文摘
的目标是。本研究的目的是评估Er的保护作用苗族圣(EMS)和骨骨髓来源树突状细胞的调节功能(BMDCs)在大鼠佐剂关节炎(AA)。方法。EMS的乙酸乙酯部分(3克/公斤,1.5克/公斤,和0.75 g / kg)是口头管理从免疫后15天29。多发性关节炎指数和测量爪肿胀,踝关节病变观察使用hematoxylin-eosin(他)染色,脾脏和胸腺指数测定。此外,T细胞和B细胞增殖测定使用CCK-8化验。costimulatory BMDC表面分子和炎症因子的表达测定使用流式细胞仪和ELISA试剂盒,分别。结果。与AA模型大鼠相比,EMS的乙酸乙酯分数明显减少爪肿胀(从1.0到0.7)和多发性关节炎指数(从12 - 9) 和改进组织病理学的严重程度 。EMS的治疗使用乙酸乙酯分数显著降低脾和胸腺指数 和抑制T细胞和B细胞增殖 。此外,EMS显著BMDCs调制costimulatory表面分子的表达,包括CD40、CD80、CD86和主要组织相容性复合体II级(mhc II) 。结果还显示,EMS的乙酸乙酯部分显著抑制促炎细胞因子的水平白介素- 23 (IL)肿瘤坏死因子(TNF)α和炎症因子前列腺素(PG) E2 BMDCs的上层清液中。然而,抗炎细胞因子il - 10的水平明显增加 。结论。这些结果表明,乙酸乙酯部分EMS对AA大鼠具有更好的保护作用,可能通过调节BMDCs的功能和调节细胞因子的平衡。
1。介绍
类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病,其特征是关节滑膜炎症和软骨损伤(1]。纤维母细胞的异常增殖RA滑膜细胞是一个典型的特点,这是与over-activated免疫细胞,如t细胞、b细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dc)。大量的渗透DCs是高度参与RA患者的滑膜和关节炎的发生疾病的出现。
DCs是专门的抗原递呈细胞(apc),可以将流程、提呈抗原,并启动T-cell-mediated免疫反应(2]。DCs高度表达表面costimulatory分子,包括CD40、CD80、CD86,和mhc ii抗原t细胞。成熟的dc能有效激活初始T细胞,这是起始的中心,管理和维护的免疫反应3]。先前的研究已经证实了发病率和RA与DCs的发展。RA患者的滑膜dc分泌趋化因子和吸引炎性免疫细胞包括巨噬细胞和中性粒细胞单核细胞(4,5]。与健康对照组相比,促炎细胞因子(il - 1的浓度β、il - 6和IL-23)和炎症因素(PGE2)在RA患者增加了6,7]。这是RA发病机制的关键因素之一。
Er苗族圣(EMS)是一种传统的中药处方,这是来自《丹xi鑫fa》。它由Phellodendri皮层和Atractylodis根茎。我们以前报道,EMS的乙酸乙酯部分可以显著降低病变,有疗效adjuvant-induced关节炎(AA)大鼠(8]。然而,免疫机制的目标EMS的乙酸乙酯部分尚不清楚。本研究的目的是探讨antiarthritis EMS的机制,其潜在的分子机制是否与DCs的功能调节有关。
2。材料和方法
2.1。动物
雄性sd大鼠中(男,180±20 g)从动物部门购买安徽医科大学,中国。老鼠适应标准实验室条件下(温度控制下12°C和h光明和12 h黑暗时期)和每天饲料标准饲料和水实验。所有的实验都是实验动物伦理委员会批准安徽中医药大学(身份证号码:202005)。
2.2。试剂
Phellodendri皮层和Atractylodis根茎从安徽购买草药件有限公司,有限公司(BoZou,安徽省,中国)。从上海得到石油醚SuYi化学试剂有限公司,有限公司乙酸乙酯从江苏强生收购功能化工有限公司,有限公司甲氨蝶呤(MTX)获得欣医药有限公司(上海,中国)。FITC-CD40、PE-CD80 PE-CD86, PE-MHC-II获得eBioscience, Inc .(美国CA)。罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) -1640年中期和胎牛血清(的边后卫)从Hyclone获得。肿瘤坏死因子-α、il - 10和PGE2得到的酶联免疫试剂盒(多科学生物技术有限公司),和IL-23得到的酶联免疫试剂盒(Cusabio生物技术,有限公司)。
2.3。制备乙酸乙酯的EMS的一部分
等量的Atractylodis根茎和Phellodendri皮层是混合和粉碎。混合物是三次用沸水煮1.5,1.0,和0.5 h,悬架是通过蒸发浓缩在水浴的温度大约60°C。暂停集中到500 - 800毫升和提取石油醚的等效体积的五倍。EMS是丢弃的石油醚部分并提取五次相同体积的乙酸乙酯。的乙酸乙酯部分EMS集中到一定浓度(0.3 g / mL, 0.15 g / mL,和0.075 g / mL)(计算使用天然药)。
2.4。AA模型的感应和治疗
SD大鼠AA模型构造,如前所述[9]。卡介苗(BCG) (80°C, h)与液体石蜡充分混合,这是完全弗氏佐剂(CFA, 10毫克/毫升)。大鼠AA模型注射0.1毫升的CFA在左后足底,和正常组被注射0.1毫升的同等体积的生理盐水。免疫接种后15天,老鼠被随机分为以下组:正常组,AA模型组,EMS (3 g /公斤,1.5克/公斤,0.75克/公斤),和MTX(0.5毫克/公斤)。EMS管理通过填喂法为14天(每天一次),并通过填喂法MTX组管理每3天总共五次(10]。同时,正常和AA模型组口头管理同等体积的羧甲基纤维素水溶液(10毫升/公斤)。
2.5。评价关节炎
所有大鼠体重记录每周使用一个电子秤。正确的后爪体积测量用容积式流量计(pv - 200,成都科技市场有限公司有限公司)在免疫(基本价值,天0)和免疫后14天,17日,20日,23日,26日和29日。多发性关节炎指数评分从0点至16点,如前面描述的那样:0,没有肿胀一般;1、红斑和踝关节轻微肿胀;2、红斑和轻微的肿胀的踝关节跖趾或荚膜联合;3、红斑和温和的肿胀的脚踝荚膜或跖趾关节;4、红斑和严重肿胀的脚踝跖趾关节(11]。
2.6。组织病理学检查的脚踝关节
老鼠是第一次免疫后牺牲了29天。右脚踝关节周围的软组织,如肌肉和肌腱,被移除。脚踝关节得到和固定在10%福尔马林溶液。此外,脚踝组织脱钙5%硝酸之前被嵌入到石蜡。石蜡切片(5毫米厚)是沾染了他。脚踝的变化被两个盲观察员组织病理学评价。脚踝关节的关节炎的严重程度分级,从0到4,根据炎症细胞浸润,滑膜增生,血管翳形成,骨侵蚀。
2.7。脾脏和胸腺指数
老鼠是第一次免疫后牺牲了29天。食物是疏散前12 h。脾脏和胸腺组织从身体中取出,称重,并记录。脾脏和胸腺指数计算脾脏和胸腺老鼠身体的比例(毫克/克)。
2.8。T淋巴球增生
河鼠脾脏和胸腺组织无菌移除,地面使用120尼龙布料,传播1640年RPMI补充10%的边后卫的密度1×106个细胞/ mL,播种到乘96孔板(1×105细胞/)。此外,T -和b细胞分别刺激5 mg / L伴刀豆球蛋白(Con)(σ)或4 mg / L脂多糖(LPS)(σ)和培养48 h。两个小时结束前文化,CCK-8 (10μL)被添加到每个。吸光度是阅读在使用标450海里(EJ301热费希尔科学)。
2.9。BMDCs文化
股骨和胫骨被移除在无菌的环境中,和两端的松果体被切断了暴露骨髓腔。骨髓腔冲洗rpmi - 1640介质和过滤使用200目尼龙布料。细胞,培养RPMI 1640年补充10%的边后卫1×106个细胞/毫升的密度在正常情况下(37°C和5%的公司2)。文化的不依从细胞24小时后被删除,和新鲜培养基,包括人类的集落刺激因子(gm - csf)和il - 4,在20 ng / mL的浓度,是补充道。培养基是改变每两天,补充了足够的细胞因子。直到第七天BMDCs被培养。
2.10。流式细胞术
BMDCs收获和洗1毫升的磷酸盐(PBS)。细胞悬浊液准备使用传统方法,和100年μL荧光标记的单克隆抗体、CD40-FITC CD80-PE, CD86-PE, MHC-II-PE,添加,紧随其后的是潜伏在黑暗中30分钟在室温(20 - 25°C)。离心后,1毫升的PBS缓冲溶液无菌添加洗细胞。最后,细胞进行流式细胞术(FC500,美国贝克曼库尔特公司),和CD40的百分比,CD80、CD86和mhc ii BMDCs使用软件进行了分析。
2.11。ELISA
的上层清液BMDCs使用离心后获得文化7天(8分钟,2000 rpm),冻结在−80°C,直到检测。PGE2的水平(EK8103-01) IL-23 (CSB-E08462r)、肿瘤坏死因子-α(EK3823-01)和il - 10 (EK3101-01) BMDCs使用ELISA试剂盒检测,根据制造商的指示。吸光度是阅读在450海里。
2.12。统计分析
数据均值±SD。单向方差分析(方差分析)使用SPSS软件是用于定义之间的显著差异控制和药物组。一个 95%置信区间被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。EMS的乙酸乙酯部分的影响在AA大鼠的临床指标
爪肿胀和多发性关节炎指数被定义评估的严重性关节炎和药物的抗炎作用。根据图1,继发性炎症反应出现在14 - 17天,而天20左右,和AA大鼠的体重增加缓慢,与正常大鼠相比明显减少 。28天,EMS的乙酸乙酯部分治疗大鼠的体重增加,这与模型组相比,变化得更快。无显著差异在观察体重EMS和MTX组管理期间(表1)。与AA模型组相比,EMS的乙酸乙酯部分治疗不仅影响改善AA大鼠(图的爪子1(一)),明显抑制爪肿胀(从1.0到0.7),但也显著降低多发性关节炎指数(从12 - 9), (数据1 (b)和1 (c))。这一结果表明,乙酸乙酯部分EMS治疗是有效和安全的使用AA大鼠。
(一)
(b)
(c)
3.2。EMS的乙酸乙酯部分的影响在AA大鼠踝关节病理学
组织病理学分析被认为是一个伟大的临床症状指数。定义的乙酸乙酯部分EMS的有效性,其antiarthritis使用组织学分析的影响进行了分析。如图2模型组表达了严重的关节炎症状,被许多炎症细胞和滑膜组织渗透,伴随着滑膜增生,骨侵蚀和破坏(与正常组相比, )。结果表明,EMS (3 g / kg)和MTX(0.5毫克/公斤)中所有这些组织学严重性评分明显下降(与模型组相比, )。EMS(0.75克/公斤,1.5克/公斤)也从组织学损害保护组织 。结果表明,乙酸乙酯部分EMS在AA大鼠有保护作用。
(一)
(b)
3.3。EMS的乙酸乙酯部分的影响在AA大鼠脾脏和胸腺指数
脾脏和胸腺指数、身体器官变化的迹象,同时炎症的发展。如图3,与正常组相比,模型大鼠脾脏和胸腺指数明显增加 。EMS (3 g / kg)和MTX(0.5毫克/公斤)显著降低脾和胸腺指数,相比AA组 。EMS在0.75和1.5 g / kg胸腺指数降低, (图3 (b)),1.5克/公斤,显著降低脾脏指数相比AA组( ;图3(一个))。这些结果表明,EMS可以抑制AA大鼠脾脏和胸腺指数。
(一)
(b)
3.4。EMS的乙酸乙酯部分的影响在AA大鼠T和b细胞增殖
T - b细胞参与人类免疫力。T和b细胞的生存能力是决定使用CCK-8化验(bestbio生物)。如图4,与正常组相比,T -和b细胞增殖增加模型组。此外,EMS (1.5 g / kg, 3 g / kg)和MTX(0.5毫克/公斤)中减少欺诈A-induced早期增殖和LPS-induced淋巴球增生(与模型组相比, )。此外,EMS (0.75 g / kg)有效地抑制t淋巴球增生(与模型组相比, )(图4(一))。此外,EMS的乙酸乙酯部分应该调节T - b细胞功能通过抑制他们的生存能力。
(一)
(b)
3.5。EMS的乙酸乙酯部分的影响在BMDCs Costimulatory表面分子的表达
众所周知,DCs在抗原呈递专业,这在自身免疫性疾病的发病中扮演不可或缺的角色。确定EMS BMDC成熟和活化的影响,CD40, CD80、CD86和mhc ii使用流式细胞术在DCs发现了。的形态学观察BMDCs使用一个倒置显微镜(motic AE2000LED)(图5(一个))。如图5,流式细胞术结果显示的表达CD40, CD80、CD86和mhc ii调节模型组(正常组相比, )。EMS (3 g / kg)治疗明显抑制CD80的表达,CD86和mhc ii 。此外,EMS (0.75 g / kg)减少CD86的表达与AA大鼠 。此外,EMS (1.5 g / kg)和MTX(0.5毫克/公斤)中隐含的表达CD40, CD80、CD86和mhc ii BMDCs与AA大鼠。的乙酸乙酯部分EMS治疗抑制AA大鼠的影响BMDCs剂量依赖性的方式。这些结果表明,AA大鼠的EMS抑制BMDC成熟。
(一)
(b)
(c)
3.6。EMS的乙酸乙酯部分的影响BMDCs上层清液在AA大鼠细胞因子
与类风湿性关节炎的发展,细胞内炎症因素已经发生了变化。评估的能力的乙酸乙酯部分EMS BMDCs调节细胞因子的生产,促炎细胞因子(TNF -α和IL-23),炎症因素(PGE2)和抗炎细胞因子(il - 10) BMDCs的上层清液中检测到。如图6与正常组相比,肿瘤坏死因子-的浓度α,PGE2, IL-23 BMDCs增加模型的上层清液组 。相比之下,模型组的il - 10的浓度显著下降 (图6(d))。EMS(0.75、1.5和3 g / kg)或简称MTX(0.5毫克/公斤)显著抑制促炎细胞因子(TNF -的浓度α和IL-23)和炎症因子(PGE2)(与模型组相比, )。此外,抗炎细胞因子(il - 10)水平增加剂量依赖性的方式在EMS治疗 。这些结果表明,EMS抑制BMDC分泌炎症因子的函数。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
先前的研究已经表明,EMS水提取物对AA大鼠的疗效,明显减少了病理指标和爪肿胀与关节炎大鼠(12]。为了进一步研究有效antiarthritis EMS的部分地区,这些都是使用不同的有机溶剂提取,如二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿和石油醚。二氯甲烷和乙酸乙酯在EMS治疗的两个部分,一个有效的对AA大鼠的影响(8]。通过综合评价关节炎的指标,EMS的乙酸乙酯部分可能是一种有效的抗炎作用。在这项研究中,水溶液的EMS与石油醚提取,直接与乙酸乙酯提取。因此,我们得到了EMS的乙酸乙酯部分。EMS的乙酸乙酯部分(0.75、1.5和3 g / kg)是AA大鼠的管理。结果表明,乙酸乙酯部分EMS治疗明显减少爪肿胀(图1 (b))和多发性关节炎指数(图1 (c)),改善组织严重程度评分(图2),这是符合我们之前的研究(8]。然而,药效学的结果提供了基础和激励我们继续探索在EMS antiarthritis乙酸乙酯治疗的机制。此外,小檗碱和atractylodin从EMS发现乙酸乙酯部分在之前的研究中使用高效液相色谱法(8]。小檗碱在AA大鼠有积极的作用,减少促炎细胞因子(il - 1的浓度β、il - 6和IL-17)和增加抗炎细胞因子(il - 10和TGF -的浓度β)[13,14]。此外,小檗碱和atractylodin可以保护胶原诱导关节炎大鼠通过调节直流功能通过抑制成熟或促进细胞凋亡15,16]。因此,我们推测,EMS的antiarthritis效应可能是由于DC成熟的监管。
我们发现,EMS的乙酸乙酯部分明显降低脾脏指数和胸腺指数(图3)和抑制T -和b细胞(图的扩散4)。据报道,细胞毒性T-lymphocyte-associated antigen-4 (CTLA-4)块APC和t细胞之间的相互作用,作用方式是结合CD80和CD86受体在APC,防止表面CD28 t淋巴球[17]。这种蛋白质受体被发现在自身免疫性疾病中起关键作用通过阻断b细胞之间的相互作用,APC, t细胞。建议这一事实EMS的乙酸乙酯部分缓解关节炎可能与T和b细胞的抑制作用。据报道,DCs专业抗原呈递,在自身免疫性疾病的发病起着不可或缺的作用。成熟的DCs高度表达表面刺激分子,如CD40、CD80、CD86和mhc ii。作为重要指标来识别DCs,流式细胞仪可以准确、快速检测的表达CD40, CD80、CD86和mhc ii表面。确定的影响EMS BMDC成熟,CD40, CD80、CD86,并用流式细胞术在DCs发现了mhc ii。结果表明CD40的表达,CD80、CD86和mhc ii是调节AA大鼠。EMS治疗明显抑制的表达CD40, CD80、CD86和mhc ii BMDCs与AA大鼠。因此,乙酸乙酯部分EMS antiarthritis机制可能与抑制BMDC成熟。
il - 6叫阻塞和il - 1阻滞剂anakinra也被用于治疗类风湿性关节炎(18,19]。DCs诱导t细胞分化成Th1和Th17细胞分泌il - 12和IL-23加剧RA疾病(20.,21]。il - 10起着至关重要的作用在调节Treg细胞分化的影响,提高Treg TH17细胞抑制减轻关节炎症的程度在AA小鼠22,23]。同时,我们发现,EMS的乙酸乙酯部分有效减少促炎细胞因子TNF -的浓度α(图6(一))和IL-23(图6(c))和增加抗炎细胞因子il - 10的水平(图6(d))。PGE2是一个重要的花生四烯酸代谢物,在免疫反应中扮演一个重要的监管作用。PGE2的滑膜关节痛患者检测到(24]。据报道,PGE2参与前列腺素的表达E4和核因子kappa-B DCs,上调营水平蛋白质诱导IL-23亚基p19 DCs (25,26]。我们发现,PGE2的上层清液的浓度BMDCs增加AA大鼠。EMS治疗显著地抑制PGE2的浓度(图6(b))。因此,减轻炎症机制通过抑制BMDCs的表达可能与多种信号通路。这可能提供证据研究机制RA的DCs的有效途径。在未来的研究中,我们将关注EMS治疗的具体行动的机制抑制DC的功能及其与参与的分子信号的关系。
5。结论
这些结果表明,乙酸乙酯部分EMS对AA大鼠具有更好的保护作用,可能通过调节BMDCs的成熟和调节细胞因子的平衡。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者没有利益冲突的声明。
作者的贡献
XYJ和NW设计并执行实验和修订后的手稿。托拉斯设计并进行实验和写的手稿。ZHX,毫升,MLL进行实验。所有作者阅读和批准了手稿。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(81603362)和中国安徽省自然科学基金(1708085 qc77)。