinobufotalin结合吉非替尼对人肺腺癌A549细胞的增长,提供一个新的治疗治疗非小细胞肺癌的治疗。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和药物治疗

人类nonsmall细胞肺腺癌A549细胞株和正常的人类肺BEAS-2B细胞株是新疆医科大学第三附属医院提供的癌症研究所。Cinobufotalin和吉非替尼从Solarbio购买和国药控股,分别。A549和RPMI1640 BEAS-2B细胞培养介质含10%胎牛血清(表达载体),100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂pH值(7.2 - -7.4)。在对数生长阶段细胞分为对照组(DMSO),吉非替尼组(1、5、10、20和40μmol / L), cinobufotalin组(0.005,0.01,0.05,0.1,和0.5毫克/毫升),和cinobufotalin +吉非替尼组。

2.2。MTT试验

两A549细胞密度和BEAS-2B调整到5×10⁴/毫升和插入到96孔板,添加细胞悬液100紧随其后μl在24、48和72 h, MTT方法10μL(武汉Biofavor生物技术服务有限公司)为进一步增加了文化4 h,中吸出。150年甲瓒晶体溶解在DMSO溶液μl .空白的毛孔被用作空白组。吸光度(OD)在568 nm标仪测量。实验重复三次。

2.3。细胞凋亡和细胞周期分析

A549细胞接种在6-well板的密度2×10⁵每口井的细胞,和培养的孵化器有限公司5%₂在37°C 48 h。孵化后,细胞没有EDTA与0.25%胰蛋白酶消化,然后用PBS冲洗两次,resuspended在500μL具有约束力的缓冲区。随后,细胞混合annexin-V-FITC 5μL和propidium碘(PI) 5μL(南京凯基生物生物技术有限公司)在黑暗中在室温下为5 - 15分钟。细胞凋亡率和细胞周期被流式细胞术检测(CytoFLEX,贝克曼)。

2.4。TUNEL染色

TdT-mediated dUTP缺口末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测设备是罗氏应用科学公司买的。培养细胞浸在4%多聚甲醛在室温下(pH7.4)解决方案,其次是0.1%的PBS溶液2分钟。TUNEL反应混合物50μL在每组添加,和幻灯片是在37°C的环境在黑暗中60分钟。值得注意的是,对照组只加上luciferin-labeled dUTP 50的解决方案μl . DAPI添加为孵化在黑暗的5分钟。随后,幻灯片与antifluorescent淬火剂,密封和荧光显微镜下的图像进行了分析。

2.5。活性氧的检测

A549细胞孵育5μ米的dichlorodihydrofluorescein二醋酸盐(DCFH-DA)荧光探针在黑暗中20分钟。DCFH-DA可以通过酯酶水解nonfluorescent分子2,7-dichlorofluorescin和氧化荧光分子2,7-dichlorofluorescin ROS的存在。然后,分析了荧光发射的流式细胞分析仪检测活性氧的水平的变化。

2.6。免疫印迹

A549细胞被洗了3毫升预冷在4°C PBS。一个400μL(裂解缓冲包含PMSF(100更易/ L)添加溶菌作用,细胞被离心机在12000 r / min在4°C 5分钟提取总蛋白。蛋白质是由牛血清白蛋白浓度量化方法,加载的40岁μg总蛋白质/。随后,等量的蛋白质为每个组由sds - page分离和转移到PVDF膜。膜被封锁在TBST 5%脱脂牛奶,孵化一夜之间在4°C以下主要抗体:anti-Bax(兔多克隆抗体,00082363,Proteintech) anti-Bcl-2(兔多克隆抗体,00083551,Proteintech) anti-cysteine-aspartic酸protease-3 (15 z0096 caspase-3,亲和力),anti-cyclin(鼠标多克隆抗体,Proteintech), anti-cyclin E(兔多克隆抗体,Proteintech) anti-P21(兔多克隆抗体,Proteintech) anti-cyclin-dependent激酶2 (CDK2、兔多克隆抗体,Proteintech) anti-MET(兔多克隆抗体,Bioworld) anti-c-Met(兔多克隆抗体,Proteintech)和anti-GAPDH(兔多克隆抗体,AB-P-R001,杭州Goodhere有限公司有限公司)。膜是完全由TBST洗5 - 6次和孵化HRP-labeled羊anti-rabbit二级抗体(武汉博士德生物技术有限公司)在37°C 2 h。最后,乐队通过ECL发光检测设备。Bandscan用于分析蛋白质灰度值和计算的相对表达目标蛋白质。

2.7。实时荧光定量聚合酶链反应

从细胞总RNA提取使用试剂盒试剂。用显微分光光度计测量OD260价值,OD280价值,OD260 / OD280比RNA, RNA的纯度和浓度。RNA质量估计基于OD260 / OD280比率(比例范围:1.8 - -2.0)。样品的浓度RNA是按照下列公式计算:总RNA浓度(g / L) = OD260×40×10⁻³。总RNA是反向转录cDNA,放大和检测进行实时定量PCR。热循环条件设置如下:50°C 2分钟和10分钟95°C,紧随其后的是40周期在95°C 30年代和60°C 30年代。最终的数据与2−计算^△△Ct方法。引物序列表1。

3所示。统计分析

SPSS 22.0软件被用于统计分析。测量数据被表示为平均值±标准偏差。迷幻药的t每两组,以及用于比较和方差分析(方差分析)为多个组之间的比较采用重复测量。 被认为是具有统计学意义。

4所示。结果

4.1。Cinobufotalin和吉非替尼减少A549细胞的可行性

仅从MTT测定的结果,吉非替尼(1、5、10、20和40μmol / L)或结合cinobufotalin显著降低A549细胞的生存能力在剂量和时间的方式(图1)。吉非替尼的half-maximal抑制浓度(IC50)是24.53μ在24小时和3.23 mol / Lμ摩尔在72 h / L组组合,仅低于吉非替尼(31.61μ在24小时和6.61 mol / Lμ摩尔在72 h / L)。然而,吉非替尼的IC50值仅在BEAS-2B细胞A549细胞高于(IC50 = 17.12μM和IC50 = 6.61μ米),这表明cinobufotalin和吉非替尼的联合治疗是减少有毒正常细胞(图1 (d))。基于这些结果,40吉非替尼μmol / L和cinobufotalin 0.5 mg / mL被选为后续实验。

4.2。Cinobufotalin和吉非替尼诱导A549细胞凋亡

我们检测A549细胞凋亡在不同治疗通过流式细胞术和TUNEL分析。A549细胞的凋亡率从4.46%±0.65%控制上升到14.76%±0.48%,9.34%±0.37%,与吉非替尼治疗40 44.8%±0.62%μmol / L, cinobufotalin 0.5毫克/毫升,分别和吉非替尼+ cinobufotalin(数字2(一个)和2 (b))。随后,TUNEL分析进一步证实凋亡执行联合治疗的效果。与对照组相比,实验组的细胞凋亡显著升高。此外,A549细胞的凋亡率联合治疗组高于吉非替尼组和cinobufotalin组(图2 (c))。在免疫印迹,伯灵顿的表达和caspase-3 A549细胞接受吉非替尼+ cinobufotalin增强,而bcl - 2表达显著下调(所有 )(图2 (d))。

4.3。Cinobufotalin和吉非替尼抑制A549细胞周期在S期

接下来,我们对A549细胞进行细胞周期分析,发现在S期的细胞积累增加,但减少G2期治疗后与吉非替尼和cinobufotalin单独或组合(数字3(一)和3(b))。此外,吉非替尼的S期细胞数+ cinobufotalin组高于吉非替尼组( )。正如所料,在G2期细胞数吉非替尼结合cinobufotalin组明显低于,仅在吉非替尼和cinobufotalin组( )。然后,细胞免疫印迹进行调查cycle-related蛋白质。吉非替尼联合治疗和cinobufotalin显著下调细胞周期蛋白的表达,细胞周期素E和CDK2 ( )(图3(c))。相反,P21表达A549细胞的调节与cinobufotalin +吉非替尼治疗后( )。

4.4。Cinobufotalin结合吉非替尼促进活性氧的生产

进一步确认的参与活性氧在cinobufotalin结合吉非替尼治疗,ROS生成进行了分析通过DCFH-DA A549细胞染色,其次是流式细胞术。如图4(一)与对照组相比,ROS生产结合联合吉非替尼组明显高于仅在cinobufotalin单独或吉非替尼( )。

4.5。Cinobufotalin结合吉非替尼抑制HGF和c-Met表达式

底层机制,导致吉非替尼的优越效果结合cinobufotalin评估。cinobufotalin 0.5毫克/毫升或吉非替尼治疗40μmol / L单独或结合(cinobufotalin +吉非替尼组)显著地抑制HGF / GAPDH和c-Met / GAPDH比率为0.4765和0.62857,分别(图4 (b))。与吉非替尼组相比,蛋白质含量的HGF和c-Met组合组进一步下降( 和 ,分别)。存在分析来检测基因扩增的c-Met A549细胞,发现显著减少c-Met基因扩增结合组(图4 (c))。

5。讨论

最值得注意的发现本研究cinobufotalin结合吉非替尼增强A549细胞凋亡和抑制细胞生存能力和细胞周期的表达下调HGF和c-Met蛋白表达。这一发现填补了缺口cinobufotalin和吉非替尼对肺癌的影响。靶向治疗一直是研究重点领域的癌症在过去的十年。在非小细胞肺癌的分子生物学研究,表皮生长因子受体突变一般关心的是一个分子的目标在医学研究,和EGFR-TKIs如吉非替尼和埃罗替尼已经广泛应用于临床实践13- - - - - -15]。虽然吉非替尼对人类恶性肿瘤有一定的有益的功能,它还可以通过杀死正常细胞产生更大的毒性。此外,许多病人的平均时间开发耐吉非替尼约10个月(16]。因此,伟大的紧迫性找出一项新策略来延迟或克服吉非替尼的获得性耐药。

Cinobufotalin是一个动物人类恶性肿瘤的药物治疗。钱等人已经暗示cinobufotalin调节apoptosis-related蛋白质mcl1和invasion-related蛋白的表达(钙粘蛋白、MMP9和蜗牛)通过抑制c-Met表达式在胆囊癌症[17]。此外,cinobufotalin可以抑制胃癌细胞增殖和促进细胞凋亡12]。尽管一些研究已经表明,cinobufotalin有潜力成为一种新型抗癌剂,是知之甚少的角色cinobufotalin结合吉非替尼治疗肺癌。在最近的研究中,A549细胞cinobufotalin单独处理,发现cinobufotalin极大地阻碍了细胞的剂量和时间的方式生存。几项研究已经证实突出为NSCLC cinobufotalin结合化疗的治疗效果,这比单独化疗更有效(18]。一致,A549细胞生存能力组合组明显低于吉非替尼组,表明cinobufotalin起到了一定的协同效应与吉非替尼。

annexin-V / PI染色和流式细胞术结果显示A549细胞的凋亡在吉非替尼+组合组明显高于单一治疗组,由TUNEL分析进一步证实了。激活proapoptotic蛋白质如伯灵顿导致释放apoptogenic线粒体膜的细胞色素c,导致半胱天冬酶级联激活(19]。在这项研究中,伯灵顿和caspase-3表达升高在接受吉非替尼+ cinobufotalin A549细胞,而凋亡bcl - 2蛋白的表达下调。值得注意的是,与正常组相比,吉非替尼组和细胞周期的cinobufotalin组阻塞在S期,合并后集团的阻塞效应显著增强,从而延缓细胞的有丝分裂。除此之外,我们也注意到细胞周期蛋白的表达下调表达,细胞周期素E, CDK2和调节P21的表达细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂吉非替尼+ cinobufotalin组。最近的一份报告中称,cinobufotalin诱导ROS-dependent淋巴瘤细胞中自噬细胞死亡(19]。我们推测,ROS可能参与吉非替尼的机理结合cinobufotalin肺癌细胞凋亡。来验证这个想法,DCFH-DA染色评估ROS生成,执行和结果表明,诱导细胞凋亡的结合疗法与ROS的生成。这些数据表明,cinobufotalin强A549细胞抗癌药物吉非替尼的敏感性,从而促进细胞凋亡。

近年来,研究发现,一些患者出现主耐吉非替尼或获得性耐药在8 - 10个月,吉非替尼影响无进展和总生存期(20.,21]。陆等人进行的一项研究指出,吉非替尼耐可能与等下游表皮生长因子受体信号通路的激活MAPK / c-Fos和AKT / bcl - 2;此外,c-Met过度也可能极大地限制EGFR-targeted疗法(22]。可以放大的c-Met protooncogene绕过抑制EGFR-phosphorylated激酶途径通过ERBB3-PI3K-Akt MAPK-ERk1/2T通路。放大c-Met避免杀死EGFR-TKIs和促进肿瘤细胞的增殖促进下游信号转导通过旁路活化,最终导致耐药的患者EGFR-TKIs (23]。另外,肺癌细胞可以分泌多种细胞因子,促进连续分泌HGF的外围成纤维细胞,从而形成一个正反馈循环,导致癌细胞的无限增长24]。癌细胞高c-Met HGF表达更敏感和侵入性。c-Met EGFR通路的放大是独立的,和10%的EGFR-TKIS阻力是完全由c-Met基因扩增(25]。我们的研究结果表明,吉非替尼和cinobufotalin的蛋白表达显著下调c-Met HGF,这进一步建议cinobufotalin可以防止恶性循环的HGF / c-Met通路在某种程度上。

在肿瘤细胞株c-Met基因扩增,肿瘤细胞的增长取决于c-Met基因信号通路。然而,有一定关系EGFR-TKIS的获得性耐药和c-MET基因扩增在大约20%的肿瘤细胞系c-MET基因扩增(26]。在这项研究中,c-Met基因的扩增在吉非替尼和cinobufotalin组明显的阻碍,这是进一步被吉非替尼和cinobufotalin的综合治疗。总的来说,这些发现表明cinobufotalin不仅提高肺癌对吉非替尼的敏感性也c-Met在一定程度上抑制基因扩增。这个研究的主要局限是吉非替尼的通路机制结合cinobufotalin对肺癌仍不清楚,我们将进一步研究其潜在下游通路机制在未来。

6。结论

Cinobufotalin结合吉非替尼抑制A549细胞的生存能力和促进细胞凋亡的表达下调蛋白表达和阻塞c-Met基因扩增,胶质瘤表明Cinobufotalin可能会推迟在肺癌细胞耐吉非替尼的发生。总之,本研究为未来的研究提供了一个新奇的想法和cinobufotalin gefitinib-resistant肺癌的治疗。

数据可用性

使用的数据和/或分析在当前研究可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Youxi汉和马音了同样的工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81760014)、新疆自治区科技支持计划项目(2019 e0281),天山青年项目(2018 q048),和新疆维吾尔自治区自然科学基金(2017 d01c411)。

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