甘草酸通过调节HMGB1/TLR4通路改善小鼠放射性肠炎

摘要

放射性肠炎是腹部和盆腔恶性肿瘤放疗常见的副反应，可导致患者放疗耐受性降低和生活质量下降。甘草酸苷(glycyrrhizin, GL)具有明显的抗炎活性。然而，对其在放射性肠炎中的抗炎作用知之甚少。在本研究中，我们旨在研究GL对放射性肠炎的潜在抗炎作用，并阐明可能的潜在分子机制。采用6.5 Gy腹部x线照射C57BL/6小鼠，建立放射性肠炎模型。采用苏木精和伊红染色分析空肠的病理变化。TNF-的表达α用免疫化学方法分析。炎症细胞因子的水平，如TNF-α、il - 6、il - 1β，血清中HMGB1用酶联免疫吸附法测定。采用d -木糖吸收法测定肠道吸收能力。western blotting和免疫荧光染色分析HMGB1和TLR4水平。我们发现，GL显著减轻了肠道损伤，降低了炎症细胞因子的水平，如TNF-α、il - 6、il - 1β，和HMGB1水平。此外，GL处理显著下调HMGB1/TLR4信号通路。综上所述，这些结果提示GL通过抑制肠道损伤和炎症反应以及HMGB1/TLR4信号通路对放射性肠炎具有保护作用。因此，GL有可能成为治疗放射性肠炎的潜在药物。

1.介绍

放射治疗是治疗腹腔、盆腔恶性肿瘤的有效方法之一[1，2］.然而，这是一把双刃剑。虽然腹部照射的目标是恶性组织，但邻近的健康器官也会受到很大的影响，特别是涉及小肠上皮细胞的快速更新器官[3.，4］.小肠被认为是腹部对辐射最敏感的组织之一。瞬时辐射暴露后，立即产生ROS和NOS [5- - - - - -7，会导致严重的细胞损伤，包括DNA损伤和细胞内细胞因子的释放[8，9］.辐射诱导的DNA损伤可作为损伤相关分子模式(DAMP)刺激炎症反应，以及腹部辐射暴露介导的肠上皮屏障破坏，最终导致辐射肠炎[5，9- - - - - -11］.

高机动组框1 (HMGB1)蛋白是一个潮湿的家族的重要成员,也就是从细胞核转移到细胞质和释放到细胞外环境,以应对细胞压力,伤害,和死亡,从而作为一个重要的内源性危险信号和一个至关重要的促炎介质12，13］.当HMGB1与toll样受体4 (TLR4)或晚期糖基化终末产物受体(RAGE)结合时，会触发炎症反应，然后激活细胞因子的释放，导致进一步的组织损伤[14］.作为炎症的早期介质，HMGB1与包括脓毒症在内的多种炎症性疾病有关[15]、关节炎及肺炎[16，17]，提示HMGB1可能是一种很有前景的炎症性疾病的治疗靶点[18］.

TLR4属于toll样受体(toll-like receptor, TLRs)家族，识别外源性病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)和内源性DAMPs [19］.TLR4存在于多种组织中，包括大脑[20.]、心肌和小肠[21］.一旦TLR4识别出受损组织释放的HMGB1，就会产生细胞因子，如IL-6、TNF-α,il - 1β被激活以放大炎症级联[22，23］.最近有报道称HMGB1/TLR4通路加重了结肠炎肠道黏膜的破坏[24］.然而，HMGB1/TLR4通路在放射性肠炎中的作用尚未被研究。

甘草酸苷(Glycyrrhizin, GL)，主要活性成分Glycyrrhizaglabra，具有多种药理作用，包括抗炎作用[25，26]，抗氧化、抗肿瘤和保肝作用[27］.许多研究已经证明GL是HMGB1的有效抑制剂[28，29］.在日本临床上，GL已被广泛用于慢性肝炎的治疗[30.］.然而，目前尚无关于其对放射性肠炎的影响的研究。因此，在本研究中，我们研究了GL是否可以通过调节HMGB1/TLR4通路来改善放射性肠炎。

2.材料和方法

2．1．动物

从南方医科大学实验动物中心获得40只特异性无病原体的雄性C57BL/6小鼠(体重18-22 g, 8周龄)(证号:SYXK Guangdong 2016-0167)。小鼠适应标准的实验室条件:24±2℃，55-60%的湿度和12小时的光/暗周期。所有动物实验均严格按照国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并经南方医科大学实验动物伦理委员会批准。

2．2．甘草甜素治疗

甘草酸(纯度≥98.0%)购自MedChemExpress(中国上海)。所有化合物均溶于含10% DMSO的生理盐水中。将40只小鼠随机分为5组，即对照组、模型组、GL低剂量组(5 mg/kg/d, i.p.)、GL中剂量组(10 mg/kg/d, i.p.)和GL高剂量组(20 mg/kg/d, i.p.)，每组8只。小鼠使用MultiRad (MultiRad 225, Faxitron, USA)辐照仪，单剂量6.5 Gy腹部x射线照射，剂量率为0.99 Gy/min。为了限制骨髓对辐射的暴露，小鼠的头部、胸部和四肢用铅条遮挡。对照组小鼠采用假照射。照射前2小时，治疗组小鼠给予不同剂量的GL (5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg)预处理。在照射后2小时内，小鼠连续3天接受先前剂量的GL腹腔注射。每天监测各组小鼠体重。

２．３．组织病理学检查和免疫化学

照射后3.5 d处死小鼠进行组织病理学检查。收集空肠，4%多聚甲醛固定48小时，石蜡包埋。部分被切成4μm厚度，用于苏木精伊红(H&E)染色。免疫化学分析，石蜡切片在柠檬酸钠中煮沸以修复抗原。然后用3% H灭活内源过氧化物酶₂O₂溶液10分钟。PBS冲洗三次后，切片用TBST中的5%脱脂奶粉密封2小时，然后与5%脱脂奶粉稀释的一抗在4℃下孵育过夜。免疫化学中使用的一种抗体是抗TNF-的抗体α(兔子，1:25 0,Abcam)。PBS冲洗三次后，切片与生物素化的山羊抗兔二抗在室温下孵育2小时。然后DAB染色5-10分钟，苏木精反染色。使用光学显微镜(Olympus IX53;奥林巴斯、日本)。

２.４.用酶联免疫吸附法(ELISA)分析血清

血清TNF-浓度α、il - 6、il - 1β和HMGB1的测定采用商品化ELISA试剂盒(R&D Systems)，并根据制造商说明书采用协议。

2．5．D-Xylose吸收试验

小鼠口服5% w/v的d -木糖溶液(100μL/小鼠)。d -木糖给药2h后处死小鼠，肝素化血管采血。然后50μ取L血清样品加入5 mL间苯三酚显色剂中，水浴加热至100℃4 min。平衡至室温后，用554 nm的分光光度计测量d -木糖吸收。

2.6。免疫印迹分析

各组空肠用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液(Thermo Fisher Scientific, USA)进行裂解。用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific, USA)测定总蛋白浓度。将等量的总蛋白装入孔中，用SDS-PAGE进行分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脱脂奶粉在TBST中室温封闭膜1小时，用一抗在4°C孵育过夜。在TBST中洗涤三次后，用标记有辣根过氧化物酶(1:20 00)的山羊抗兔二抗在4℃下孵育2小时。免疫反应蛋白检测采用ECL试剂(Thermo Fisher Scientific, USA)。western blotting使用的一抗如下:抗HMGB1 (Rabbit, 1: 1000, Abcam)、TLR4 (Rabbit, 1: 500, Abcam)和GAPDH (Rabbit, 1: 1000, Cell Signaling Technology)抗体。GAPDH作为内部参考，然后使用ImageJ (NIH)软件进行定量分析。

2.7。免疫荧光分析

小鼠处死后，收集空肠，在4%多聚甲醛中固定48 h，然后在30%蔗糖溶液中固定72 h。空肠被切成8块μ切片用0.1% Triton X-100在PBS中浸润30分钟，然后与含5%脱脂奶粉的封闭液室温孵育2小时。在切片中加入一抗，在4°C孵育过夜。一抗选用HMGB1 (Rabbit, 1:25 0, Abcam)和TLR4 (Rabbit, 1:10 0, Abcam)。PBS洗涤后，用抗兔二抗室温孵育1 h。使用了以下二抗:山羊抗兔Alexa Fluor 488标记IgG (1:50 00, Life Technologies)和山羊抗兔Alexa Fluor 594标记IgG (1:50 00, Life Technologies)。然后用DAPI复染5分钟。用PBS冲洗两次后，用荧光安装介质(Solarbio)和盖玻片覆盖切片。最后，在荧光显微镜下观察切片(Olympus, Tokyo, Japan)。

2.8。统计分析

使用GraphPad Prism软件进行统计分析。5.0 GraphPad软件，圣地亚哥，美国)。数据分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，然后采用Tukey的多重比较检验，显示为平均值±SEM。数据代表了三个独立的实验。 被认为是具有统计学意义的差异。

3.结果

３．１．甘草酸增加放射性肠炎C57BL/6小鼠体重

为了研究GL对放射性肠炎的抗炎作用，我们建立了总剂量为6.5 Gy x射线照射的放射性肠炎小鼠模型。照射前后2小时，给予小鼠不同剂量的GL (5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg)连续3天(图)1(一))．数字1 (b)显示各组在3.5天内的体重变化。患有放射性肠炎的小鼠在第2天体重显著下降(图)1 (b)．与模型组相比，GL (5 mg/kg)处理小鼠在第3.5天体重减轻(图)1 (b)．

３．２．甘草酸缓解空肠病理

h & e染色空肠病理检查显示，照射后空肠形态迅速改变，表现为肠上皮完整性丧失，绒毛剥落，黏膜肌层变薄。有趣的是，给药20 mg/kg GL的小鼠表现出相对保存良好的组织结构和较少的肠上皮损伤(图)2(一个))．空肠H&E染色显示，与对照组相比，腹腔照射小鼠的绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度和隐窝计数明显降低(图)2 (b)- - - - - -2 (d)．与模型小鼠相比，20 mg/kg GL组C57BL/6小鼠绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度和隐窝计数增加(图)2 (b)- - - - - -2 (d)．

３．３．甘草酸下调促炎细胞因子水平

探讨GL的抗炎作用、TNF-的表达α通过免疫化学和炎症细胞因子，如TNF-的水平α、il - 6、il - 1β、血清中HMGB1的检测采用ELISA试剂盒。免疫化学结果显示，GL可抑制TNF-的表达α在空肠(图3(一个))．此外，血清中细胞因子TNF-的水平α、il - 6、il - 1β，模型小鼠中HMGB1明显升高(图)3 (b)．然而，20 mg/kg的GL治疗显著降低了炎症细胞因子TNF-的水平α和HMGB1在放射性肠炎小鼠中的作用(图3 (b)．此外，GL可抑制IL-6和IL-1的水平β以剂量依赖的方式(图3 (b)．提示GL在放射性肠炎中具有明显的抗炎作用。

3．4．甘草酸改善肠道吸收

以d -木糖溶液喂养小鼠，以评估辐射暴露后肠道的吸收能力。因为d -木糖在体内、血清中不代谢D-木糖水平能很好地反映肠道吸收能力。模型组照射3.5天后d -木糖水平显著降低。相反，有一个增加的水平D-木糖给药20 mg/kg GL小鼠(图4)．

3．5．甘草酸对放射性肠炎小鼠HMGB1/TLR4通路的抑制作用

因为GL在放射性肠炎中表现出明显的抗炎作用(图3.)，我们进一步通过western blotting分析和免疫荧光分析评估GL对HMGB1/TLR4通路的影响，已知HMGB1/TLR4通路在各种炎症性疾病中起着至关重要的作用。模型组中HMGB1、TLR4表达升高(图)5)．有趣的是，western blotting结果显示，GL处理显著降低了放射性肠炎C57BL/6小鼠中HMGB1和TLR4的表达，其中20 mg/kg GL处理最有效地降低了HMGB1和TLR4的表达(图)5)．这些结果与肠道免疫荧光染色结果一致。免疫荧光染色显示GL下调放射性肠炎中HMGB1和TLR4的表达(图)5 (c)和5 (d))．此外，结果显示HMGB1的分泌在绒毛的顶端(图)5 (c))．

4.讨论

放疗是治疗腹部和盆腔恶性肿瘤的有效方法之一。然而，放射性肠炎不仅降低了患者的生活质量，而且降低了患者对放疗的耐受性[31，32］.由于缺乏预防和治疗放射性肠炎特别有效的药物，迫切需要新的药物。有报道称，GL可缓解炎症反应，并被用作多种炎症性疾病的治疗药物，如脑缺血/再灌注引起的炎症和关节炎[33］.因此，在本研究中，我们评估了GL对放射性肠炎的潜在抗炎作用。

采用6.5 Gy腹部x线照射小鼠，建立放射性肠炎模型。当小肠暴露在照射下时，炎症反应立即被激活，随后产生细胞因子。近期研究发现，肠上皮细胞是HMGB1的主要来源，参与多种炎症反应[34，35］.众所周知，TNF-α和IL-6在各种炎症反应中产生。在本研究中，给药GL可显著降低TNF-的表达α以及TNF-的水平α、il - 6、il - 1β，血清中HMGB1。这说明GL在放射性肠炎中具有抗炎活性，这与小鼠结肠炎和脓毒症的研究结果一致[36，37］.此外，GL处理提高了辐照后血清的绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度、隐窝计数以及d -木糖水平，说明GL对辐照引起的肠道损伤具有保护作用。然而，由于在本研究中小鼠受到的是亚致死剂量的辐射，它们很少在3.5天内死于严重的胃肠综合征。因此，本研究缺乏对GL对小鼠生存的影响的探索，提示要研究GL对小鼠生存的影响需要较高的辐射剂量。

HMGB1作为DAMPs的主要成员，在免疫或炎症反应中发挥着重要作用。一旦HMGB1与TLR4结合，炎症反应被激活，随后诱导细胞因子的表达。因此，抑制HMGB1/TLR4通路具有潜在的抗炎作用[18］.此外，之前的一些研究表明，GL显著下调HMGB1/TLR4通路[38- - - - - -40］.因此，我们在实验中评估了HMGB1和TLR4的表达水平。在我们的研究中，模型组HMGB1/TLR4通路上调，给药GL显著抑制HMGB1/TLR4通路。这些结果表明，GL可通过调节HMGB1/TLR4通路保护空肠免受放射性肠炎的侵袭。此外，肠上皮细胞可产生瓜氨酸，瓜氨酸被认为是TLR4信号的负调控因子，是辐射诱导肠损伤的敏感生物标志物[41，42］.提示GL对放射性肠炎的保护作用可能与瓜氨酸的调节有关。同时，我们发现放射性肠炎中HMGB1的分泌是极化的，并释放到绒毛的顶端而不是基底外侧环境。这可能是由于作为HMGB1的关键受体的TLR4位于肠上皮细胞的顶端表面[43］.

此外，必须指出的是，本文提出的这项初步研究缺乏对介导放射性肠炎的其他重要因素的探索，如辐照暴露后肠道上皮屏障的破坏和紧密连接[12，44］.此外，辐照暴露不仅是促炎信号[5，45]，但也介导氧化和硝化应激，诱导小肠内ROS和NOS的产生[7，9，46，47］.此外，在最近的一项研究中，GL被报道具有抗氧化特性[48］.因此，GL除了具有抗炎作用外，还可能通过改善氧化应激来保护空肠免受辐射损伤，这一研究有待进一步研究。据报道，高水平的HMGB1促进癌细胞的迁移、侵袭和自噬，而GL抑制了这一过程[49，50提示GL可能具有抗肿瘤作用，并可能提高放疗治疗肿瘤的疗效。

5.结论

综上所述，我们的研究结果表明，GL通过下调促炎细胞因子水平发挥抗炎作用，减轻放射性肠炎小鼠肠道损伤，并同时下调HMGB1/TLR4通路。因此，GL可能是一种很有前途的治疗放射性肠炎的药物。虽然目前的研究已经显示GL治疗后放射性肠炎和HMGB1/TLR4信号通路发生了初步变化，但仍需进一步研究阐明其潜在机制。此外，研究表明，GL对放疗后肠道损伤有保护作用，但GL治疗对放疗治疗肿瘤疗效的影响有待评估。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

高磊和朱玲玲对实验的设计做出了很大贡献。张晓敏，胡晓，欧金英，陈珊珊，聂令辉参与体内实验并进行数据分析。手稿由张晓敏撰写。所有作者阅读并批准了手稿。

致谢

本研究由国家自然科学基金(no . 81573706和no . 81973583)资助。

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