文摘

Jisuikang (JSK)是一种草药配方组成的多种中药,已被证明是有效地促进患者的康复治疗脊髓损伤(SCI)后十多年的临床应用。然而,JSK促进神经再生的机制尚未阐明。本研究的目的是调查JSK保护神经元的影响,具体的规定是RhoA /岩石信号通路。大鼠的运动功能评估的BBB评分和斜板试验,高尔基染色和透射电子显微镜用于观察神经组织的微观结构,和荧光双标记法检测神经元细胞凋亡。在这项研究中,我们发现JSK可以改善大鼠的运动机能和SCI,保护组织(线粒体、内质网和树突棘)的神经元,并减少神经元的凋亡率与SCI大鼠。此外,JSK可以抑制勿动蛋白受体的表达(是)在神经元和是/ RhoA /岩石信号通路与SCI大鼠。这些结果表明JSK可以改善大鼠的运动机能SCI通过抑制是/ RhoA /岩石信号通路,这意味着潜在的适用性JSK神经再生剂。

1。介绍

脊髓损伤(SCI)是一种疾病,严重损害中枢神经系统,一个复杂的病理过程,在后期很难恢复。SCI的发病率逐年增加,因此,迫切需要找到一种治疗减少伤残率(1,2]。然而,中药已被越来越多的临床医师和学者关注,因为它的优点多目标和低的副作用。SCI的发病机制的核心是“缺乏肾州长,州长的瘀脉搏,和玩忽职守的基本命令。“JSK复合中医处方建立在这个理论的指导下,这是非常有效的临床治疗SCI (3,4]。

在中国,Buyang Huanwu煎煮,作为一个重要的代表性的草本配方科学的治疗,恢复神经功能,有几百年的历史5,6]。然而,机制Buyang Huanwu汤是不清楚,主要是有关硫氧还蛋白系统[7),谷氨酸8),营/ / RhoA分子信号通路(9),apoptosis-related蛋白(10)等。JSK是由加法和减法的Buyang Huanwu汤,这是符合当前科学的临床特征。大量临床试验后,JSK取得了满意的临床疗效,其机制的一部分已经被解释为动物和细胞实验(3,4,11- - - - - -14]。黄芪,丹参和川芎嗪的主要药理成分JSK和有重要的治疗效果。黄芪体内抗氧化和神经保护作用,它提供了改善SCI(的症状的可能性15- - - - - -17]。丹参有促进血液循环的影响18)、抗氧化、抗炎(19),神经保护(20.)等。川芎嗪可以保护SCI通过抑制炎性细胞因子(21),抑制细胞凋亡(22,23),和清除氧自由基24]。

SCI通常被认为是一个毁灭性的伤害,和中枢神经系统轴突的生长是有限的,所以它不能恢复。然而,Aguayo等人移植的一部分切断脊髓和周围神经组织发现中枢神经系统轴突的可以成长为移植的组织,这表明神经元可以生长在成人中枢神经系统受损,但这是有限的环境(25,26]。其他研究已经表明,中枢神经系统白质匀浆的局限性神经轴突的生长(27),少突胶质细胞和中枢神经系统的髓鞘可以诱导生长锥的崩溃(28]。这些抑制轴突生长的蛋白质被称为myelin-associated抑制剂(但是),其中主要包括神经突产物抑制剂(勿动蛋白),myelin-associated糖蛋白(MAG),和少突细胞髓鞘糖蛋白(OMgp) [29日]。勿动蛋白受体(是)能具体地绑定到上述三种但是和抑制轴突再生30.,的表达是直接关系到中枢神经细胞再生的能力31日),因此是被认为是促进轴突再生的重要目标之一。此外,是/ RhoA /岩石信号通路抑制神经元轴突的再生是一个重要的方法。因此,在这项研究中,发展的是/ RhoA /摇滚信号通路与SCI大鼠在不同时期和JSK的干预效果进行了研究探索改善SCI的机制的一部分。

2。方法和材料

2.1。化学物质

强的松(天津化工公司、天津、中国)在盐溶液溶解并稀释(最终浓度是0.3%),戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂有限公司),和多聚甲醛(南京炉窑生物技术有限公司);JSK是由鉴别(30克)、当归(12 g),红牡丹根(12 g),蚯蚓(10克),肉苁蓉(10克),丹参(10克),四川独活草粉末(10克),桃仁(10克),红花(10克),等等。(制药、南京中医药大学附属医院)。JSK(药材1.25 g / mL)是由沸腾,蒸汽沸腾,浓度。

2.2。动物

在这项研究中使用的动物来自南京中医药大学动物实验中心,和动物伦理委员会批准的研究计划是南京中医药大学的附属医院。实验过程遵循美国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验动物(实验动物资源研究所1996)。八十名女性SD大鼠体重180∼200 g Qinglongshan动物饲养农场买来的南京,和实验动物许可证号码是SYXK(超自然)2018 - 0049。老鼠一直被囚禁在动物实验研究所南京中医药大学(中国南京)吃的和喝的自由控制温度和湿度。

2.3。SCI大鼠模型

基于改进的艾伦急性SCI模型方法(32]。简而言之,所有的老鼠都麻醉与1%戊巴比妥钠腹腔内(50毫克/公斤)。脊髓的段T9-11暴露手术,脊髓段T10是受脊髓打击乐器设备(RWD公司)。飞碟的重量和直径是10 g和2.5毫米,分别和下降的高度和深度是10厘米和2毫米,分别。大鼠后肢的张力是立即消除,表明模型建立成功。虚假的组脊髓暴露,但没有受伤。老鼠被随机分为四组:虚假的集团(胃内的注入生理盐水,20毫升/公斤/ d)、模型组(胃内的注入生理盐水,20毫升/公斤/ d),强的松(PED)组(胃内的注入强的松,60毫克/公斤/天),和JSK集团(与JSK胃内的注入,25 g / kg / d)。老鼠被杀死后干预,采集标本的7日,14日,21岁圣受伤后,28天。

2.4。低音部,比蒂和Bresnahan (BBB)得分

根据下肢运动的观察,特别是步态和协调,BBB的测试进行了开放的领域。通过双盲和double-independent观察,所有组评估在7日,14日,21岁圣术后,28天(33]。

2.5。斜板试验

斜板进行测试老鼠术前一日,7日,14日,21岁圣操作后,28天。老鼠被放置在一个矩形斜板的垂直于纵轴斜板。斜板取消,老鼠的最大角度记录在黑板上待了超过5秒。每个老鼠测试3次,平均值作为最终结果。

2.6。高尔基染色法

脊髓是固定在4%聚甲醛溶液和清洗后切成2 - 3毫米厚的组织块。脑组织块完全沉浸在高尔基染色法解决方案和治疗14天没有光。被删除后,在4°C脱水15%蔗糖溶液和脱水1天的情况下避免光和脱水在30%蔗糖溶液2天。这是浸在浓氨水为45分钟,蒸馏水为1分钟,修复解决方案治疗45分钟,和蒸馏水清洗1分钟。这是30%的蔗糖溶液脱水2 - 3天,切成100μ冰冻切片,盖章甘油明胶。显微镜检查和图像采集。

2.7。利用透射电子显微镜观察

脊髓被移除后,与电子显微镜固定固定解决方案在4°C 2 - 4小时,1%锇酸清洗20°C 2小时。组织依次进入50% -70% -80% -90% -95% -100% -100%酒精- 100%丙酮- 100%丙酮,每次15分钟。丙酮:812包埋剂= 1:1被渗透了2 - 4小时;丙酮:812包埋剂= 2:1是在一夜之间弥漫,和纯812嵌入剂渗透5 - 8小时,然后在37°C烤箱隔夜和聚合60°C 48小时。被切割成60 - 80 nm的超薄切片和双重染色,铀和铅,和切片干燥室温过夜。这些照片是收集和分析在透射电子显微镜下。

2.8。TUNEL和NeuN荧光双标记方法

冻结部分脊髓和4%多聚甲醛固定15分钟,洗两次PBS。0.5% tritonx - 100添加到在室温下培养5分钟。添加了5%胎牛血清在室温下2小时;NeuN第一抗体1:1000添加和孵化一夜之间在4°C和洗3次。荧光二次抗体Alexa萤石594添加和孵化在室温和隐藏的光1小时。根据TUNEL试剂盒的指示,适量的检测解决方案添加顺序和洗3次孵化后37°C 1小时。板块与antifluorescence淬火密封解决方案和荧光倒置显微镜下观察到。

2.9。荧光双标记方法NeuN和是

冻结的部分脊髓和4%多聚甲醛固定15分钟,洋溢着0.5% triton - 100 10分钟,洗和PBS为3次。5%山羊血清添加在室温下60分钟。第一抗体NeuN(1: 300),是(1:300)是添加和孵化一夜之间在4°C。594年第二抗体Alexa萤石和Alexa萤石488添加和孵化1小时。后Dapi旨在遏制公款吃喝,盘子荧光倒置显微镜下观察。

2.10。免疫组织化学

石蜡切片脱蜡后的水,幻灯片是沉浸在柠檬酸抗原修复缓冲区,开水抗原修复。他们被转移到3%过氧化氢溶液在室温和孵化了25分钟。3% BSA滴在室温下的组织均匀30分钟。第一抗体滴和孵化一夜之间在4°C。HRP-labeled二级抗体滴,在室温下孵化为60分钟。干燥后,切片与民建联显色溶液滴,然后苏木精旨在遏制公款吃喝,其次是盐酸酒精分化,氨水回到蓝色,用自来水冲洗。片在梯度酒精脱水、透明和二甲苯,盘子在显微镜下观察。

2.11。免疫印迹分析

脊髓的蛋白质被BCA法提取并量化。添加缓冲之后,蛋白质是煮10分钟,储存在−20°C进行测试。准备胶水后,电泳是由100 V为90分钟,恒压和PVDF膜用100 V为60分钟。5%脱脂奶粉添加了在室温下2小时,GAPDH是,RhoA,和岩石抗体准备根据1的比例:1000和孵化一夜之间在4°C。第二天,第二抗体制备根据1的比例:10000和孵化在室温下2小时。发射极耦合逻辑开发人员添加,凝胶成像系统的开发,ImageJ图像分析系统被用来分析乐队。

2.12。中存在

脊髓的RNA提取与RNAiso RNA(豆类、日本),然后反向转录与豆类逆转录装备和冻结在−20°C。序列被发现在基因库,在上海Shenggong设计并合成引物。GAPDH和是被qPCR使用豆类结核病绿色TM预混料交货Taq TM II PCR试剂盒(豆类、日本)。

2.13。统计分析

SPSS 20.0软件被用于统计分析。数据显示为平均数±标准差。单向方差分析和SNK-q测试被用来分析组间的差异。这些数据被GraphPad棱镜8.0.2编辑软件。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。JSK促进运动功能的恢复与SCI大鼠

BBB评分和斜板试验进行了术前一日,7日,14日,21岁圣操作后,28天。SCI的老鼠显示运动机能的逐渐复苏,尽管JSK可能逐渐加速的过程,效果类似于PED(图1)。上述结果表明,JSK对待SCI的潜力。

(一)
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图1
JSK和PED促进运动功能的恢复与SCI大鼠。(一)斜板试验表明,大鼠的运动能力下降SCI后,和运动机能的恢复使用JSK和PED后加速。第三周,JSK的促进作用是明显不同于模型组。(b) BBB评分显示,大鼠的运动能力下降SCI后,和运动机能的恢复可以使用JSK和PED后加速。在第三和第四个星期,JSK的促进作用是明显不同于模型组。数据被当作平均数±标准差;n= 3 /组, ,和 。
3.2。JSK可以改善神经元的微观结构与SCI大鼠

透射电子显微镜的结果表明,显微组织的脊髓神经元髓鞘和SCI后被毁。JSK可以缓解SCI后髓鞘和神经元的损伤,和7 d-28 d,它逐渐改善(图2)。高尔基染色结果表明,SCI后,树突被毁,成了短,长度和树突棘的数量减少。JSK可以缓解SCI后树突和树突棘的伤害,和7 d-28 d的形态逐渐改善(图3)。上述结果表明,JSK可以改善神经元的组织(线粒体、内质网、树突棘,等等)与SCI大鼠。


图2
JSK改善神经元的微观结构与SCI大鼠。虚假的组脊髓髓鞘是常规的形状,像同心圆形排列,它有一个完整的结构。神经元是椭圆形,有完整的细胞膜结构,丰富的细胞器,线粒体和粗面内质网,没有明显的破裂,线粒体嵴的或删除,7点和形态学d-28 d基本上是相同的。模型组脊髓髓鞘的形状是不规则的,结构无序和不完整,部分破损或缺失,当地的卷发,和皱纹。神经元和线粒体的数量减少,线粒体有解散的一部分,线粒体嵴断裂和删除,小7日变化形态d-28 d。脊髓的髓鞘形成JSK组和强的松组改善,形状更普通,结构更加完整,神经元和线粒体的数量更多,d-28 7 d的形态与模型组相比大大提高了。请注意。红色箭头指示的髓鞘和绿色箭头表明线粒体。
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(c)
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图3
JSK改善神经元的树突形态与SCI大鼠。虚假的组(a),脊髓树突的形态是定期完成,和长,树突棘排列整齐,紧凑,7点众多,形态d-28 d基本上是相同的。模型组脊髓树突的形态不规则,部分丢失,短,和树突棘是无序的排列稀疏,数量少,7 d-28 d的形态变化不多。强的松组和JSK集团提高了脊髓树突的形态,形状更普通,结构更加完整,长度长,树突棘排列整齐,密度更均匀,数量更多,d-28 7 d的形态逐渐改善。((b) (c))的长度树突和树突棘的数量每组进行了统计分析。树突虚假的组的长度最长,树突棘的数量最多,而模型组是最短的,树突棘的数量是最少的。与虚假的组相比,树突长度和树突棘的数量模型组明显减少,和树突长度和树突棘的数量JSK组与模型组相比显著增加。请注意。红色箭头表示树突棘,平均数±标准差的数据提出了;n= 3 /组, ,和 。
3.3。JSK可以减少神经元的凋亡率与SCI大鼠

TUNEL和NeuN的双标记结果表明,神经元的凋亡率增加了SCI后,虽然JSK SCI后能减少神经元的凋亡率,并逐步改善之间7 d-28 d(图4)。

(一)
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图4
JSK能减少神经元的凋亡率与SCI大鼠。(一)代表的图像Tunel和NeuN双标记的结果。(b)的统计分析结果表明,神经元的凋亡率增加SCI后老鼠但JSK干预后下降。与假组相比,模型组神经元的细胞凋亡率显著增加。与模型组相比,JSK可以显著降低神经元的凋亡率。数据被当作平均数±标准差;n= 3 /组, ,和 。
3.4。JSK可以抑制神经元的表达是有科学的老鼠

NeuN双标记的结果,是显示的表达是在SCI后神经元增加,但JSK可能减少的表达是在SCI后神经元。28日,JSK显著抑制的表达是在神经元(图5)。

(一)
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(b)
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图5
JSK能减少神经元的表达是有科学的老鼠。(一)代表NeuN和是双标记的图像结果。(b)的统计分析结果表明,神经元的表达是SCI后增加老鼠但JSK干预后下降。与假组相比,模型组的表达是显著增加,与模型组相比,JSK可以显著降低是在神经元的表达。数据被当作平均数±标准差;n= 3 /组, ,和 。
3.5。JSK可以抑制的表达的是/ RhoA /摇滚的受伤部位有SCI的老鼠

免疫组织化学显示的表达是在SCI后老鼠的受伤部位增加了,但JSK可以减少受伤部位的表达是有科学的老鼠。免疫印迹和存在表明,表达的是/ RhoA /岩石在SCI后老鼠的受伤部位增加了,但JSK可能减少的表达的是/ RhoA /摇滚的受伤部位有SCI的老鼠。28天,JSK显著抑制的表达是RhoA /岩石受伤部位的脊髓(图6)。

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(我)
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图6
JSK可以减少的表达是在受伤部位与SCI大鼠。(一)免疫组织化学的形象代表。(b)免疫组织化学统计显示,28天,表达的是受伤部位的脊髓JSK干预后增加而减少。与假组相比,模型组的表达是显著增加,与模型组相比,JSK可以显著减少的表达的是。(c)代表免疫印迹结果的图像。((d)、(e)、(f) (g), (h)和(i))免疫印迹和存在的统计结果表明,28天,表达的是/ RhoA /岩石受伤部位的脊髓JSK干预后增加而减少。与虚假的组相比,表达的是/ RhoA /岩石模型组明显增加,与模型组相比,JSK可以显著减少的表达是RhoA /岩石。注意:模型组,b是强的松组,c是强的松组和d是虚假的。数据被当作平均数±标准差;n= 3 /组, ,和 。

4所示。讨论

据估计,SCI在美国的发病率约为每年每百万人口54例新病例。尽管SCI患者的平均寿命大大增加了在过去的几十年里,由于人口老龄化,病例数可能继续增加,其严重并发症可以导致更高的经济负担34]。然而,很少有有效的科学的治疗方法,和主要的治疗仍然是甲基强的松龙,稍微提高了临床结果。因此,人们迫切需要找到一个更有效的方法,科学的治疗。SCI属于中枢神经系统损伤,其自我修复能力很差,但是它维持神经组织重构的能力和轴突的可塑性。其相关的内源性修复机制主要是神经元和神经胶质细胞的性质,特别是当地的细胞外环境,特定的病变引起的炎症过程(34]。当前的科学研究方向主要包括中和myelin-derived抑制剂(例如,anti-Nogo-antibodies [35]),下游抑制相关的细胞内信号通路(Rho-GTPase信号[36]),降解胶质疤痕的抑制剂(CSPG降解酶(37- - - - - -39]),神经信号通路(mTOR / PTEN [40]),和移植的神经祖细胞和干细胞41]。

是是一种GPI-anchored蛋白表达在中枢神经系统的神经元和轴突31日,42]。它介导的抑制效应三种但是通过形成一个受体复杂的我,但是43]。是特别但是结合时,它被我传染给RhoA然后作用于效应岩石单元中完成信号传输的身体,导致生长锥的崩溃和抑制轴突再生(44- - - - - -46]。RhoA的激活被认为是一个关键步骤,但是发挥抑制作用在轴突再生。干预RhoA灭活剂C3转移酶体内削弱了但是在轴突生长的抑制作用47]。此外,Y27632治疗,竞争对手的岩石合成ATP,仍然可以促进神经轴突生长的但是[48,49]。是/ RhoA /岩石信号通路抑制神经元轴突的再生是一个重要的方法,并且是这个途径的关键。的发展是/ RhoA /摇滚信号通路在不同时期科学应研究。

在这个实验中,运动机能和表达的是/ RhoA /岩石与SCI大鼠进行了研究。与模型组相比,28天,BBB评分和斜板试验表明,JSK可以促进大鼠运动功能的恢复与SCI,高尔基染色,透射电子显微镜建议JSK可以提高神经元的组织(线粒体、内质网、树突棘,等等)与SCI大鼠。双标记的TUNEL和NeuN表明JSK可以减少神经元的凋亡率与SCI大鼠,NeuN双标记法,是表明JSK可以抑制神经元的表达是与SCI大鼠;免疫组织化学、免疫印迹和存在都表明JSK可以抑制的表达是RhoA /岩石在SCI大鼠的受伤部位(图7)。


图7
Jisuikang,中国草药配方,促进脊髓损伤的修复大鼠通过调节是/ RhoA /岩石信号通路。

总之,表达的是脊髓受伤部位的显著增加和保持在一个较高的水平在SCI后7天。然而,28日当天,表达的是PED / RhoA /岩石组和JSK组明显低于模型组,和JSK可以显著抑制的表达是RhoA /岩石在受伤部位,促进神经再生。这个结果基本上是一致的结果郭et al。14,50]。JSK可以有效地抑制的表达是在科学领域,块myelin-derived神经再生的作用抑制剂和RhoA /岩石,提高轴突再生的微环境,促进科学的修复。此外,值得注意的是,基本上与SCI大鼠运动功能的恢复持续28天前,和JSK可以加速这一过程。的表达是在一定程度上减少,但结果表明,中间部分的表达是突然增加,这可能是由于这一事实是不仅Nogo-A的受体,但也杂志和OMgp的受体,而杂志和Nogo-A OMgp可能被激活,从而增加是的表达。同时,表达的是可能会增加由于其他神经信号通路的调节,所以multipathway的机制需要进一步研究。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本文支持由中国国家自然科学基金(81704100,81704100,81973885),江苏大学的“清局域网项目”资助项目(苏老师[2018]12号),和项目优先资助的学术程序开发江苏高等教育机构(中西医整合)[2018]87。