文摘

本研究的目的是评估肠道微生物群的作用和抗氧化作用的7 Baizhu圣(SLBZS)作为补充在溃疡性结肠炎(UC)诱导的大鼠模型,2,4,6-trinitrobenzenesulfonic酸(TNBS)。急性肠道炎症诱导在40岁的雄性SD大鼠4周和100毫克/公斤TNBS,然后三个剂量SLBZS (0.5 g / kg, 1克/公斤和1.5 g / kg)管理的八天,分别。粪便微生物组成由16 s rRNA高通量测序来评估。结果表明,SLBZS可以减少肠道微生物群和增加了丰富的多样性。在属级,生产细菌包括SCFAs的相对丰度普氏菌和Oscillospira增加,而投机取巧的病原体包括的相对丰度脱磷孤菌属和Bilophila降低了。同时,SLBZS可以提高结肠损伤,显著降低MPO水平,增加SOD和CAT的水平在大鼠的血清。这些发现表明SLBZS在老鼠模型是有效的和拥有anticolitic活动减少宏观和加州大学的显微镜的结肠损伤,增强抗氧化能力,调节肠道微生物群。

1。介绍

加州大学,作为一个慢性、复发和汇款的胃肠道炎症发病率高,带来很多痛苦的患者(1]。肠道微生物群被认为是一个关键因素在推导加州大学(2,3微生物群),特点是异常导致菌群失衡,减少肠道微生物生态系统的复杂性(4]。与此同时,加州大学被认为是肠道菌群与粘膜免疫之间的失衡造成的(5]。在UC患者肠道菌群的组成和功能多样性和肠道细菌据说被烧毁的稳定性6]。此外,特定的厚壁菌门减少,但拟杆菌门和乳酸菌增加(7]。因此,寻找补充保护作用在肠道微生物群迫切需要发展。

研究表明,一些中药可以调节肠道微生物群的组成和肠道微环境8- - - - - -10]。与此同时,肠道微生物群是必不可少的传统中药的代谢在活的有机体内(11,12]。SLZBS起源于宋代“太平惠民混合剂,”组成的人参,茯苓、白术macrocephala,薯蓣属opposita,白扁豆,莲子,薏苡仁,果实Amomi,Platycodon grandiflflorus,乌拉尔甘草Fisch医生。现代药理研究表明,许多组件SLBZS含有抗炎活动。人参多糖的成分之一人参,改善肠道人参皂苷的代谢和吸收(13]。此外,人参皂苷Rg1也的主要成分之一人参,其代谢产物能抑制结肠炎(14]。16α-Hydroxytrametenolic酸从茯苓改善肠屏障功能(15]。山药多糖的薯蓣属opposita减少炎症引起的大鼠结肠炎模型TNBS [16]。多糖的白术macrocephala可以通过广泛的肠道微生物群修改改善溃疡性结肠炎和宿主代谢(17]。此外,据报道,SLBZS,通过应用程序的组合,可以治疗UC显著地(18]。此外,研究表明,SLBZS可以调节UC的发病机制与减少炎性细胞因子,抑制pyroptosis,和保护结肠屏障完整性(19,20.]。目前,没有统一的结论在加州大学对肠道微生物群的影响,中药SLBZS对加州大学,没有理论上的解释。最近的研究表明,SLBZS UC的补充和替代补充治疗,可以缓解临床症状,改善生化条件和恢复肠道屏障功能(13]。SLBZS作为一个著名的中国草药配方被报道用于治疗UC的机制尚不清楚。

TNBS用于建立UC模型是一种常见的建模方法(21]。在这项研究中,采用TNBS诱导UC模型评估SLBZS治疗的有效性和安全性的加州大学,它提供了一种理论依据补充在治疗UC的发展。然后,收集粪便样本10天来确定结构的变化和多样性的肠道微生物群的SLBZS治疗UC的减轻。此外,血清炎症因子的水平和抗氧化酶活性测定,和在UC大鼠结肠病变的观察。

2。材料和方法

2.1。TNBS和SLBZS做准备

5% TNBS从Sigma-Aldrich有限公司购买TNBS有限公司5%和50%的乙醇混合(1:1)当使用。中药处方SLBZS,购自北京同仁堂(很多没有:16101034)组成人参,茯苓,白术macrocephala,薯蓣属opposita,白扁豆,莲子,薏苡仁,果实Amomi,Platycodon grandiflorus,和乌拉尔甘草Fisch医生使用时,溶解在蒸馏水。

2.2。实验动物

80克∼100 g SD雄性大鼠4周岁购买从南方医科大学实验动物中心(批准文号:SCXK 2016 - 0041)。所有的老鼠被安置在塑料笼子与环境温度控制在22°C∼24°C与光12小时,免费的饮用水和食物。笼子的底部内衬白皮书便于观察大便。填充代替测试期间的每一天。本研究的实验过程都是由动物伦理委员会批准的华南农业大学(广州)。

2.3。实验设计

经过5天的适应性喂养,40雄性小鼠随机分为正常对照组(CON)、模型组(TNBS)、低剂量SLBZS集团(TNBS-L),中等剂量的SLBZS组(TNBS-M)和高剂量的SLBZS集团(TNBS-H) (n= 8)。所有的老鼠体重提前一天的建模和禁食除了水在前12 h建模。CON组与正常生理盐水治疗,而所有其他老鼠提供了100毫克/公斤TNBS经直肠为单个政府诱导急性溃疡性结肠炎。建模2天后,老鼠在CON组和TNBS组用生理盐水intragastrically管理,和三个剂量SLBZS集团是由口腔填喂法SLBZS 8天,0.5 g / kg SLBZS老鼠TNBS-L组,1克/公斤SLBZS TNBS-M组大鼠,和1.5克/公斤SLBZS TNBS-H组大鼠,分别。

然后,粪便与液态氮冷冻立即和存储在−80°C。麻醉大鼠的腹主动脉解剖收集血液样本,然后分离血清。新鲜的结肠组织中收集10%福尔马林的组织病理学进行调查。

2.4。高通量16 s rRNA基因扩增子测序

的总DNA提取粪便使用TIANamp粪便DNA工具包(北京,DP328)。提取的DNA是由0.8%的琼脂糖凝胶电泳,紫外分光光度计定量分析。然后,选择DNA被16 s rRNA V3-V4放大区域。的16 s rRNA V3-V4区域引物PCR扩增338 f (5-barcode + ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3 '), 806 r (5“-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3”)。PCR反应体系(25μL)如下:0.25μL Q5高保真DNA聚合酶PCR, 5μL反应缓冲(5×),5μL高GC缓冲(5×),2μL国家结核控制规划(10毫米),2μL模板DNA, 1μ8.75 L的底漆,μL双重蒸馏水。PCR反应条件是98°C 30年代开始,紧随其后的是25周期在98°C的变性30年代,退火在50°C 30年代和30年代在72°C扩展。PCR扩增产品被电泳鉴定,然后放大产品回收和纯化使用Axygen DNA凝胶回收和净化设备。Illumina公司的产品排序MiSeq测序平台。

2.5。生物信息学和统计分析

QIIME用于操作分类单位(OTU)分类和识别22,23]。使用R软件画稀疏曲线,α多样性指数,包括Chao1估计量和香农多样性指数计算。主成分分析(PCA)和加权和不加权的非度量多维标度(nmd)分析基于UniFrac社区组成结构进行了在属水平通过R软件(24,25]。据统计的相对丰度两个级别的分类,分析了门,属两个级别的。

2.6。测定血清中抗氧化活性

髓过氧化酶(MPO),超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的血清水平每组确定使用酶联免疫试剂盒根据制造商的协议(上海Meilian生物科技有限公司,上海,中国)(目录号码:ml003250 ml059387, ml037079)。

2.7。组织学观察结肠

收集到的结肠组织在10%福尔马林固定,脱水和不同浓度的乙醇、二甲苯清除,嵌在石蜡中。石蜡包埋组织是切成薄片的厚度5μm。苏木精和伊红染色(他),石蜡嵌入组织应承担的脱蜡,水化,染色,脱水,二甲苯清除,密封。为TdT-mediated dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色,幻灯片是脱蜡、水化、孵化和蛋白酶k .然后,幻灯片和PBS洗清除蛋白酶k H孵化后为3%2O2在PBS,幻灯片用PBS洗净,然后用TUNEL孵化反应混合。反应被终止停止解决方案然后孵化链霉亲和素合解决方案。洗后,幻灯片被孵化与民建联显色溶液直到浅棕色背景出现。安装后,幻灯片光学显微镜下观察。

2.8。数据分析

这一研究获得的所有数据统计处理,和散度提出了意味着±SE。单向方差分析与SPSS 20.0统计,用于多重比较 被认为是明显不同的。

3所示。结果

3.1。影响肠道菌群结构的每组治疗后

1707839高通量测序后,得到了有效的序列,包括CON组有307951人,302534年TNBS集团383561年TNBS-L集团TNBS-M组有377902人,335891 TNBS-H组。QIIME软件对这些序列进行OTU分区,这是基于序列相似性为97%。β多样性分析包括PCA和加权和未加权的基于UniFrac nmd是用于分析不同样本之间的相似性的肠道微生物群。PCA和nmd分析显示,(数字1(一)- - - - - -1 (c))TNBS组的肠道微生物群的结构不同于CON组。然而,SLBZS管理后,SLBZS组肠道菌群的结构是类似的诈骗集团,尤其是TNBS-M TNBS-H组,证明政府SLBZS可能恢复UC大鼠的肠道结构。Chao1和香农曲线(数据1 (d)和1 (e))表明,曲线趋于平坦的测序深度大于15000时,证明测序深度足以反映了物种多样性基本上包含了所有物种在样例。α多样性指数(数据1 (f)和1 (g))表明,香农多样性指数TNBS-L组低于CON组和TNBS集团( ),和Chao1估计SLBZS组高于CON组和TNBS组( )。

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图1
对每组的肠道菌群结构的影响。(一)主成分分析分析。(b)未加权的nmd分析。(c)加权nmd分析。(d)香农曲线。(e) Chao1曲线。每组(f)香农多样性指数。每组(g) Chao1估计量。得了酒吧在相同的索引标记相同的字母显著差异( )。
3.2。分类组成的社区在门和属水平治疗后

三个典型的微生物群在门级厚壁菌门,拟杆菌门,变形菌门(图2(一个))。SLBZS治疗可能增加的相对丰度厚壁菌门和变形菌门和减少拟杆菌门在UC大鼠(图2 (b))。在属级(图2 (c)),6 110属SLBZS治疗后通常是不同的。TNBS-L和TNBS-H集团的相对丰度普氏菌增加到正常水平,但是Bilophila,拟杆菌,幽门螺杆菌相比TNBS组下降。TNBS-M组SLBZS的相对丰度Oscillospira接近正常水平(图2 (d))。

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图2
每组的分类组成社区的影响。(一)直方图的微生物组成每组门水平。(b)相对丰富的细菌在门级。(c)直方图的微生物组成每组属水平。(d)相对丰富的细菌在属水平。得了酒吧在相同的索引标记相同的字母显著差异( )。
3.3。对治疗后血清抗氧化酶的影响

如图3SLBZS治疗可以降低MPO的活性升高引起的加州大学( )。TNBS-L SOD活性和TNBS-M组相比TNBS组升高( )。猫TNBS-L活动和TNBS-H组相比TNBS组升高( )。


图3
每组治疗后血清抗氧化水平的因素。MPO、SOD和CAT含量UC大鼠。a - b酒吧在相同的索引标记相同的字母显著差异( )。
3.4。结肠组织的组织学变化每组治疗后

腹泻,略直肠脱垂,略观察结肠肿胀TNBS-induced老鼠。SLBZS管理后,在UC大鼠结肠病变的改善。结果说明,有正常的组织学特性CON组,但大量的炎症细胞渗透,模糊TNBS组中每一层的结构,每一层的结构和TNBS-H组更清晰和更综合TNBS组相比,TNBS-L组和TNBS-M组(图4(一))。更多的凋亡细胞TNBS组相比SLBZS组观察(图4 (b))。SLBZS逆转这些变化。

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图4
每组结肠组织学的变化。(一)他染色(比例尺是100年μ米)。(b) TUNEL染色(比例尺是100年μ米)。

4所示。讨论

溃疡性结肠炎是一种慢性炎症性疾病的结肠不清楚机制。一般来说,它一直认为其发病机制涉及上皮屏障的缺陷缺陷,免疫反应特异表达和肠道菌群的失调。TNBS-induced溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎大鼠由腹泻、结肠溃疡的组织,增强血清MPO活动(26,27]。在这项研究中,所有UC模型大鼠表现出腹泻的临床症状。同时,肠道微生物群的干扰和抗氧化系统存在于UC模型大鼠,表明UC模型成功建立在这项研究。

异常微生物组成和减少肠道微生物生态系统的复杂性是加州大学的共同特征28]。目前的研究表明,SLBZS补充可以改善消化不良和修改提供肠道微生物群落的组成和功能(29日]。它包含不同类型的组件,不仅营养价值高,而且调节肠道微生物群。监测肠道微生物群的结构调制与SLBZS UC治疗期间,执行16 s rRNA高通量测序在我们的研究中。Chao1估计量反映的研究也进行了gimator和香农多样性指数的比较分析,我们发现SLBZS治疗减少了香农多样性指数,但增加了Chao1估计量,表明SLBZS治疗UC通过减少肠道微生物群的多样性,同时提高其丰富性。PCA和nmd表明SLBZS治疗能改变微生物群的结构和成分,和微生物群的结构可以更接近正常状态比TNBS组。为了进一步分析不同治疗后肠道微生物群的结构,本研究也进行了比较分析肠道微生物群的每个组的门和属水平。我们发现的相对丰度Bilophila,脱磷孤菌属,拟杆菌减少TNBS-L和TNBS-H TNBS集团Oscillospira和幽门螺杆菌在TNBS-M增加,普氏菌增加TNBS-L和TNBS-H组。普氏菌和Oscillospira是SCFA-producing细菌(30.,31日],SCFA结肠粘膜的重要营养物质,能够结肠癌细胞增殖和粘膜增长(32]。未消化的膳食纤维,蛋白质和多肽,可以通过肠道微生物群在盲肠和结肠发酵,导致短链脂肪酸的生成。SCFA可以诱导肠上皮细胞分泌的地震,抗菌肽,粘蛋白和移植的表达紧密连接调节肠道屏障的完整性(33]。与此同时,SCFA可能诱导中性粒细胞迁移,提高吞噬作用(34]。拟杆菌参与新陈代谢和营养吸收在活的有机体内(35),但促进炎症在炎症性肠病(36]。这两个脱磷孤菌属和Bilophila是机会致病菌,创建H2结合H2通过硫酸或含硫化合物,具有重要的关系与肠上皮细胞的炎性状态(如加州大学)(37]。虽然幽门螺杆菌被定义为传染性病原体根据科赫公司的法律,研究表明,幽门螺杆菌可以通过诱导调节免疫内稳态系统的耐受性DCs和免疫抑制亚群。的身体幽门螺杆菌删除比对照组更容易结肠炎(38]。但感染的老鼠幽门螺杆菌hepaticus会导致结肠炎(39]。这些表明之间的关系幽门螺杆菌和炎症性肠病需要进一步披露。因此,这些结果进一步表明,改善UC使用SLBZS可能由细菌产生的浓缩SCFA保护结肠粘膜和减少细菌,如拟杆菌,脱磷孤菌属,Bilophila,抑制炎症。

结肠上皮细胞和粘膜屏障强烈与溃疡性结肠炎的发病机制有关。通过抑制结肠上皮细胞的凋亡,粘膜溃疡和粘膜上皮细胞损伤在UC大鼠可以改善1]。900年,作为一个著名的公式SLBZS已广泛应用于治疗胃肠疾病。据报道,SLBZS可能表现出改善对腹泻的影响调节肠道吸收功能以及粘膜超微结构(40]。病理切片的结肠癌和结肠的变化在每一组的实验中,高剂量的SLBZS加州大学有一定的恢复影响肠道绒毛超然,结肠的整体结构损伤,炎症细胞浸润,并诱导细胞凋亡,这是有利于规范重吸收能力和结肠的粘膜屏障。此外,在大鼠的血清抗氧化酶的活动也被确定。MPO主要是位于苯胺蓝粒子在中性粒细胞(41),这在一定程度上反映了炎症状态。研究发现,活性氧(ROS)是加州大学结肠粘膜组织损伤密切相关42]。尽管ROS水平低是必要的对于某些生理过程,产生过多的活性氧在UC患者(43]。SOD和CAT可以消除活性氧,防止脂质过氧化作用,维持细胞膜的稳定性。在我们的研究中,我们观察到低剂量的SLBZS治疗可以降低MPO水平( )和增加SOD和CAT的活动( )。,所有剂量SLBZS治疗可以显著降低MPO水平( )相比TNBS组。我们的研究证明SLBZS可以治疗UC提高抗氧化能力,这可能与恢复受损的结肠粘膜。

5。结论

这些发现表明SLBZS是有效的和拥有anticolitic活动作为溃疡性结肠炎大鼠模型,通过减少宏观和显微镜的结肠损伤,增强抗氧化能力,调节肠道微生物群。然而,如何SLBZS-mediated肠道微生物群的变化有助于改善UC需要进一步研究。

数据可用性

我们有原始沉积序列数据支持本研究的结果(例如,在NCBI序列读取存档数据库)和添加存款的信息数据。看到我们的数据,使用SRA RunSelector:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/752831。顺序读取存档数据库的数量如下。提交ID: SUB10154324。BioProject ID: PRJNA752831。

信息披露

提交了一个早期版本的预印在以下链接:https://www.researchsquare.com/article/rs-90760/v1(44]。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

大兴顾和周姗姗了同样的工作。

确认

支持的工作是由中国国家自然科学基金(31602096和31602096号)。