电针刺激在Zusanli (ST36)维修卡哈尔间质细胞和移植c - kit表达与SCI-Induced老鼠神经源性肠功能障碍

文摘

背景。电针刺激(EA)可以改善大鼠结肠运输活动与神经源性肠功能障碍(NBD)引起的脊髓损伤(SCI)。卡哈尔间质细胞的功能(可以)和c - kit表达在这一过程中可能发挥重要作用。材料和方法。三十六岁的雄性sd大鼠中被随机分配到虚假的组,SCI集团或SCI + EA组(双边Zusanli, 30分钟/天,14天)。超微结构的形态学的变化可以被观察到。c - kit表达不同层次分析了免疫组织化学、免疫印迹和RT-qPCR分别。结果。异常形态的差别,可以对这些基因c - kit表达SCI后发生。同时可以被数的增加,超微结构的形态学在EA老鼠明显改善。他们也显示出更好的改善c - kit表达蛋白和基因水平。结论。异常可以在结肠组织和表达下调表达的c - kit SCI后可以观察到。EA在Zusanli (ST36)可以通过修复改善结肠功能形态学和增加的数量可以移植,c - kit表达。

1。介绍

神经源性肠功能障碍(NBD)是一个术语,是指结肠功能紊乱引起的中枢神经系统(CNS)疾病或伤害(1]。它发生在几乎所有慢性脊髓损伤(SCI)患者(2]。他们患有功能性障碍、便秘、大便失禁,腹痛,或它们的组合3]。超过40%的SCI患者抱怨NBD严重影响他们的生活质量(4,5),因为它不仅加剧了身体状况,也会导致心理问题,实施限制他们参与日常生活活动和威胁他们的隐私和尊严4,5]。

因此,肠功能的管理队伍在SCI患者最优先考虑的1]。各种治疗干预措施已经申请了NBD管理(3),包括多种形式的电刺激(6]。EA,作为一种方便、可重复和less-lesion干预,通常用于治疗在临床试验和实验室实验(7]。传统中医理论与现代的结合神经调节理论让EA更可接受的比传统的针灸。Zusanli (ST36)是最常用的穴位之一,预防和治疗胃肠道功能紊乱。尽管大量的研究报道的效果和机理,EA胃肠功能障碍(8- - - - - -12)或其他并发症的SCI(如神经源性膀胱功能障碍)13- - - - - -15),EA的质量和数量研究SCI-induced NBD相对不足。一些研究支持EA NBD病人或动物模型的影响。临床试验证明,EA是有效管理NBD通过减少肠道护理的负担和SCI患者的大便失禁16]。我们先前的研究发现,EA ST36可能增加SCI大鼠的结肠推进运动(17,18]。然而,NBD EA的机制仍不清楚。

结肠的能动性和结肠运输延迟下降的主要机制是NBD SCI后(19]。卡哈尔间质细胞(可以有一个函数在调节胃肠蠕动通过生成和传播慢波以及肠神经系统之间的信号转导(ENS)和平滑肌细胞(20.]。研究表明,国际刑事法庭人口的减少可能会导致慢传输型便秘(21,22]。临床组织学在荷兰进行的研究证实,脊柱裂或SCI患者经历了一个可以和神经元的损失在肌间神经丛,与控制患者相比无胃肠蠕动障碍(23]。可以表达的原癌基因c - kit编码酪氨酸激酶受体(c - kit)。通常,c - kit是识别的标志可以(24]。一些研究发现c - kit与发展密切相关,分化,和功能的维护可以在肠道25,26]。此外,一些胃肠蠕动障碍与损耗的c-Kit-positive可以(27,28],c - kit蛋白的表达可能导致的功能恢复可以(29日]。研究报道,EA Zusanli可促进结肠运动(30.,31日),增加的表达可以在部分肠梗阻32]。然而,这种现象的潜在机制还没有研究。因此,本研究旨在探讨EA SCI后治疗排便功能障碍的可能机制。

2。材料和方法

2.1。动物和分组

36个女adult-specific无菌的雄性sd大鼠中采用中英Sippr / BK实验室动物有限公司(上海,中国)被用于这项研究。所有的动物都是标准化的实验室条件下的光暗周期(12:12)。环境温度保持在21和25°C,和相对湿度设置为50 - 55%。他们是美联储自适应十天免费的水和食物,直到体重达到300±20 g。

24老鼠选择随机的SCI模型建立,剩下的十二大鼠接受虚假的操作。只有成功的SCI模型包含在进一步的实验,然后随机分配到SCI集团或SCI + EA组。动物收到虚假手术包括虚假的组作为对照。

所有的实验进行了针灸和江苏省重点实验室被批准的安全评价研究中心在南京中医药大学。

2.2。SCI建模和虚假的手术

SCI模型大鼠建立了重锤法。硫酸阿托品(0.05毫克/公斤,南卡罗来纳州)被用来抑制气管分泌物。十五分钟后,麻醉诱导与戊巴比妥钠(50毫克/公斤,i.p)。动物然后被安装在手术台上的卧姿。中间背侧切口进行从T10 T13后皮肤准备。T11的椎板和棘突和病人接触,然后被椎板切除术窗口暴露脊髓。脊髓挫伤使用纽约大学撞击器,可以提供一滴十克罗伯从60毫米的高度。硬膜下出血之后,抽搐后四肢和尾巴鞭打后立即可以观察到伤口。手术切口在清创后缝合。

对动物接受虚假的操作,手术切口缝合后切除棘突和椎板从T11到病人没有任何损伤脊髓。

所有的动物都被修改访问Basso-Beattie-Bresnahan运动规模(mBBB、表S2)[33)前和手术后24小时来判断和评估建模是否成功。每次评估是由两个独立评估员。所有的动物执行任何操作之前得到21分。SCI建模手术后24小时,老鼠得到0分将被视为成功的模型。动物收到虚假手术被包含在进一步的实验只有得到21分术后24小时。

2.3。术后护理

所有的老鼠接受腹腔内注射庆大霉素(5000 U /公斤)每天从操作。腹部、会阴和SCI大鼠后肢的打扫每12 h后的“机动进行协助排尿。被动运动进行干预前后肢每天。

2.4。电针刺激(EA)

EA干预从手术后的第二天开始一旦老鼠视为成功的模型。动物科学+ EA组安装在一个操作平台在仰卧位治疗表。干预的穴位选择双边Zusanli点(ST36), 5毫米低于腓骨头和1毫米外侧胫骨(前面的34]。与碘载体局部消毒后,针灸针(华佗,0.2513毫米;苏州医疗器械厂有限公司、江苏、中国)是垂直地插入的深度5毫米。然后,针与一个华佗电针刺激器(SDZ-II;苏州医疗器械厂有限公司、江苏、中国)与马disperse-dense波的电流强度1 - 2和3 Hz / 15赫兹的频率。刺激强度仅限于可容忍的范围内,老鼠可以自由发声,和微妙的针可以观察到的振动。同时,虚假的动物组和SCI组安装在相同的方法只是没有EA。所有的干预措施在11点开始,持续了30分钟,每天一次,14天。

2.5。组织准备

干预2周后,大鼠禁食24 h被深麻醉下颈椎脱位牺牲。1厘米的近端结肠(1厘米低于盲肠)移除所有的动物为随后的考试。超微结构的形态学,近端结肠组织浸在5%戊二醛在4°C 2 h后消除粘膜然后后缀在1%锇酸4°C 2 h在2%醋酸双氧铀染色。与一系列分级的乙醇脱水后在4°C,标本与甲苯胺蓝染色。然后,他们被切片semithin部分以70 - 80 nm厚使用超微切片机(德国徕卡RM2145)。免疫组织化学分析,5μ米厚片的近端结肠组织被削减4% paraformaldehyde-fixed,石蜡嵌入块进行进一步处理。RT-qPCR分析和免疫印迹,近端结肠组织解剖的粘膜都沉浸在液态氮,然后储存在−80°C。

2.6。超微结构的形态学

应用透射电子显微镜(TEM)观察结肠可以超微结构的变化。透射电子显微镜下观察组织标本(jem - 1010;JEOL有限公司、日本)在4000 x 25000 x放大,分别。超微结构的图像可以被搜索和被研究人员对分组也不清楚。

2.7。免疫组织化学(包含IHC)

IHC检测c-Kit-positive执行可以在近端结肠组织。近端结肠组织的石蜡切片是放置在一个60°C烤箱2 h。然后,他们与二甲苯脱蜡、水化通过一系列分级的乙醇。抗原是检索后煮柠檬酸缓冲内源性过氧化物酶的活性被0.30%的H₂O₂。然后,样品片被封锁5%牛血清白蛋白在室温下一个小时。片与兔子孵化anti-rat c - kit multiclonal抗体(1:100;圣克鲁斯生物技术公司,美国)在一夜之间在4°C。后洗了三次磷酸盐(PBS),样品片二次抗体孵育(1:500;南非广播公司kit-SA1022;武汉博士德生物技术有限公司,中国),后来streptavidin-biotin复杂(南非广播公司)系统。之后,样品切片在PBS孵化后3洗,3-diaminobenzidine (DAB)。最后,样本切片与苏木精复染色。染色标本成像使用光学显微镜(日本奥林巴斯)400放大,和c-Kit-positive可以被量化检测十随机选择从每个片大功率领域。 The average optical density (AOD) of positively stained areas, which is used to measure the staining intensity, was analyzed by the JD801 morphological microimage analysis system (Nanjing Jieda Company, Jiangsu, China).

2.8。西方墨点法(WB)

世行是用于分析结肠c - kit蛋白的表达水平。冷冻样本的近端结肠组织中均质里帕裂解缓冲(南京Vazyme生物技术有限公司、江苏、中国)手持均质器。匀浆离心机在10000×在4°C 5分钟。只有上层清液收集为进一步使用。上层清液中蛋白质的浓度是由bicinchoninic量化的酸(BCA)方法。接下来,蛋白质样本煮在十二烷基硫酸钠(SDS)加载缓冲区为5分钟。然后,样品被加载到一个8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质分离后,他们转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,潜伏在5%的脱脂牛奶在室温下2 h阻止非特异性结合位点。之后,膜被孵化anti-c-Kit抗体(1:200;圣克鲁斯生物技术公司,美国)和微管蛋白(1:5000;南京Vazyme生物科技有限公司、江苏、中国在4°C)在一个旋转平台。接下来,PVDF膜与PBS洗四次孵化前后二次抗体(1:5000; one hour at room temperature). A chemiluminescence imaging system (ChemiScope3500; ClinX Science Instruments Co. Ltd., Shanghai, China) was used to scan the immunoblots (FigureS1)。免疫反应性的蛋白带的灰度值归一化微管蛋白表达和分析化学分析系统(凝胶分析V2.02;表S1)。

2.9。RT-qPCR

RT-qPCR应用于测量结肠c - kit蛋白mRNA的表达水平。细胞溶解的总RNA分离近端结肠组织利用RNA隔离器总RNA提取试剂(R401-01;南京Vazyme生物科技有限公司、江苏、中国)。RNA浓度和完整性进行了分析通过测量紫外吸光度比值在260 nm / 280海里。总RNA是reverse-transcribed cDNA HiScriptQ RT SuperMix (R213;南京Vazyme生物科技有限公司、江苏、中国)。绿色的AceQ®qPCR SYBR主混合(南京Vazyme生物技术有限公司、江苏、中国)是用于RT-qPCR互补脱氧核糖核酸。c - kit引物(转发:CCTCGCCTCCAAGAACTGTATT;相反:GCCGTGCATTTCCTTTTACC)设计并合成了Vazyme生物科技有限公司(中国南京)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)被视为一个内部控制(转发:GAGTCCACTGGCGTCTTCA; reverse: GGGGTGCTAAGCAGTTGGT). The StepOne Plus system (Applied Biosystems, USA) was used for the amplification reaction, and the conditions of thermal cycling were 95°C for 5 min in the start cycle, 95°C for 10 s, and 60°C for 30 s in 40 subsequent cycles. Data were analyzed with the 2^−ΔΔCt方法。

2.10。统计分析

美国IBM SPSS 20.0()被用来做所有的统计分析。数据报告为意味着±标准差(其中)。单向方差分析进行分析组间的差异。两两比较,LSD的测试将在同方差的方差时,使用和Dunnett T3的考验将是应用异方差的变化时。统计学意义(p值)设置小于0.05。

3所示。结果

3.1。SCI大鼠模型的建立

根据mBBB规模,所有大鼠手术之前拿下21分。24的36个老鼠收到了修改后的落锤的建模手术方法,和他们两个死于建模操作。剩下的22个老鼠,BBB规模术后24小时0分,被视为成功建立了SCI模型然后被随机分配到SCI + EA组或SCI组。十二大鼠接受虚假的手术,2人被排除在外,因为他们有一个减少mBBB得分,这说明部分损伤的脊髓。不同群体的粪便特点和排便条件是前面描述的17,18]。

3.2。形态学的EA之前可以修好

透射电子显微镜下观察,细胞的结肠可以是通常与一个细长fusiform-shaped核假组(图1(一)左面板)。分散在细胞核染色质浓缩,扩展细胞质包围。细胞质中含有丰富的线粒体、核糖体,内质网,高尔基体(图1(一)右面板)。

可以的形态学损害结肠SCI后发生。细胞体和细胞核的形状不规则(图1 (b)左面板)。液泡,细胞器减少,结构异常也观察到细胞质内。线粒体肿胀,溶解,甚至破裂,有液泡的。脂滴观察扩张和脱粒内质网(图1 (b)右面板)。

然而,我们发现的形态学病变结肠EA治疗后可以被修复。看来,结肠的形状可以细胞体和核更类似于那些虚假的组(图1 (c)左面板)。虽然有一些包含在细胞质液泡,细胞器的结构相对完整。略有增加,线粒体和内质网扩张(图1 (c)右面板)。总的来说,上述结果表明,EA可以挽救的形态学结肠SCI后可以。

3.3。c - kit免疫反应性的ICC数量增加了EA

如图2(一),c - kit排斥性的密度有明显差异可以在三组。与虚假的组相比,质量的c-Kit-positive SCI后可以大幅减少。虽然EA治疗后,结肠c - kit反弹的表达虚假的组相同的水平。的定量分析c-Kit-positive细胞数量和大气气溶胶(数据进一步证实了上述结果2(b)和2(c))。SCI组显示更少数量的c - kit免疫反应性的细胞(100.38±7.75和182.92±9.74, )和较低的大气气溶胶(0.20±0.02与0.24±0.02, )比虚假的组。然而,EA治疗造成的衰落SCI逆转。c - kit免疫反应性的细胞的数量(187.702±6.76和100.38±7.75, )和大气气溶胶(0.28±0.02 vs.0.20±0.02)显著增加在SCI + EA组。

3.4。c - kit mRNA和蛋白表达水平增加了EA

结肠c - kit mRNA和蛋白表达的结果证实了我们发现免疫组织化学。c - kit蛋白(数字的表达水平3(一)和3(b))和mRNA(图3(c))在结肠癌组织中不同的群体之一。c - kit的mRNA表达和蛋白质含量在SCI大鼠明显低于假老鼠(蛋白质:0.04±0.02和0.13±0.05, ;信使rna: 0.006±0.001和0.010±0.002, )。EA治疗后,信使rna表达和c - kit在结肠组织中蛋白质含量明显增加,而SCI大鼠(蛋白质:0.25±0.07和0.04±0.02, ;信使rna: 0.014±0.002和0.006±0.001, )。

4所示。讨论

我们先前的研究发现,EA可以改善大鼠的肠功能和SCI-induced NBD揭示背后的部分底层机制干预(17,18]。我们发现,EA可以改善SCI的粪便特点和缩短排便时间老鼠。研究还表明,EA可以调节昼夜节律性的肠道蠕动和表达下调神经元一氧化氮合酶的表达在结肠癌组织中。在这个研究中,我们探索了EA的潜在机制可以从其效果的角度。结果显示,EA可以改善结肠功能修复SCI后形态和数量可以移植,c - kit表达。

可以是各种类型的间质细胞包含在胃肠道平滑肌。在生理条件下,可以是富含线粒体;中等发达的内膜系统包括内质网和高尔基氏复合体。可以发挥重要作用在推动和维护胃肠道平滑肌的正常功能,可以将导致的损失或重建肠道蠕动功能障碍(35]。起搏细胞,可以可以生成并进行慢波,这是基本的节段收缩和消化道的蠕动20.]。研究发现慢波活动记录从野生型、杂合子小鼠不能检测到从W / WV突变小鼠缺乏可以在小肠肌36,37]。类似的结果存在于Ws / Ws变异老鼠。可以在结肠的肌肉Ws / Ws变异老鼠不完全丢失,和电活动显示了一个不规则的模式和更低的频率比发生在野生动物(38]。可以提供一个途径传播的慢波的平滑肌细胞不能再生慢波。一些研究发现慢波发生在结肠的健康组织不能传播到的区域可以是功能失调(39,40]。如我们之前所述的研究(17,18],老鼠经历了SCI T11-12水平显示展出干和硬凳子上,减少粪便重量,和排便时间延长,结肠运输障碍的结果。结肠传输功能可以改善由EA治疗后。我们的实验表明,上述结肠与可以关联函数的变化。超微结构损伤与SCI可以可以观察到动物,后来那些伤势EA治疗后修复。

除了可以作为识别标志,c - kit在国际刑事法院的功能起着至关重要的作用。c - kit的重要性及其配体出现的变异动物,如W / WV老鼠,Ws / Ws老鼠和Sl /老鼠奉养。在那些动物,ICC人口和减少损失的起搏器活动观察(37,41,42]。类似的结果可以发现在动物处理c - kit抗体(24,40,43]。在这项研究中,我们还发现c - kit表达的差别,对这些基因在SCI大鼠结肠组织和EA的抢救效果。

肠道功能是由中枢神经系统和ENS. double-innervated虽然存在可能与中枢神经系统调节肠道蠕动时连接是完全切断44),实体的活动下降由于中枢神经系统的调制通过交感神经和副交感神经45]。例如,我们以前的研究表明,一氧化氮合酶的浓度(nNOS),可以合成一氧化氮作为主要抑制性神经递质运动神经元,显著增加在SCI大鼠的结肠(17]。大量证据表明肠运动神经元直接刺激活动可以。神经递质释放可能导致的功能障碍可以的形态变化和功能障碍45]。可以可以促进肠道运动神经元之间的通信和平滑肌细胞转导兴奋和抑制性输入。研究发现可以导致的损失减少平滑肌的兴奋和抑制性势W / WV小鼠肠功能的情况下运动神经元和平滑肌细胞本身是正常的46,47]。另一方面,许多研究致力于EA如何调节胃肠功能的机制。结果表明,EA可以调节兴奋和抑制的存在48),和高频EA穴位ST36可能诱发肠神经元的再生49]。在我们之前的研究中,EA ST36可以下调nNOS表达式在大鼠的结肠17]。也发现,EA能够影响胃肠蠕动通过调节自主神经活动的外在(增强迷走神经活动和抑制交感神经活动)50- - - - - -52]。

基于这些研究,到目前为止,有一个可能的假设SCI-induced NBD和EA的治疗机制。SCI后,实体的活动减少,导致更少的信号可以然后导致可以的超微结构的损伤和功能障碍,最终导致退化的结肠平滑肌的蠕动。EA激活周围神经,传输信号在骶副交感神经段,促进ENS.实体活动的活动导致的功能恢复可以受肠运动神经元支配,最后导致结肠运输功能的检索。需要更多的实验来证实建议的机制。

5。结论

异常可以和c - kit SCI后可以观察到的表达下调表达,这可能是NBD的原因之一。EA在Zusanli (ST36)可以改善结肠功能SCI后,及其对修复的形态和数量的影响可以和移植c - kit表达可能是一个潜在的机制。进一步的研究是必要揭示背后的深层机制障碍和干预。

数据可用性

所有的数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

洁具杨和杰程的贡献同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81860875号,81202735,81403477,和20168291)和研究为江苏省大学生创新计划(Nos。cxzz13 - 0617和sjzz15 - 0121)。

补充材料

原始数据的免疫印迹(图S1,表S1)和修改Basso-Beattie-Bresnahan运动规模(表S2)。(补充材料)

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