文摘

背景。卵巢癌(OC)是积极的在女性恶性肿瘤的生存率。然而,角色的几种假基因(irPseus)免疫渗透OC和总生存期(OS)的影响没有得到足够的研究。因此,本研究旨在确定一个小说irPseus预测系统模型构建的OC和免疫治疗和化疗来确定它的意义。方法。在这项研究中,使用癌症基因组图谱(TCGA)结合Genotype-Tissue表达式(GTEx), 55个差异表达irPseus (DEirPseus)被确定。然后,我们建造10 irPseus对单变量的帮助下,套索和多变量Cox回归分析。模型的预测性能确定kaplan meier和测量的曲线,一个依赖于时间的接受者操作特征(ROC)曲线。结果。后将OC对象划分为高和低风险的子组通过分界点,据透露,受试者在高危人群有一个短的操作系统。执行的多变量Cox回归模型和多个临床病理的变量之间透露,该模型可以有效地预测预后的独立OC。渗透特征的预后模型的各种免疫细胞,并演示了对象的免疫反应和细胞毒性淋巴细胞抗原4 (CTLA4) anti-programmed死亡1 (PD-1)和anti-PD-ligand 1 (PD-L1)治疗。高的风险评分与更高的抑制浓度(IC₅₀)依托泊苷( )和丝裂霉素C ( )。结论。这是第一个研究来识别小说DEirPseus对开发的签名和验证预测系统,免疫浸润,免疫疗法,化学敏感性。OC的irPseus因素预测预后至关重要,可能作为一种潜在的治疗目标。

1。介绍

卵巢癌(OC)是一种常见的高度积极的女性生殖系统恶性肿瘤,发病率最高第四和第三世界各地的死亡率最高1]。2020年全球癌症统计报告估计,OC的发病率和死亡率占1.6%和2.1%,分别为(2]。目前常规治疗策略OC快速切除原发病灶或辅助化疗紧随其后。最近,一个非盲、随机,3期临床试验研究无进展生存和化疗后的不良事件的发生率有或没有avelumab紧随其后avelumab维护与单独化疗患者在998年以前未经治疗的上皮OC,虽然结果没有支持使用avelumab在一线治疗设置3]。越来越多的证据表明,肿瘤微环境和免疫细胞浸润过程中扮演重要角色的恶性肿瘤发展和治疗4]。增加报告表明,免疫治疗在恶性肿瘤治疗发展中是一个有前途的治疗策略。多项研究表明免疫疗法的性能,如自发癌症回归OC和揭示了免疫逃避的可能过程和响应患者的免疫抑制剂检查站OC (5- - - - - -7]。然而,最近的一项安慰剂对照随机III期试验未能支持临床使用免疫抑制剂如atezolizumab检查站和贝伐单抗在新诊断OC (8]。假基因,属于长非编码rna的一组中,首先被标记为非功能性“基因化石”或“垃圾基因”,但最近的研究显示了他们参与许多生理功能,包括肿瘤进展和预后[9- - - - - -11]。越来越多的证据显示,伪基因清单功能角色。已知,pseudogene-related lncRNAs已经证明来调整他们的父母基因和新发现的机制已经指出在不同癌症类型,包括OC (12,13]。可以利用一些肿瘤假基因作为预后的预测。据报道,高表达的rp11 - 564 d11.3与不良预后相关肝细胞癌(14]。假基因可以控制基因表达在转录和转录后水平。据报道,MYC基因通过转录监管可能导致肿瘤形成的HMGA1P6 OC (13]。然而,一般预测意义的irPseus OC尚未充分研究和假基因的可能意义OC仍然不确定。因此,第一次,我们开发了一个irPseus签名在OC预测OS和指导免疫治疗和化疗。

我们采用了一种新的成对算法开发一对irPseus签名不需要确切的表达值(15,16]。接下来,我们探讨其预测意义与OC个体,以及化疗疗效和肿瘤免疫渗透。我们首先确定了55个差异表达irPseus (DEirPseus)通过转录组矩阵分析从GTEx OC与正常组织相比,和424年irPseus双了。然后,通过单变量回归,我们筛选OS-related irPseus对。接下来,我们缩小了对套索算法和多元回归,我们开发了一个10-irPseus pair-based预后模型。

2。方法

2.1。数据收集和免疫基因和假基因来源

我们下载并进一步分析了379 OC的mRNA表达矩阵样本TCGA军团通过UCSC的齐娜(http://xena.ucsc.edu/),从88年的正常卵巢组织GTEx门户(https://www.gtexportal.org)。相应的临床数据被用于生存调查。这两个门户网站公开的数据库不需要伦理审查批准。共收集1793个免疫相关基因和通过ImmPort门户网站下载(https://immport.niaid.nih.gov)。接下来,通过HGNC数据库(13602假基因被捡起https://www.genenames.org/)。斯皮尔曼相关分析被用于标签之间的irPseus免疫基因和假基因是否符合以下标准:| |相关系数> 0.6 。

2.2。DEirPseus和irPseus对建立的识别

“limma”包R随着标准化策略被用来结合TCGA的基因表达矩阵和GTEx门户网站和计算DEirPseus OC和正常组织之间的关系。错误发现率(罗斯福)≤0.05和| log2(褶皱变化)|≥1被用作阈值。接下来,我们开发了可能的假基因对基于DEirPseus。在一对基因中,两个基因建立一对假基因按字母顺序排列的。如果表达式的值前者大于后者,假基因对取得1分;否则,比分是0。

2.3。预后标志性建筑

所有假基因对发达国家被用作候选变量预后相关建设。接下来,我们采用了单变量Cox回归模型来确定prognosis-associated假基因对,尤其是与操作系统( )。为了防止过度拟合模型中,我们进一步简化模型。接下来,一系列基因对进一步降低,同时保持高精度使用套索回归分析和10倍交叉验证。它选择变量和评估参数,更好的解决多重共线性问题和控制模型的复杂性在回归分析(17]。最后,Cox比例风险模型与逐步算法进行开发预后签名。每个病人接受个体风险评分使用以下公式:风险评分= irPseus两人的表情₁ βirPseus一对₁+的表达irPseus一对₂ βirPseus一对₂+⋯+ irPseus两人的表情_n βirPseus一对_n,在这n是假基因的数量对吗β表明回归系数通过多变量Cox回归算法。基于个体风险评分,所有受试者分为高和低风险的子组,根据建立的风险分数最好的截止时间ROC曲线1的操作系统。

2.4。验证预测模型的性能

生存两组之间的差异进行了探讨通过kaplan meier存活曲线以及生存率较。此外,预后模型的准确性被ROC曲线分析和计算的AUC 1, 3, 5年。此外,进行多变量Cox回归分析来确认风险评分是否能独立预测患者的OS OC等临床病理特征。

2.5。肿瘤浸润免疫细胞及其与模型

检查风险评分和肿瘤浸润免疫细胞之间的联系,我们包括几个算法来计算OC患者免疫渗透水平,包括CIBERSORT,伊势亚,计时器,史诗,MCPcounter, QUANTISEQ。免疫细胞浸润的差异比例计算了上述算法之间的高收入和低风险的子组发达签名被Wilcoxon检查符号秩检验。签名风险评分之间可能的联系和免疫细胞渗透进行了使用斯皮尔曼相关分析和可视化图通过一个棒棒糖。

2.6。签名的分析风险评分和免疫抑制剂检查站的基因

免疫抑制检查站已经成为一种有效和广泛运用的免疫治疗方法。实质性突破进步已经获得的理解免疫监视,包括PD-1的可能机制,PD-L1, CTLA4在癌症的发展。探索之间的联系签名风险评分和免疫抑制剂检查站基因的表达水平,我们使用了ggstatsplot包和小提琴情节显示关系。

2.7。检查签名在化疗的价值

探讨治疗的签名OC, IC₅₀通常使用的化疗药物,如依托泊苷、丝裂霉素、顺铂、OC组是通过计算Wilcoxon符号秩检验。

2.8。统计分析

区别各种临床病理的变量被学生的两组之间的比较t测试。多变量Cox回归通过R包“生存”以及风险比率(小时)和95%置信区间(CIs)。一个 显示统计学意义。时间ROC曲线绘制使用pROC”包。所有统计分析在这项研究中进行使用R3.6.1软件,版本(https://www.r-project.org/)。

3所示。结果

3.1。成对的识别假基因和预后irPseus对模型的建设

总共有97 irPseus通过斯皮尔曼相关分析确定。我们确定了55 DEirPseus(图1(一)),其中39伪基因调节和16个伪基因表达下调(图1 (b))。369 OC人与相应的完整生存的信息。基于伪基因算法,创造了424个irPseus双。单变量Cox回归分析是首先利用OS-related伪基因的筛选,和54预后irPseus对被识别。接下来,我们进行了1000次迭代后的套索算法缩小风险变量的计算签名(图2(一个)和2 (b)),完全被确定(图10 irPseus对2 (c))使用多变量Cox回归分析,其中包括18个伪基因。风险评分是基于这些成对的表达模式irPseus加权的信件收到多变量Cox回归系数。因此,风险评分计算所有患者。然后,我们计算每个ROC曲线的AUC 10 irPseus双,绘制曲线,证明了最优定位指向1.204来确定最优的irPseus对最大AUC值(图3(一个))。为了进一步确认最优,我们首先画一年ROC曲线,这表明AUC值大于0.75(图3 (b))。至于2 -和3年的auc值分别为0.744和0.697,分别(图3 (c))。此外,我们分析了1年期ROC曲线与先前的临床病理变量如年龄、年级,临床分期和肿瘤。据透露,irPseus双签名的AUC值为0.759,高于AUC值的年龄(AUC = 0.712),年级(AUC = 0.541),临床阶段(AUC = 0.591),与肿瘤(AUC = 0.585),如图3 (d)。

3.2。irPseus对风险评分模型作为OC的独立预后因素

最优截止TCGA的风险评分确定队列用于re-distinguish个人进了高和低风险的子组。模型风险评分分布和患者的生存条件的每个单独的显示在图中4(一)和4 (b)。小说irPseus两模型OC个人划分为低收入和高危组与不同的操作系统和风险评分表明更高的死亡率(图的可能性4 (c))。

然后,我们进行了一些卡方和Wilcoxon符号秩检验探索之间的可能联系的风险度和临床病理的变量。据透露,年龄(图5(一个)(图),生存状态5 (b)(图),肿瘤状态5 (c)签名的)明显相关的风险评分,而舞台(图5 (d)(图)和品位5 (e))不相关风险评分(所有的签名 )。

此外,我们采用单变量和多变量Cox回归分析测试如果irPseus对风险评分模型可以作为一个独立的预后变量。我们证实年龄(HR = 1.017, 95% CI -1.033 = 1.002,P= 0.025),肿瘤状态(HR = 6.257, 95% CI -12.294 = 3.185, ),和风险评分(HR = 2.193, 95% CI -2.756 = 1.745, )的帮助下表现出明显的统计学差异单变量Cox回归分析(数据5 (f)和5 (g))。多变量Cox回归分析揭示了风险评分(HR = 1.932, 95% CI -2.439 = 1.530, )和肿瘤状态(HR = 5.477, 95% CI -10.825 = 2.771, )作为OC的独立预后因素。

3.3。联系irPseus对签名,肿瘤浸润免疫细胞,免疫抑制剂检查站

探索免疫细胞丰度的差异之间的高和低风险的子组,我们因此测量签名和肿瘤免疫微环境之间的关系通过Wilcoxon符号秩检验。我们的结论是,签名风险评分主要是参与肿瘤浸润B细胞等免疫细胞,巨噬细胞,巨噬细胞M1,血浆树突细胞,巨噬细胞平方米,癌症相关的纤维母细胞、CD8⁺T细胞,内皮细胞,中性粒细胞,基质得分,但一个个细胞,NK细胞、CD4细胞⁺T细胞,T细胞卵泡助手(图S1)。详细的斯皮尔曼进行了相关分析和呈现在图6(一)。近年来免疫抑制剂检查站的出现彻底改变了治疗癌症的个体模式。免疫抑制检查站已经成为一种有效和广泛运用的免疫治疗方法。我们检查如果签名风险评分与免疫抑制剂基因和检查站证明模型的高风险分数负相关的高表达CTLA4 ( ,图6 (b)),PD-1 ( ,图6 (c))和PD-L1 ( ,图6 (d))。

3.4。irPseus对签名和化疗之间的联系

除了检查站封锁治疗,我们也旨在研究之间的关联irPseus对签名和常规化疗治疗OC的性能。据透露,较高的风险评分密切相关更高IC的一半₅₀化学疗法,如依托泊苷( )和丝裂霉素( ),而失败的关系为顺铂具有统计学意义( ,图6 (e)- - - - - -6 (g)),这表明irPseus双签名在OC担任化学敏感性的一个潜在因素。

4所示。讨论

OC使用异构的类别仍然是常见的妇科恶性肿瘤,严重威胁着女性的健康。进行性疾病,OC需要强大的生物标志物和模型预测结果和治疗靶点。基因测序技术的迅速发展,信使rna表达式的预后签名被作为一种方法来评估肿瘤恶化。然而,大多数这些模型传递mrna或gene-quantifying表达式(18- - - - - -20.]。在我们的研究中,第一次,我们使用的策略irPseus双结对,旨在建立一个可靠的签名10-pseudogene组合和不需要特定的假基因的表达水平。

首先,我们提取TCGA的伪基因表达矩阵和微分coexpression进行分析使用斯皮尔曼相关分析来确定DEirPseus和创建irPseus对使用相对表达命令矩阵的新方法。套索,第二,我们进行单变量分析和多变量Cox回归确定prognostic-related irPseus对。最后,我们评估了小说irPseus几个临床背景下签名,包括操作系统,临床因素,肿瘤浸润免疫细胞,与检查点相关分子和化学敏感性。

越来越多的证据表明,免疫系统起着至关重要的作用在恶性肿瘤起始,癌症恶化和癌症治疗的反应。免疫细胞已确认各种疾病过程有重要影响,包括癌症进展(21- - - - - -23]。到目前为止,免疫疗法在OC剩余的探索性阶段。然而,越来越多的在体外和在活的有机体内临床免疫疗法已被执行。我们进一步分析了免疫细胞的渗透水平两个子组的风险。已经证实,巨噬细胞是至关重要的免疫细胞密切参与炎症和肿瘤发生[24]。巨噬细胞渗透在各种肿瘤细胞肿瘤相关巨噬细胞,包括M1巨噬细胞抗肿瘤和肿瘤促进M2巨噬细胞(25]。此外,先前的研究已经证实,一个大型M1 / M2 TAM的比例密切相关OC病人延长操作系统(26]。M2巨噬细胞可以产生免疫抑制事件导致免疫逃避OC (27]。在我们的研究中,CD8 + T细胞,T细胞卵泡助手,CD4 + T细胞也表现出明显的两个风险组之间的差异。OC被称为免疫原性的癌症之一,通过针对免疫反应很好检查点(28]。验证,加入CTLA4抗体和保利ADP-ribose聚合酶抑制剂治疗BRCA1-deficient OC个人大大扩展操作系统由T细胞(29日]。中性粒细胞是特别是个体有关贫穷的生存在高档OC(人力资源:1.14 - -1.73)30.]。最近的一份报告显示,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞卵泡助手显然是参与OC生存(31日]。17转录factors-based预后签名显示B细胞、NK细胞和T细胞被证实两组之间是不同的,和个人的低风险组更cline免疫疗法和化疗反应包括依托泊苷、紫杉醇、veliparib。在这项研究中,我们发现一个低风险评分更高的一半IC密切相关₅₀依托泊苷和丝裂霉素。基于上述发现,irPseus参与模型在人类OC发挥至关重要的作用。

新算法用于这项研究有几个优势。首先,传统方法之前的研究仅集中在使用每个基因独立使用基因表达水平在不同的数据集需要扩展和适当的正常化,这提出了一个非常艰巨的挑战由于不同平台之间的潜在的生物学异质性。我们适应一个新的算法的识别功能之间的联系成对irPseus通过相对表达式序两种irPseus within-sample缺乏上述需求的需要。第二,截止的风险评分可以直接用于其他外部验证组,因为它计算了基于表达式的值(0或1)的成对irPseus由它们的相对权重系数。第三,我们的研究集中在确定预后成对irPseus而不是多个预后伪基因,和该算法可以确定预后irPseus对mRNA表达谱虽然有些假基因不显示重要的预后价值。然而,这项研究也有局限性。首先,我们的研究是基于大规模OC数据集在公共数据库和结论没有证实由外部独立的队列。第二,伪基因的功能构成irPseus对尚未得到证实,和未来的生物实验需要精致的OC中的可能功能机制。

总之,我们建立了一个新的10-irPseus OC模型,这是一个有前途的预后因子,可以作为预测患者的操作系统的重要生物标志物OC和帮助区分个体可能受益于化疗和免疫治疗。

数据可用性

在这项研究中使用的数据可以下载从TCGA (https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga),ImmPort (https://immport.niaid.nih.gov),HGNC数据库(https://www.genenames.org/)。

的利益冲突

没有利益冲突。

补充材料

图S1。的主要结果评估肿瘤浸润免疫细胞与irPseus两人签名。(补充材料)