通过PI3K / Akt Tanshinone花絮诱发自噬和凋亡/ mTOR轴在急性早幼粒细胞白血病NB4细胞

文摘

Tanshinone花絮(TanIIa),一种成分的基数Salviae Miltiorrhizae,对多种实体肿瘤有抗癌效果与效率高和低毒性。尽管如此,底层TanIIa在急性早幼粒细胞白血病(APL)中的作用仍不清楚。在这里,我们表明,TanIIa大大抑制NB4细胞生存能力的IC50值31.25μmol / L。使用流式细胞仪凋亡分析,我们发现,TanIIa剂量依赖性加重NB4细胞的凋亡。从力学上看,TanIIa调节凋亡因子的水平,即cleaved-caspase 3, cleaved-PARP-1 cleaved-caspase 9日。此外,我们注意到TanIIa剂量依赖性抑制PI3K / Akt / mTOR轴。这个轴不仅函数作为一个重要的凋亡调制器作为自噬抑制剂调节器。相应地,我们发现自噬的水平标志,即LC3B, TanIIa治疗后增加。此外,自噬抑制剂Baf-A1可以有效地扭转TanIIa-induced凋亡,展现TanIIa消除NB4细胞autophagy-dependent方式。总之,tanshinone花絮施加anti-APL通过触发NB4细胞自噬和细胞凋亡的影响。

1。介绍

严重的凝血异常、急性早幼粒细胞白血病(APL)被认为是最危险的白血病亚型之前几十年的普遍应用三氧化二砷(ATO)和all-trans视黄酸(ATRA) [1]。幸运的是,ATO + ATRA可以肯定提升APL治愈率(1]。然而,大约10%的APL患者会复发由于不敏感ATO + ATRA方案(2- - - - - -4]。更严重的是,复发APL患者的3年生存率只有50 - 70% (5,6]。因此,仍有哭需要寻找APL新颖有效的药物。

基数Salviae Miltiorrhizae,植物的根茎和根干丹参知母,是传统的草药经常用于治疗癌症,心血管疾病、神经退行性疾病(7,8]。Tanshinone花絮(TanIIa;1、6、6-trimethyl-8 9-dihydro-7H-naphtho [1, 2 g] [1] benzofuran-10, 11-dione;图1(一)),主要成分提取基数Salviae Miltiorrhizae,已经证明有效的抗癌效果在实体肿瘤,如肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌(9]。先前的研究暗示TanIIa发挥抗癌作用通过各种方法,包括促进细胞凋亡,诱导自噬,调节细胞周期阻滞(9]。

PI3K / Akt / mTOR轴功能作为主要促进细胞的凋亡调制器生存和减少细胞死亡在应对外部压力,以及作为一个自噬抑制剂调节器(10]。异常激活PI3K / Akt / mTOR轴有助于癌症细胞的无约束扩散并且是最常见的途径异常参与许多癌症的维护和发展(11,12]。因此,抑制PI3K / Akt / mTOR轴被披露是一个有前途的癌症治疗的目标。急性粒细胞白血病(AML)时,超过一半的患者识别相同的PI3K / Akt障碍/ mTOR轴,这有助于减少长期生存(13]。不出所料,阻塞PI3K / Akt / mTOR轴迫使AML细胞对细胞凋亡导致增强化疗的治疗结果(14- - - - - -17]。

作为主要回收蛋白质的细胞机制,自噬发生在应对不良刺激减轻代谢压力和稳定的内部环境18]。然而,过度自噬在某些情况下会引发自噬死亡,即II型程序性细胞死亡超过阈值的保护作用[19]。死亡自噬与细胞凋亡可以同时发生,进而加速癌细胞死亡的速度(20.- - - - - -22]。因此,自噬的刺激可以作为一个潜在的治疗癌症的方法23]。有趣的是,APL细胞ATO的反应加上autophagy-dependent ATRA治疗,而阻断自噬损害的治疗效果24]。

总之,我们相信TanIIa有潜在的治疗急性骨髓性白血病,但其对APL的影响还没有得到很好的研究。在这里,我们研究了anti-APL TanIIa这样治疗的选择将影响发展。

2。试剂和方法

2.1。试剂

Tanshinone花絮(纯度≥99%,HY-N0135)和bafilomycin A1 (hy - 100558)从MedChemExpress购买,Inc . IMDM介质(12440061)和胎牛血清(10099141)从Gibco购买,公司主要抗体:anti-caspase-9 (32503), anti-caspase-3 (32351), anti-PARP-1 (191217), anti-mTOR (2732), anti-phosphorylation-mTOR (109268), anti-phosphorylation-ULK-1 (203207), anti-LC3B(192890),和反β肌动蛋白(8226)从Abcam购买,Inc .);anti-PI3K (13666), anti-phosphorylation-PI3K (17366), anti-Akt(4685),和anti-phosphorylation-Akt(4060)从细胞信号技术,购买Inc .吉姆沙染色剂解决方案(G1015)从Solarbio购买生命科学,Inc . CCK-8工具包(CK04)从Dojindo购买分子技术,Inc .细胞凋亡与膜联蛋白V / PI染色(556547)购买从BD生物科学公司。

2.2。细胞培养

人类急性骨髓性白血病细胞株NB4慷慨地赋予了杨教授沈瑞金医院、上海交通大学。NB4细胞保持在IMDM中补充10%胎牛血清和培养在37°C下湿润孵化器有限公司5%₂的气氛。

2.3。细胞生存和增殖试验

CCK-8工具包是用来量化细胞生存和增殖TanIIa治疗后的变化。实验都使用96孔板。NB4细胞悬液密度调整4×10⁴细胞/毫升,然后添加0.1毫升暂停所有。播种后,NB4细胞治疗0,1,2,4,8日,16日,32岁,64年,128年和256年µmol / L TanIIa 24 h。10μL CCK-8被添加到每个好,耐光的条件下培养1 - 4 h。450纳米的光密度量化了威尔斯Varioskan™勒克斯多平台的读者。细胞增殖试验,2×10³NB4细胞转移到井和处理0,16日,32岁的64人µmol / L TanIIa为0 - 72 h。治疗后,相对CCK-8分析获得的细胞数量。

2.4。染色染色

NB4细胞的形态改变通过染色染色进行了研究。对NB4细胞用PBS和resuspended的边后卫准备移动幻灯片。这些幻灯片与甲醇固定为5分钟,然后染色染色处理解决方案10 - 15分钟。彩色幻灯片在自来水冲洗,自然干。彩色幻灯片被放置在光学显微镜下观察到的放大400×。

2.5。膜联蛋白V / PI染色试验

凋亡细胞的比例获得通过流式细胞术分析细胞染色后膜联蛋白V /π。对NB4细胞收集和预冷PBS洗。这些细胞被resuspended通过添加0.1毫升1×绑定缓冲与温柔的吹。5μLπ和膜联蛋白V被添加到每个样本和孵化不透光条件下在室温下15分钟,然后添加0.4毫升1×绑定缓冲减少密度来提高检测精度。使用流式细胞仪对细胞凋亡细胞化验(BD Accuri™C6 +)。

2.6。西方墨点法

治疗后细胞沉淀收集和预冷PBS至少洗2次。细胞沉淀消化•瑞帕溶解产物和离心获得富含蛋白质的上层清液。浮在表面的蛋白质被调整至1的浓度μ使用2 g / mL×加载缓冲区。示例加载期间,我们确保每个样本都含有相同数量的总蛋白。样品的蛋白质在sds - page分离120 V和sds - page转移到硝化纤维膜在100 V。硝化纤维膜堵塞5%脱脂奶2 h。样本孵化主要抗体在一夜之间在4°C和二级抗体在室温下1 h。蛋白质与ECL可视化。蛋白质表达水平通过ImageJ量化软件。

2.7。统计分析

所有实验在本研究中进行至少三次。对比分析了两组使用学生的t以及,图形是由GraphPad 7.0软件。 被认为是一个统计上的显著差异。所有数据都表示为均值±SD。

3所示。结果

3.1。TanIIa抑制NB4细胞生存和增殖

评估对NB4细胞TanIIa anti-APL活动,我们进行了细胞生存和扩散通过CCK-8分析化验。我们对NB4细胞与不同剂量的TanIIa 24 h。从1 TanIIa剂量的增加μ摩尔/升到256μmol / L,它逐渐抑制NB4。值得注意的是,IC50为31.25μmol / L(图1 (b))。我们分析了NB4细胞的增殖率不同剂量处理(0,16、32和64μmol / L)和不同的时间(0,24、48和72 h) TanIIa使用CCK-8试验(图1 (c))。结果显示,TanIIa明显抑制NB4扩散通过存在剂量依赖的相关性和时间的举止(图1 (c))。

3.2。TanIIa促成了NB4细胞的凋亡

通过染色染色,我们发现16µmol / L TanIIa相比凋亡细胞的比例增加0μmol / L组。此外,NB4细胞治疗32和64µmol / L TanIIa展出晚期凋亡的形态体现在细胞质凝结,凝结核,或核碎片(图2(一个))。细胞凋亡分析表明,凋亡细胞的比例在0µmol / L组为3.60%,而在16个百分比,32,64μmol / L TanIIa-treated组增加了14.58%,23.4%,和39.3%,分别为(图2 (b))。通过免疫印迹观察apoptosis-related因素的变化,我们注意到TanIIa增强caspase-9的乳沟,caspase-3, PARP-1 NB4细胞(图2 (c))。因此,这些结果表明,TanIIa的抗增殖作用可以加速其凋亡诱导NB4细胞的倾向。

3.3。TanIIa-Induced自噬通过PI3K / Akt / mTOR轴NB4细胞

除了作为凋亡调节器(PI3K / Akt / mTOR轴也有作用,抑制细胞自噬可诱导的信号转导通过抑制轴。TanIIa暴露的影响PI3K / Akt / mTOR轴和NB4细胞自噬通过免疫印迹分析。对待不同剂量,即0 - 64µTanIIa mol / L, p-ULK-1和LC3B PI3K的同时,增加一种蛋白激酶,mTOR蛋白质水平和磷酸化水平明显降低(图3)。这些结果表明,TanIIa抑制PI3K / Akt / mTOR轴和诱导NB4细胞自噬。

3.4。阻断自噬的TanIIa诱导细胞凋亡减少

自噬是细胞的生物学行为进行侵蚀自己,市场消化回收异常和损坏的生物分子,以应对各种刺激,保持稳定的内部环境来维持生存。虽然自噬抗击各种不利的因素,但它也会造成过度self-digestion然后引发自噬的死亡,一种程序性细胞死亡,通常伴随着细胞凋亡。因此,抑制或激活自噬被认为是一种很有前途的癌症预防和治疗的方法。探讨自噬对NB4细胞TanIIa-induced细胞毒性的影响,我们使用了一个经典的自噬抑制剂bafilomycin A1 (Baf-A1)阻止TanIIa-induced自噬。然后,我们发现NB4细胞的凋亡率与Baf-A1治疗后用膜联蛋白V /π试验和免疫印迹。正如预期的那样,我们发现Baf-A1没有诱导NB4细胞(图明显的细胞毒性4(一))。同时,TanIIa结合Baf-A1减毒TanIIa-triggered NB4细胞凋亡(图4 (b))。因此,我们的研究结果表明,TanIIa-induced对NB4细胞自噬发挥了apoptosis-promoting作用。

4所示。讨论

APL是一种常见的AML亚型t (15;17)染色体易位引发白血病α重排特征遗传事件,被认为是最激进的和致命的AML亚型(1]。PML-RARA融合蛋白引起造血祖细胞的分化逮捕早幼粒细胞阶段,对细胞凋亡产生了耐药性,最终发展成APL (1]。ATO + ATRA大大改善APL的预后,但约有10%的病人会复发由于抵抗ATO + ATRA [2- - - - - -4]。除了控制临床试验,预后APL不如我们期望的25]。因此,治愈所有APL患者目前仍然是一个挑战对于我们来说,它仍然是重要的探索新的治疗策略或寻找替代药物。

与hypotoxicity作为一种天然物质,TanIIa广泛用于中国作为心血管疾病的辅助治疗7,8]。数字的研究集中在TanIIa显示其抗癌效果在各种实体肿瘤通过抑制细胞生长和促进细胞凋亡9]。男性患者复发APL耐ATO + ATRA实现形态完全缓解后治疗TanIIa在华西医院,而且没有观察到显著的毒性副作用TanIIa治疗期间(26]。这种情况下报告显示潜在的诱导治疗的TanIIa APL。考虑到对APL TanIIa的有效性是没有得到深入研究,但我们观察到的抗增殖和proapoptotic活动TanIIa NB4及进一步探讨机制。

通过使用CCK-8化验和流式细胞术细胞凋亡分析,我们发现TanIIa展出anti-APL效应通过抑制癌细胞增殖和促进细胞凋亡。细胞凋亡被认为是最主要的细胞死亡形式,由两个主要的凋亡通路,即内在和外在凋亡通路(27]。固有细胞凋亡通路是发起的渗透率增加线粒体和细胞色素C到细胞质中,进一步激活下游caspase-9和caspase-3执行凋亡细胞死亡(28]。PARP-1至关重要的DNA修复和维持细胞生存中扮演着一个重要的角色;因此,乳沟PARP-1 cleaved-caspase-3阻碍DNA修复造成的,促使细胞向死亡,因此作为细胞凋亡的指标(29日]。免疫印迹分析展出,caspase-3的乳沟,caspase-9, PARP-1 TanIIa治疗后显著调节。这些现象表明,TanIIa通过内在的细胞凋亡途径诱导NB4细胞凋亡。

PI3K / Akt / mTOR轴,最常见的人类癌症的hyperactivated通路,扮演一个关键的角色在促进细胞生长、增殖、生存和作为负调节自噬的30.]。作为一个凋亡调节器(PI3K / Akt的hyperactivation / mTOR轴阻止内在通过磷酸化的下游通路介导细胞凋亡的起始伯灵顿和坏,引发抵抗癌细胞的凋亡信号(31日]。相应地,堵塞PI3K / Akt / mTOR轴促进伯灵顿的表达,caspase-9 caspase-3,提升者内在的信号通路介导细胞凋亡(32]。同样,抑制PI3K / Akt / mTOR轴施加antileukemia效果和提高化学敏感性通过诱导自噬细胞死亡和细胞凋亡在体外(33,34]。在我们的研究中,治疗TanIIa PI3K / Akt激活降低/ mTOR轴存在剂量依赖的相关性,表明TanIIa-triggered固有细胞凋亡与抑制PI3K / Akt / mTOR轴。

此外,我们注意到抑制PI3K / Akt / mTOR轴伴随着增加LC3B自噬的标志。确认NB4细胞的自噬发生TanIIa治疗后自噬的表现死亡造成的堵塞PI3K / Akt / mTOR而不是自我保护的压力反应,使用Baf-A1我们进行进一步的实验。的小分子抑制剂Baf-A1空泡的H⁺atp酶、障碍autophagosome-lysosome融合和酸化处理的细胞的溶酶体35]。我们发现共同服用Baf-A1显著的减少了anti-APL TanIIa的影响,表明自噬TanIIa引发了自噬的表现死亡和充当其anti-APL效果的一个组成部分。

自噬是细胞内降解的生物分子的一个重要方法隔绝异常或受损的蛋白质和细胞器在自噬体与溶酶体融合,导致隔离生物分子的降解成可循环利用的小分子有机物(36]。在大多数情况下,自噬作用在稳定的内部环境,促进癌细胞生存和只在某些情况下发挥治疗效果的形式程序化死亡二世(36]。然而,新兴的研究表明,激活自噬是一种有效的治疗AML的目标。自噬在成熟中扮演一个重要组成部分的髓系祖细胞,和分化抑制自噬缺陷原因37]。自噬的负面调制器,hyperactivation PI3K / Akt / mTOR轴导致AML细胞自噬的失活,是至关重要的维持的致癌潜力白血病干细胞(38,39]。阻断自噬的功效降低ATO + ATRA对NB4细胞(38]。抑制PI3K / Akt mTOR轴通过Akt抑制剂促进程序性死亡APL (40,41]。

最近的报告表明,监管效果TanIIa PI3K / Akt / mTOR轴并不仅限于APL。张等人表明TanIIa导致急性单核细胞的白血病细胞自噬和细胞凋亡表达下调PI3K / Akt轴(42]。刘等人发现TanIIa抑制糖酵解和诱导细胞凋亡在宫颈癌细胞通过阻断一种蛋白激酶/ mTOR轴(43]。王等人表示,TanIIa逆转耐吉非替尼在肺癌细胞表达下调VEGFR / Akt轴[44]。王等人报道,TanIIa结合第四套施加稳定动脉粥样硬化斑块的影响调制一种蛋白激酶信号(45]。Tanshinone我是另一个成分提取基数Salviae Miltiorrhizae。周等人发现tanshinone我剂量依赖性抑制PI3K / Akt / mTOR轴和引发自噬和凋亡在卵巢癌细胞株(46]。考虑到PI3K / Akt / mTOR轴是许多疾病的治疗目标,特别是癌症,我们相信在TanIIa深入研究是很有意义的研究和其他活性物质的基数Salviae Miltiorrhizae。

总之,tanshinone花絮大大迫使NB4细胞对凋亡通过抑制PI3K / Akt / mTOR轴和激活内在的凋亡途径。Tanshinone花絮也诱导NB4细胞自噬,这增强了anti-APL效果。这些结果表明,tanshinone花絮”可能是一个补充和替代选择APL治疗。

缩写

一种蛋白激酶:	蛋白激酶B
AML:	急性髓系白血病
APL:	急性早幼粒细胞白血病
ATO:	三氧化二砷
ATRA:	All-trans视黄酸
缺点:	Bcl-2-associated死子
伯灵顿:	Bcl-2-associatedX蛋白质
半胱天冬酶:	半胱氨酰特定天冬氨酸蛋白酶
IC50:	一半最大抑制浓度
LC3B:	Microtubule-associated蛋白质1轻链3 b型
mTOR:	哺乳动物雷帕霉素靶
p-Akt:	磷酸化Akt
PARP-1:	保利(ADP-ribose) polymerase-1
PI3K:	磷脂酰肌醇3-kinases
PML:	早幼粒细胞白血病的蛋白质
p-mTOR:	磷酸化mTOR
p-PI3K:	磷酸化PI3K
RARα:	视黄酸受体α。

数据可用性

数据支持这个研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

YP LC写的手稿和设计研究的协议。YP和RL进行实验工作。YL和MN参与统计分析。LH监督工作,起草了手稿,尽管所有作者手稿的准备。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项研究受到了中国国家重点研发项目(2016 yfe0202800)和中国国家自然科学基金(82074240)。

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