文摘

客观的。探讨肠道菌群的基本特征,代谢组学,蛋白质组学的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的停滞和血瘀。方法。十二NSCLC患者气血停滞和血瘀是选择QZXY组和15名健康志愿者为对照组。从两组收集粪便样本使用16 s rDNA技术评估肠道微生态学。收集血清样本,比较两组之间的差异在代谢组学和蛋白质组学利用液相色谱-光谱法(质)。选择另一个34岁的非小细胞肺癌患者与其他症状nQZXY集团和他们的血清样本收集。代谢组学差异QZXY和nQZXY组比较使用质和四个代谢物与最明显的差异被选为接受者操作特征曲线表示。最后,使用WGCNA软件多组结果进行了分析。结果。有两个明显的不同类型的细菌(Aerococcaceae和Abiotrophia),11个不同的蛋白质(6调节和五个表达下调),和38个不同代谢物(9调节,29日下调)QZXY和对照组之间。有一个微分细菌之间的相关性,蛋白质和代谢物。联合分析发现,不同的物质与MAPK, PI3K / Akt, Ras信号通路,癌症通路,cytokine-cytokine受体相互作用。有四个显著差异代谢物(假尿苷,phenlacetyl-C0A,L-glutamic,phospho-anandamideQZXY和nQZXY团体之间的)。结论。非小细胞肺癌气停滞和血瘀有特定的肠道菌群和蛋白质和代谢物,而与肿瘤的发生和发展密切相关。

1。介绍

肺癌的发病率和死亡率居第一位在中国恶性肿瘤。许多研究[1- - - - - -3]表明,中药(TCM)的应用程序可以控制肿瘤进展,改善生活质量,延长生存时间在治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。中医可能是一个强大的治疗肿瘤的候选人。辨证是中医的重要原则之一针对识别和处理疾病。它基于一个综合分析临床信息收集使用中医诊断的主要过程:观察、倾听、提问,和脉冲分析。近年来,研究标准化、客观化和量化中医症状已经成为流行。

系统生物学是一个新兴学科基于现代生物实验技术和持续的发展。其研究方法包括转录组、蛋白质组学、代谢组学和肠道微生态学。系统的概念类似于中医的整体概念。中医症状描述身体的功能状态在一定阶段作为中医理论的一部分。这是一个高度概括的生理和病理状态在一定阶段疾病的发生和发展。症状可分为瞬时的,动态的,积分。

用系统生物学的方法客观地研究中医症状有利于揭示其本质。肺癌的中医病理性质如下:起源不足和过剩,过剩的健康气疼,和邪恶的气进入肺的机会。气停滞和血瘀是肺癌的重要致病过程(4]和[5,调节气和活血的处方有很好的疗效(6]。在这项研究中,16 s rDNA和液体色谱-光谱法(质)技术被用来研究蛋白质组学,代谢组学,和肠道微生态学的非小细胞肺癌气停滞和血瘀,旨在提供一种生物学基础在非小细胞肺癌中医症状的诊断和实验依据的未来使用中药抗癌治疗。

2。材料

2.1。一般信息

本研究的研究对象是46从胸肿瘤手术患者之间的浙江肿瘤医院门诊3月1日2019年9月30日,2019年,世卫组织计划进行彻底切除肺癌入学前没有任何治疗。12个病人被发现有QZXY综合征由两个副董事、中医内科医生在同一时间。剩下的34个病人被确定为参与者与其他症状(9个患者脾脏虚证和湿停滞(PXSZ)综合症,11例气不足,阴(QYLX)综合症,14名患者阴虚与内部热量(YXNR)综合症)。此外,包括15名健康志愿者。

本临床研究浙江肿瘤医院伦理委员会的批准(批准号irb - 2018 - 219)。

2.2。诊断标准的患者

患者确诊的非小细胞肺癌组织病理学和/或细胞病理学(7]。病人遇到以下QZXY综合症的诊断标准[8,9),包括咳嗽,不光滑,气短、胸痛锥或荆棘,口干,便秘,咳血或痰血腥和深红色,嘴唇深紫色的舌头,舌头瘀斑,薄黄苔,脉弦或涩。

2.3。入选标准的患者

2.3.1。非小细胞肺癌患者

患者符合诊断标准病人没有其他恶性肿瘤史患者年龄从18到75岁不等患者签署知情同意书

2.3.2。志愿者

志愿者没有恶性肿瘤或重大疾病史,如心血管、脑血管、肝、肾、内分泌疾病志愿者年龄在18岁到75岁志愿者签署了知情同意书

2.3.3。排除标准的患者

患者精神疾病和丧失劳动能力患者或志愿者使用抗生素治疗了近3周

3所示。方法

3.1。肠道微生态分析

粪便样本(200毫克)与30毫升的缓冲溶液混合。在1000转离心5分钟后,降水收集和resuspended 10毫升的缓冲溶液。粪便微生物DNA快速提取使用QIAAMP DNA凳子迷你工具包。总DNA提取后,检查用琼脂糖凝胶电泳和热Nanodrop 2000紫外显微分光光度计。在16 s V3-V4地区样本放大。引物信息如下:正向引物:CCTACGGGNGGCWGCAG;反向引物:GACTACHVGGGTATCTAATCC。稀释基因组DNA是用作PCR模板使用Phanta马克斯大师混合(Vazyme)高保真酶。聚合酶链反应的反应条件如下:在95°C predenaturation 3°最小;95°C变性30年代,55°C退火30年代,25 72扩展45 s,重复周期。 The final incubation was carried out at 72°C for 5 min. The PCR reaction system included the following: 25 μL 2×Phanta马克斯大师混合(Vazyme), 2μ每个引物(10 Lμ米),DDH2O添加到共有50μ(1.5 l . PCR产品μ分析了L)使用120 V连续20分钟在2%琼脂糖凝胶电泳。随后的紫外线成像都使用这种凝胶成像系统。

图书馆的质量检验后,量子位被用来量化的浓度混合图书馆池,进行了混合根据每个样本的容量要求。最后,Miseq测序计划运行。清洁读取相同的序列排序根据他们的富足,而单例对象被过滤掉。USearch用于聚类相似度为0.97。嵌合过滤后的集群序列,OTU物种分类。最后,所有清洁读取OTU序列匹配。读取,可以匹配OTU提取获得最终的映射读取。

3.2。蛋白质组学分析

总共30μ与200年g蛋白质提取涨跌互现μL 8 M尿素。混合物是离心机在20°C和14000 R 15分钟。与200年集中被稀释μL 8 M尿素在0.1 Tris-HCl pH值8.5和离心机。与100年沉淀被稀释μL 8 M尿素在pH值8.5和0.1米Tris-HCl再次离心。集中消化在湿室在37°C 12 h与胰蛋白酶(酶蛋白比例:1:100年,50米MABC)然后离心机。消化解决方案收集50和冲洗μL的0.5 M氯化钠。最终的解决方案是结合10%三氟乙酸,酸化,然后脱盐使用C18Tips(皮尔斯,热科学伶猴C)。激活,均衡,肽洗脱,洗脱进行根据制造商的指示。提示被激活和两个冲洗在50%乙腈(ACN)和平衡两个冲洗0.1%三氟乙酸(组织)在水里。peptide-rich解决方案在慢慢吸气和分布式使用提示10周期。两个洗海水淡化过程进行组织为0.1%。这物质肽筛选了50μL 50%的。在真空中筛选了产品是干,然后悬浮在30岁μL 0.1%的甲酸。解决方案含有盐分的肽(3μL)单独使用一个EASY-Nano-LC系统(热费希尔科学)和在线nanomobile液相色谱。信用证是连接到一个2厘米precolumn内径100μm和满5μm C18树脂(热费希尔科学)。precolumn反应后,75年μm×15厘米毛细管柱充满了3μm C18树脂(热费希尔科学)。多肽的筛选了柱前和分析柱的使用逐步梯度洗脱,紧随其后的是一个搜索的所有原始文件对UniProt人类蛋白质序列数据库MaxQuant(版本1.6)。珀尔修斯被用来计算每个子群的折叠变化。蛋白质组有超过两个数据帧的变化(2 >或< 0.5)被标记为显著改变的蛋白质。

3.3。代谢组学分析

血清样本(200μL)在室温下放置在冰。然后,600年μL甲醇/乙醇(1:1),在一夜之间被冷藏在−20°C,是补充道,涡旋状的30年代,离心机在4°C 14000 rpm,持续15分钟。上层清液放入离心管,干真空离心浓缩器。干燥后,样品被再溶解在乙腈/甲醇(80/20)和水的混合物(1:1),旋风60年代,在4°C和离心机在14000 rpm 15分钟,和4μL上层清液的提取和分析使用UPLC-Q / TOF-MS。ExionLC广告的样本分离超高效液相色谱(UHPLC) ACQUITY UPLC高速钢T3列(100×2.1毫米,1.8μ米)使用以下规格:样品板的温度:4°C;柱温:40°C;样本数量:4μL;流动相组成:乙腈(包含0.1%甲酸),B:水(含有0.1%甲酸);和流量:0.3毫升/分钟。洗脱梯度是0 - 1分钟,95% b;1分钟,95∼1% b;和20分钟,1% b。样本使用UHPLC分离和分析与x - 500 r质谱仪(AB SCIEX)。离子的显著差异筛选使用单和多维统计分析( ,FC > 1.5和VIP > 1.0)作为潜在的生物标记物。

3.4。结合肠道微生态学和代谢组学的分析

斯皮尔曼相关分析是进行二次微分代谢产物筛选利用代谢组学和显著差异水平的细菌获得通过16 s测序分析以识别微生物区系和代谢物之间的关系。基于计算结果,选择适当的筛选条件来获取最终的相关性和网络图。

3.5。结合Proteomics-Metabolomics分析

通过结合使用KEGG通路代谢组学和蛋白质组学数据分析、蛋白质和代谢物,参与重大变化在同一生物过程(KEGG通路)可以快速识别和使用目标关键基因。这个过程分为以下步骤:(1)检查是否通过KEGG代谢途径相关蛋白质组和代谢组;(2)筛查的显著差异数据和监管关系;(3)去KEGG富集分析;(4)聚类关联数据的表达模式;(5)创建关联数据网络图。

3.6。统计方法

肠道分布范围与不同组之间的显著差异识别使用rank-sum测试。筛查是一个阈值的意义值< 0.05。所有p值是验证使用罗斯福。微分分析蛋白质的差异表达蛋白质需要满足下列条件:符合不同比例(上下)和1.2倍P值< 0.05。的t以及方法仅限于两组之间的比较与生物样品重复。当进行两组之间的差异代谢物分析样品,单变量分析可以直观地显示两个样本之间的代谢物变化的意义,从而帮助筛选潜在代谢物(通常是FC > 1.5和标志值< 0.05为筛选标准)。斯皮尔曼相关系数是用于联合分析。它是一个线性相关系数,这是一个统计量用来反映两个变量之间的线性相关程度。相关系数是表示使用r,在那里n是样本容量。这是两个变量的观测值和均值,分别。R描述了两个变量之间的线性相关程度。的绝对值越大R,相关性越强。QZXY之间的相关分析显著不同的代谢物和nQZXY团体使用二进制逻辑回归进行了分段法。接受者操作特征曲线是用来评估在区分这两个微分代谢物的功效。

4所示。结果

4.1。基线主题数据

十二NSCLC QZXY综合症患者中包括QZXY组。共有34 NSCLC患者其他症状(PXSZ、QYLX YXNR)包含在nQZXY组。15名健康志愿者组成对照组。上述信息是显示在表1。

4.2。微生态组之间的差异

4.2.1。准备维恩图解

16 S测序分析显示,共有249个辣子鸡是来自27个样本(图1)。

4.2.2。微分物种分析

线性判别分析(LDA)效果(LEFSE)分析使用线性判别分析(LDA)来估计每个组件的丰度的影响(物种)的不同效果,确定社区或物种对样品部门有着显著不同的影响。LDA分数获得使用线性回归分析的重要微生物组如图2。

4.2.3。斯皮尔曼相关系数在不同物种的分析

LEFSE rank-sum在每个级别或使用测试是使用在属级(或在一个特定水平)选择不同的物种丰度TOP30。斯皮尔曼相关热图的物种是使用Corrplot包创建的R软件。具体结果见图3。

4.3。差异蛋白质组学组织

4.3.1。微分差别Upregulation统计分析和对这些蛋白质

频率统计信息差别,和对这些差异蛋白质被用来确定微分蛋白质在不同实验条件下的数量。水平轴代表比较组信息,纵轴代表蛋白质的数量。红色标识调节蛋白质,蓝色显示表达下调的蛋白质,和数字代表和表达下调的蛋白质(图4)。

4.3.2。差异蛋白基因的功能分析

这个词是去分析的基本单位,每一项对应一个属性。去意义浓缩分析首先映射中的每个词的差异表达基因数据库,计算基因的数量在每一项,然后采用了超几何检验识别方面大大丰富了相对于整个基因组的差异表达基因的背景。结果如图所示5。

4.3.3。KEGG途径差异蛋白质的分析

KEGG通路被使用作为一个单元的通路富集分析。超几何测试被用来识别显著富集的通路相比整个基因组的差异表达基因背景。结果如图所示6。

4.4。代谢组学组之间的差异

在这项研究中,单变量统计分析和多元统计分析被用来屏幕显著差异代谢物。MetDNA和OSI /软件被用于多发性骨髓瘤和显著差异代谢物的结构鉴定。具体的识别结果如表所示2和图7。

获得的差异代谢物报Metaboanalyst 4.0网站代谢途径分析。结果如表所示3。

4.5。结合肠道微生态学和代谢组学的分析

4.5.1。相关分析的微分代谢物和微分植物

微生物区系和代谢物的分析结果如图8和9,红色标识正相关,蓝色代表负相关。

数据8和9表明Peptoniphilus phenylacetyl-L-glutamine呈正相关,和硫酸吲哚酚。普氏菌与phenylacetyl-L-glutamine和16-hydroxypalmitate负相关。双歧杆菌和18-hydroxyoleate也负相关。

4.5.2。微分代谢物和微生物区系网络监管分析

不同的节点图中代表不同的植物(轮)或代谢物(三角形)。植物之间的界线和代谢物代表两者之间的相关性,其中实线标识正相关,虚线代表一个负相关。结果如图10和11。

4.5.3。结合Proteomics-Metabolomics分析

联合proteomics-metabolite分析的结果在图所示12。

4.5.4。代谢物的分析QZXY组和nQZXY组之间的区别

ROC曲线是用来分析两组之间的不同代谢物。结果如图所示13。

5。讨论

目前,非小细胞肺癌治疗主要涉及不同的综合治疗策略根据肿瘤病理类型和临床阶段,可改善临床症状,延长生存时间。然而,个体差异导致预后[伟大的变化10]。越来越多的证据(11,12)表明,中医通过辨证可以改善现状。然而,其有效性一直质疑因为综合症的未定义的分子机制。本报告试图提供一个科学的解释综合症通过观察综合症的生物学基础的类型的气停滞和非小细胞肺癌患者的血瘀。

目前的研究发现,蛋白胨细菌与谷氨酰胺呈正相关,indolophenol和其他代谢物通过网络监管微分代谢产物和菌群分析。发现调节代谢物谷氨酰胺抑制人肺腺癌A549细胞的迁移,可能通过下调TNF的表达α和NF-ΚB p65蛋白(13]。靛酚可以由isopentenylation色氨酸衍生品。色氨酸被发现在许多肿瘤代谢迅速。Peptoneophilus与代谢物呈正相关,比如谷氨酰胺和靛酚。人们已经发现在子宫内膜癌组织(丰富14]。蛋白胨和肺癌之间没有相关性被发现。这表明,蛋白胨可能影响肺癌的形成和发展通过调节不同的代谢途径。普氏菌和双歧杆菌与脂质代谢产物负相关(棕榈酸、油酸酯)。棕榈酸能促进epithelial-mesenchymal转换肺肿瘤细胞,从而增强他们的入侵。微生物区系已被证明是参与宿主代谢和调节生产激素和胆汁酸(15]。目前的研究发现,很多细菌属和脂质代谢负相关。这表明之间可能存在某种机制菌群和脂质代谢调节肺癌的发生和发展。非小细胞肺癌患者QZXY综合症的临床症状血瘀,瘀斑等舌尖。研究[16]表明,应用Danshensu丹参的提取的影响,促进血液循环,消除血瘀,可以有效地调节高脂血症大鼠血脂异常,异常之间的关系提供一个理论依据脂质代谢和QZXY综合症。

本研究探讨了信号通路的变化在NSCLC患者QZXY multiomics水平。五个信号通路,包括MAPK、PI3K-AKT Ras,癌症通路和cytokine-cytokine受体相互作用,筛选使用关联数据网络图。作为传统中药促进血液循环,消除血瘀,三七的有效成分作用于表皮生长因子受体,MAPK14,和其他目标,调节癌症通路,cytokine-cytokine受体相互作用,和其他信号通路和发挥抗炎作用17]。它也发现corydus可以发挥促进血液循环的效果通过调节cytokine-cytokine受体交互和其他信号通路18]。的结合黄芪和片姜黄(调色气和激活血液循环)可以表达下调MAPK的表达和抑制移植Lewis肺癌肿瘤的生长和转移肿瘤小鼠(19]。总而言之,我们推测,上述五个途径与肺癌密切相关。进一步的研究可能有助于探索如何用中医理论结合生物标志物来深入探索中医药治疗肺癌的机制,这是特别重要的,可以为临床治疗提供新的靶点。

我们也试图分析的代谢组学差异QZXY和nQZXY组。四个代谢物与中华民国> 0.9和高敏感性和特异性被发现。假是一个组件的tRNA合成人体,可显著降低RNA来刺激免疫系统的能力。这可能有助于肺癌细胞避免免疫反应。谷酰胺也被分析。研究结果表明,相对于非小细胞肺癌患者与其他症状有显著差异在QZXY综合症患者的代谢产物。这意味着QZXY综合症可以从其他综合症诊断和分化,表明有微观的存在的证据。然而,本研究的样本量较小,可能创建一个偏见的来源。因此,这些结果仅为以后的调查研究提供一定的参考价值。之前的一项研究[20.)发现综合征的类型有不同的影响肿瘤恶化通过建立“Zheng-first”和“Tumor-first”模型小鼠的皮下胰腺癌不同的综合征的类型。这些结果可能为后续研究提供了一个方向。

使用系统生物学方法研究中医症状有助于辨证和治疗提供客观依据,提出高效和低毒个性化治疗肿瘤病人。在这项研究中,结合multiomics QZXY在非小细胞肺癌患者进行分析。这次调查不仅促进了肺癌的研究并确定其致病机制目标,但也提供了理论支持和技术基础的预防和治疗肺癌使用中药。

6。结论

非小细胞肺癌气停滞和血瘀有特定的肠道菌群和蛋白质和代谢物,而与肿瘤的发生和发展密切相关。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从作者要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究在国家自然科学基金的支持下,研究肠道的免疫调节作用是细菌在肺癌小鼠和清肺基于混合物理论的干预“肺和大肠表面和内部”(没有。81973771),浙江省中医药科学技术计划项目:研究中医症状之间的相关性和现代生物标志物在非小细胞肺癌患者基于肠道微生物群落结构特征和代谢组学(没有。2019 zz002), Affilliation:基础医学研究所和癌症,中国科学院310022年杭州,中国。