基于NF的肝正弦内皮细胞FeneStrae对肝窦胸腺细胞的影响κ..B信号通路

抽象的

客观的．研究莪术醇对肝窦内皮细胞(LSECs)的影响，并分析其抗肝纤维化的作用机制。方法．通过MTT测定检测药物干预对细胞增殖率的影响。nf-的表达κ..B通过RT-PCR和WB检测。该NF-κ..免疫荧光法检测B的表达及进入细胞核情况;用扫描电镜观察LSECs窗的变化。结果．MTT结果表明，细胞增殖的各组的干扰很小。RT-PCR表明，NF-的表达κ..姜黄素干预组B明显低于阳性对照组( ）.WB检测发现，在Curcumol干预组中，PNF的表达κ..乙方在NF-κ..B信号通路显着低于阳性对照组（ ）.扫描电子显微镜表明，与阳性对照组相比，LSEC Fenestrae显着提高。结论．Curcumol可以通过抑制NF-的活性来成为抗肝纤维化的机制之一κ..B信号通路和增加lsec的窗孔。

1.介绍

肝纤维化是慢性肝病的常见结果和主要特征在于细胞外基质（ECM）的沉积广泛[1］．炎症、慢性病毒性肝炎和肝损伤被认为是肝纤维化的主要原因。肝损伤导致肝窦窗功能丧失，肝窦血栓形成可促进肝纤维化[2］．肝窦状内皮细胞(LSECs)在肝纤维化的发生发展中起重要作用[3.］．lsec是肝窦壁的主要边界成分，具有窗孔，细胞间连接疏松，但内皮下无基底膜。肝窦壁的结构有利于调节肝细胞与肝窦血之间的物质交换。lsec还具有活跃的内吞功能，在调节肝脏微循环和分泌细胞外基质方面发挥重要作用。在肝纤维化的早期，lsec显示窗缺失和下内皮基底膜形成。这种现象称为肝窦毛细血管化，是肝纤维化形成过程中的一种基本病理改变[4.-6.］．

NF-κ..B是一种至关重要的炎症转录因子，触发炎性细胞因子的大规模释放，例如IL-6，TNF-α.，和il-8 [7.］．NF-κ..B增强肝脏的炎症反应，形成“炎症瀑布”，最终导致肝纤维化的形成。研究发现，肝星状细胞（HSC）胶原蛋白表达与NF-相关联κ..b，抑制nf-κ..B的表达和活性，可显著抑制胶原蛋白的表达[8.］．据报道,NF -κ..b具有抗曝光效果，以及一些细胞凋亡刺激激活NF-κ..B.活性NF-κ..B块肿瘤坏死因子-α.介导细胞凋亡(9.］．作为纤维化因子，NF-κ..B增强肝脏炎症，参与调节LSEC的增殖和凋亡，并促进胶原蛋白合成和分泌。eNOS-No-CGMP信号通路是调节LSEC中的FeneStra的形成的重要途径[10.那11.］．当nf-κ..B信号通路被激活，Iκ..乙IKK激酶被激活磷酸化和泛素化的NF-κ..B抑制蛋白Iκ..B.α.，导致细胞质I减少κ..B.α.内容。因此，NF-κ..B P65亚单位从抑制状态进入激活状态的核，激活多种炎症因子的表达，并同时调节InOS基因的转录，导致肝脏微循环的病症[12.-15.］．

在我们以前的研究中，我们发现，莪术醇抑制HSC活化，并有助于造血干细胞的活化肝纤维化过程中细胞凋亡16.］．姜黄素是一种中药，能活血化瘀。然而，莪术醇对lsec的作用尚不明确。

我们推测姜黄素可以通过抑制NF-的活性来逆转肝纤维化κ..B信号通路和增加lsec的窗孔。我们的目的是阐明莪术醇通过抑制NF-的活性来改变LSECs的结构κ..B信号通路，可有效降低肝纤维化的发病机制。

2。材料和方法

2.1。药物和试剂

Curcumol购自Aladdin Chemical Company，MTT购自Sigma Chemical Company，四氯化碳购自天津福宇精细化工公司。脂多糖购自Sigma Chemical Company，PDTC来自Selleck Chemical Company，来自Sigma Chemical Company的二甲基磺砜，以及来自Gibco Chemical Company的DMEM和FBS。

2.2。动物

该实验是用来自广西医科大学医学实验室的8周龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠进行。动物证书编号是SCXK（GUI）2016-0002，动物许可证号码是SYXK（x）2015-0001。大鼠的重量为150-180克。动物研究是在广西中医药大学动物实验中心进行，由广西中医学院动物伦理委员会批准（议定书号：2016-12-02-1）。所有作者确保批准进行所有实验的指导方针和规定。在标准条件下测试所有动物（25℃和12小时光/黑暗循环）。

2.3。细胞分离和培养

通过腹膜内注射用3％戊巴比妥钠以0.15mL / 100g的剂量麻醉大鼠。麻醉剂被抗凝血剂治疗。oie等人描述了LSEC的分离。[17.]采用肝胶原酶灌注，差分离心和Percoll密度梯度沉降，以及细胞选择性粘附。通过扫描电子显微镜并在含有10％FBS的DMEM培养基中培养细胞。合适的条件包括适度室温和5％CO₂加湿空气以保持细胞。达到80〜90％汇合后，将细胞培养在6孔板上，密度为1×10^5.进一步实验48小时。为了保持分离的LSEC表型，一方面，在含有10%胎牛血清和10 ng/mL内皮细胞生长因子(ECGF)的DMEM中进行培养。另一方面，将原代细胞接种在胶原蛋白包被膜上进行实验，并在电子显微镜下用戊二醛快速固定。

2.4。实验分组及干预

将细胞分成五组。将第1组细胞用2％DMEM作为对照组处理。将2组细胞用LPS处理（激活NF-κ..B信号通路)μ.g/mL for 3 hr as the positive group. Group 3 cells were treated with curcumol at a concentration of 45 μ.g/mL, 48小时为莪术醇组。第4组细胞经浓度为45的莪术醇预处理μ.g/mL处理48小时后，用LPS 5处理μ.G / ml为3小时，作为Curcumol干预组。第5组细胞预处理25个细胞 μ.克/毫升PDTC（NF-κ..B抑制剂）30分钟，然后用LPS浓度5处理 μ.G / ml为3小时作为阴性对照组。

2.5。细胞增殖实验

将分离的大鼠LSECS的细胞密度调节至5×10^4.每mL细胞，内皮细胞完全培养基。细胞（100. μ.在96孔板上(空白孔置于37℃)孵育过夜(100μ.无菌PBS L的添加到孔周围的孔）。各成分组成的三个重复孔中，在37℃，5％CO培养₂48小时的饱和湿度。MTT（10. μ.L）加入每个孔中，然后在37℃下孵育4小时。培养基吸气后，150 μ.添加了10分钟的DMSO。每个孔的吸光度值OD568通过酶标记仪测定。从OD值计算每组的细胞增殖率。

2.6。西方的屁股

提取总蛋白，SDS-PAGE分离，转PVDF膜与一抗4℃孵育过夜。PBS洗涤后，用相应的酶标二抗37℃孵育2小时，然后用ECL试剂照射。利用BandScan对胶片灰度值进行分析。

2.7。实时定量PCR

使用总RNA提取试剂盒从LSEC中提取总RNA，然后使用RevastID第一链CDNA合成试剂盒从LSEC中提取并逆转录成cDNA。对于QPCR，使用SYBR绿色或荧光素QPCR主混合物。PCR引物如下：NF-κ..B、正向，5 ' -TGACGGGAGGGGAAGAAATC-3 '，反向，5- tgaacaaacacggaagctgg -3 (211 bp);GAPDH，正向，5 ' -TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3 '，反向5 ' -TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3 ' (115 bp)。反应在50°C 2分钟，95°C 10分钟，95°C 30秒，60°C 30秒。PCR产物用2%琼脂糖分离观察。采用GAPDH作为内部控制。采用ABI系统进行数据分析。

2.8。免疫荧光观察

目的研究NF-的表达及进入细胞核的机制κ..B在LSEC中，用PBS洗涤细胞3分钟3分钟，然后用4％多聚甲醛溶液固定15分钟。然后将细胞与含有山羊血清的0.5％Triton X-100一起温育，并与荧光标记的山羊抗兔IgG抗体孵育。将防焦淬火密封和DAPI安装介质安装在玻璃载玻片上并使用荧光倒置显微镜可视化。

2.9。扫描电子显微镜观察

为了研究LSECS中的更新的变化，我们使用了扫描电子显微镜（SEM）。在给药后，所有样品均进行扫描电子显微镜24小时。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤制剂两次，然后用2.5％戊二醛迅速固定1小时。将制剂用PBS洗涤两次，然后用30％，50％，70％和80％乙醇，4％C和90％，95％，100％乙醇。将制备的样品在室温下脱水10分钟。然后将配方在100％异戊酯中干燥。铂（15nm）用作表面制备样品的涂层。使用Hitachi扫描电子显微镜（SU-8010）观察样品。

2.10。统计分析

数据采用SPSS统计22.0软件进行分析，以均数±标准差表示。采用方差分析与Bonferroni后测来评估组间的显著差异。值< 0.05被认为是独立组之间的显著差异。

结果

3．1.LSECs的分离和培养结果

密度梯度离心．肝细胞悬浮液分为4个不同区域的密度梯度。上层（在Percoll梯度的顶层和25％Percoll梯度层之间）主要含有碎屑，受损的细胞和少量的非正良细胞。25％Percoll和50％Percoll之间的边界层富含LSEC，少量未知的小白色和红细胞。第三层（50％Percoll梯度区）含有Kupffer细胞（KC）和红细胞。在底层中沉积大量的红细胞。

Percoll密度梯度离心后，约32×10^6.获得LSEC细胞。选择性附着后，22 × 10^6.细胞。经台盼蓝染色，LSEC细胞存活率达95 ~ 98%。在光学显微镜下观察分离培养的lsec。在12小时时，细胞呈圆形，然后逐渐长成椭圆形结构(如图箭头所示)1（a））.After 36 hr, the oval cells slowly gathered into a paving stone-like shape, and the cells gradually became a spinning cone (as indicated by the arrow in Figure1（b））.60小时后，细胞形态基本变为纺丝锥形(如图箭头所示)1（c）），细胞增长更好。

３．２．MTT法检测各组细胞增殖率均较高

与空白对照组相比，莪术醇组的OD值有统计学显著（ ）.模型组OD值与空白对照组比较有统计学意义( ）.如图所示2．根据细胞增殖率公式（实验组OD /空白对照组OD），每组的增殖率大于60％，因此每组药物对细胞增殖率的效果率相对较小，并且测试后续实验的结果是可靠的。

３．３．莪术醇下调NF-的表达κ..B mRNA和磷酸化NF-κ..B.

nf-的表达κ..莪术干预组的B mRNA显着低于模型组中的mRNA（ ）.nf-的表达κ..模型组中的B mRNA显着高于空白对照组（ )，NF-的表达κ..莪术干预组的B mRNA显着高于PDTC组（ ）.nf-的表达κ..莪术基团中的B mRNA显着低于空白对照组中的mRNA，差异是统计学意义（ ）.RT-PCR检测显示Curcumol可以抑制NF-的表达κ..B mRNA，如图所示3.．

磷酸化NF-的表达κ..姜黄素干预组B值显著低于模型组，差异有统计学意义( )，nf-的表达κ..模型组中的B显着高于空白对照组（ ）.nf-的表达κ..莪术干预组的B显着高于PDTC组（ ）.nf-的表达κ..莪术基团的B显着低于空白对照组，差异有统计学意义（ ）.WB测定表明，Curcumol可以抑制磷酸化NF-κB的表达，如图所示3.．莪术醇抑制NF-的表达κ..B mRNA和磷酸化NF-κ..B，这可能是其抗纤维化的机制之一。

3．4．LPS诱导lsec的抛出

在正常的LSEC中，有大量的开放式雪比赛。虽然阳性对照组中的开放衰龄次数减少，但上述结果表明，LPS介导LSEC的规模和数量的变化。Curcumol组比对照组更开放，并且Curcumol干预组中的Fenestrae大小和细胞数量与阳性对照组相比增加，如图所示4.．结果表明，莪术可以改善LSECS的雪豆素的开口，并改善肝脏中的微循环。

3.5。Curcumol可以减少NF-κ..b从细胞溶溶解到核易位的B易位

检测NF-的表达κ..在LSEC中的B在核易位中的LSEC和易位，免疫荧光法用于识别NF-的表达κ..b在lsecs。nf-的表达κ..中的B组莪术显着低于在空白对照组，并且在干预莪组较阳性对照组低。莪术醇抑制NF-κ..B从胞质转位到核转位，如图所示5.．结果表明，Curcumol可以抑制NF-κ..B从细胞溶溶解到核转移并调节一系列下游靶基因的表达，从而改善LSEC的芬贝雷。

4。讨论

肝纤维化是慢性肝炎的进一步发展的重要阶段，并且它是为ECM的大量沉积的病理生理过程[18.］．众所周知，肝纤维化最终会导致肝硬化和肝衰竭。肝纤维化是一种常见的疾病，需要有效的治疗。大量研究表明，肝纤维化可以逆转[19.］．我们以前的研究表明，Curcumol具有抗纤维化效应[16.］．我们目前的数据表明莪术醇可以在体外恢复肝窦毛细血管化。

正弦毛细血管化主要是基础膜的形成和LSECS的衰减损失。LSECS构成肝脏正弦骨的血管壁，是肝脏中非正良细胞的主要群体，占实质细胞的约50％。在分化的LSEC电子显微镜下，可以看出其FeneStrae结构，并且在衰生内皮下没有完整的基底膜。Fenestrae占总面积的6％至8％。这种多孔结构在肝实质细胞和血液中发现。交换扮演关键作用。当发生正弦毛细血管化时，LSEC的损失导致LSECs的渗透率降低，并且各种代谢物不容易进入血液循环，加剧肝脏病理损伤。同时，肝细胞和血液被削弱。氧气和营养的交换最终导致肝细胞损伤和窦塌陷[20.那21.］．LPS可诱导肝窦内皮细胞活化。相比之下，莪术醇逆转了LPS刺激激活的lsec的病理。在本研究中，我们发现LPS促进了NF-的表达κ..而姜黄素可下调NF-的表达κ..B.结合以上数据，我们证实莪术醇通过下调NF-表达逆转LPS刺激的LSECs的病理改变，如窦状毛细血管化κ..B.

NF-κ..B是一种多效性转录因子。NF-κ..B中的B在健康细胞处于非活动状态。它主要结合其抑制剂Kappa B（I-κ..B）作为P50 / P65二聚体和存在于细胞质中。各种刺激物如活性氧和细胞因子可诱导的I-磷酸κ..B，与p50/p65分离，激活NF-κ..B，并将其转移到细胞核中。结合凋亡相关基因促进基因转录并产生细胞，细胞凋亡导致身体损坏。氧化应激是许多疾病炎症性疾病的重要因素，以及NF-κ..B诱导型一氧化氮合酶（InOS）-NO信号通路是一个重要的氧化应激途径[22.-24.］．LSECS的活动也受到NF-的监管κ..B /没有信令路径。LSEC可以合成和分泌NO和等，从而调节肝内血管舒张和收缩，并在调节肝鼻窦血流方面发挥重要作用。没有强大的血管扩张效果，直接刺激脱碱形式的可溶性胍基环化酶，这增加了循环鸟苷酸盐，这会导致CA²⁺减少和血管舒张[25.那26.］．在生理条件下，LSEC可以表达内皮一氧化氮合酶（Enos）并通过eNOS合成，但不低的水平低。由于脱落的较强能力和代谢物的长期生物学作用，保持正常血液灌注就足够了。LSECs非常容易受到某些毒物或药物损伤的影响。一些研究发现，当LSEC损坏时，ENOS后期改变异常改变，导致没有合成的减少，而ET-1与血管收缩的表达增加会导致HSC收缩[27.］．HSC表示ET-1受体。ET-1与受体结合以增加CA²⁺细胞中的含量，导致肌球蛋白等收缩。与此同时，它增加了表达α.-SMA，调节HSC增殖。增加钙²⁺由ET-1诱导的含量和细胞收缩在HSC活化之后的任何阶段被看见。ET-1也能直接影响肝窦，引起肝微循环障碍，导致肝细胞损害，门脉高压，和加重肝病。LSEC损伤和功能障碍加重肝脏的损伤，促进肝纤维化和肝硬化[28.］．

正弦毛细血管化前面肝纤维化。正弦毛细血管化导致肝脏微循环干扰。这种病变可以激活肝星状细胞，导致肝纤维化[29.］．中国传统医学认为，血瘀是肝纤维化的最重要原因。研究表明，该毛细血管可以是“瘀血综合症”的肝纤维化的根本原因[30.］．研究发现[31.姜黄是治疗慢性肝病常用中药的前十名。Curcumol是广西特产姜黄的主要活性成分，其抗纤维化作用与其活血化瘀的药理作用密切相关。结果表明，分离培养的lsec生长良好，形态独特，生长规律良好。细胞生长成铺路石样形态，从最初的圆形结构转变为椭圆形和纺锤形。实验结果为实验提供了依据。MTT实验显示各组细胞增殖情况良好，说明各项生物检测指标可靠。PCR、WB和免疫荧光分析表明莪术醇干预组对NF-有抑制作用κ..B信号通路被LPS激活。扫描电镜结果表明莪术醇通过抑制NF-的活性，提高了开窗孔的大小和LSECs的数量κ..B信号通路。与空白对照组相比，Curcumol基团可以抑制NF-的活动κ..B信号通路，表明当LSEC静置时，Curcumol也可以抑制NF-κ..B信号通路。扫描电子显微镜观察显示莪术中的肝脏正弦曲线。与空白对照组相比，LSECS衰生的数量增加，这可能与Curcumol对血液循环和血液淤滞的药理作用密切相关。根据我们的研究，Curcumol不仅可以用作有效的抗灰度药物，也可用作慢性肝病的预防剂。Curcumol可以抑制NF-的活性κ..B LSEC的信用路径和改善LSEC的FeneStrae。它可能是预防和治疗肝纤维化的分子机制之一。LSEC作为预防和治疗慢性肝病的目标将成为越来越多的问题。

5.结论

Curcumol通过抑制NF-的活性来调节LSEC的结构κ..B信号通路。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中，并根据要求可从相应的作者获得。

披露

杨正和王家辉是共同第一作者。

利益冲突

提交人声明没有财政冲突的利益冲突。

作者的贡献

Yang Zheng和Jiahui Wang对这一研究做出了同样的贡献。

致谢

作者感谢中国医药（广西，中国）广西大学提供实验室设备和技术支持。这项研究是由中国国家自然科学基金（批准号：81960755和81660705），广西青年和青年教师科研能力提高项目（批准号。2020KY59009），广西壮医药重点实验室（批准号。GXZYZZ2019-1支持），以及中国医学广西大学学报（批准号。2019XK141）。

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版权

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