Cistanches酶类PhG-RE通过抑制人细胞凋亡机制从H保护心肌细胞凋亡₂O₂全身的内质网应激

文摘

草药肉苁蓉有心肌保护作用。本研究试图解释PhG-RE保护心肌细胞的机制和验证如果发生这种保护通过调控细胞凋亡机制与内质网应激(ERS)有关。大鼠心肌细胞暴露于150年μg·毫升⁻¹PhG-RE 24 h,然后到100年μ摩尔·毫升⁻¹H₂O₂18 h诱导人队,建立细胞损伤模型。Thapsigargin (TG),一个特定的人活化剂,和4-phenylbutyric酸(4-PBA),一个人抑制剂,用于验证实验的准确性。我们的研究结果表明,PhG-RE显著提高细胞生存能力,保护细胞,减少细胞损伤和凋亡。PhG-RE扮演了一个角色类似于人抑制剂4-PBA保护心肌细胞对细胞凋亡和ER应激诱导的损害。此外,PhG-RE显著减毒的mRNA表达ERS-associated凋亡因素GRP78,排骨,和Caspase-12 ERS-associated的蛋白表达凋亡因素GRP78,排骨,Caspase-12, p-JNK。总的来说,这些发现表明,PhG-RE可以有效地保护心肌细胞,降低细胞凋亡和损伤,这可能是与ERS-associated调节细胞凋亡有关。

1。介绍

肉苁蓉(肉苁蓉)是一种用于中药的草本植物,生长在沙漠环境。信息glycoside-rich提取(PhG-RE)的主要活性成分肉苁蓉。研究发现,PhG-RE可以保护心肌对ischaemia-reperfusion (I / R)损伤(1]。

当人开始发生在心肌细胞的葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)增加与ERS-induced受伤。随着人的发展,细胞凋亡是发起,CCAAT / enhancer-binding蛋白同源蛋白的表达(切),c-Jun n端激酶(物)和半胱氨酰天冬氨酸特定proteinase-12 (Caspase-12)增加。例如,GRP78的表达,剁碎,和裂解ATF6 (c-ATF6)在大鼠心肌细胞与高频显著增加,和活跃(p-PERK) IRE1 (p-IRE1),和p-JNK被激活2]。此外,I / R损伤引起的人增加GRP78的表达和排骨3]。活跃和eIF2的磷酸化水平α增加(4]。伯灵顿pro-apoptotic蛋白质的表达和Caspase-3增加,导致细胞破裂,心肌重塑5的面积,心肌梗塞和心肌酶活性增加3]。这是在我们以前的研究发现对ischaemia-reperfusion PhG-RE可以保护心肌损伤,可以显著降低心肌梗死的面积由I / R (1]。然而,目前尚不清楚PhG-RE可以抑制ERS-associated心肌细胞凋亡从而减少损失和细胞凋亡。

在这项研究中,细胞使用PhG-RE观察PhG-RE能否抑制H₂O₂全身的人因此减少心肌细胞损失和细胞凋亡。Thapsigargin (TG),一个特定的人活化剂,和4-phenylbutyric酸(4-PBA),一个人抑制剂,用于进一步验证斡旋人队是否能有效降低细胞凋亡以及这个过程是否与GRP78的表达水平,切,物,和Caspase-12调解ERS-associated细胞凋亡。

2。材料和方法

2.1。试剂

材料与方法部分应该详尽,以便所有程序可以重复。它可以分成部分如果几个方法。H9c2老鼠心肌细胞从细胞银行获得中国科学院(中国上海)。肉苁蓉肉苁蓉PhG-RE是来自长春药用材料有限公司(长春,中国),被Zhong-ying刘博士(制药科学学院,吉林大学)和沉积的植物标本的制药、吉林大学(凭证标本号:YQCD2014)。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)获得GIBCO(大岛,纽约)。Thapsigargin和4-PBA从σ(圣路易斯,密苏里州)。乳酸脱氢酶(LDH)活力测定装备和CCK-8工具包买来Dojindo分子技术(日本东京)。胎牛血清(的边后卫)从HyClone购买(美国犹他州)。一个膜联蛋白V-FITC细胞凋亡测定设备购买从Beyotime生物技术(上海,中国)。胰蛋白酶是购自北京Solarbio生命科学(中国,北京)。ReverTra Ace qPCR RT工具包是购自TOYOBO(日本东京)。由于“快速上手”项目普遍SYBR绿色主人混合(火箭)从罗氏公司购买(瑞士巴塞尔)。

2.2。抗体

兔多克隆GADD153 /切和兔多克隆GRP78 / HSPA5 Abs买来罗福斯(美国科罗拉多州)。鼠标/鼠caspase-12亲和纯化多克隆Ab购买从研发系统(美国明尼苏达州)。Phospho-SAPK /物(Thr183 / Tyr185) (81 e11)和兔β肌动蛋白(13 e5)兔马伯购买从细胞信号技术(麻萨诸塞州,美国)。荧光辅助Abs买来LI-COR生物科学(美国内布拉斯加州)。

2.3。分组和治疗

H9c2细胞对数生长期在接下来的选择和治疗组:对照组(1):H9c2心肌细胞培养在一个完整的媒介;(2)PhG-RE组:细胞治疗中包含150个24小时μg·毫升⁻¹PhG-RE;(3)ERS-induced损伤模型组(H₂O₂集团):细胞治疗18 h中包含100μ摩尔·毫升⁻¹H₂O₂;(4)(PhG-RE) - h₂O₂组:细胞治疗中包含150个24小时μg·毫升⁻¹100年PhG-RE然后18 hμ摩尔·毫升⁻¹H₂O₂;(5)(4-PBA) - h₂O₂组:细胞治疗24小时培养基中含有5更易·毫升⁻¹100年4-PBA然后18 hμ摩尔·毫升⁻¹H₂O₂;(6)TG组:细胞治疗18 h包含50 nmol·毫升的媒介⁻¹TG;和(7)(PhG-RE)−TG:细胞治疗中包含150个24小时μg·毫升⁻¹PhG-RE然后在50 nmol 18 h·毫升⁻¹TG。

2.4。细胞培养

H9c2心肌细胞在DMEM培养含有10%的边后卫在37°C和1% penicillin-streptomycin孵化器有限公司为5%₂。完整的媒介取代每2 d。细胞在显微镜下观察,他们成长在梭状回的形状。当密度达到70%增长-85%,细胞亚文化在1:4比例。

2.5。CCK-8评估细胞的生存能力

H9c2细胞在显微镜下检查,选择对数生长期的细胞。细胞悬液是通过胰蛋白酶消化和离心5分钟在5毫升离心管在1000 r·分钟⁻¹。残余的液体被丢弃后,3毫升的DMEM完全培养基用于100年resuspend细胞球μL /好,5.0×10³细胞在显微镜下计算。这些细胞被转移到96孔板和培养在一个孵化器(37°C, 5%的公司₂)24小时获得完全贴壁细胞。光密度(OD)测量的波长450纳米。

细胞生存能力(%)= (OD实验组−OD空白组)/ (OD对照组−OD空白组)×100%。

2.6。光度法测量细胞损伤

乳酸脱氢酶(LDH)是一种酶在细胞质中,释放细胞损伤,从而稳定存在于培养基中。细胞损伤的程度可以确定通过测量介质中LDH的活性。这个实验是根据设备的指令进行的。OD是测量波长490纳米。每组中有三个井。

2.7。细胞凋亡检测与膜联蛋白V-FITC / PI染色

上层清液被除去,转移到一个流式细胞术管。一个细胞悬液制备与贴壁细胞底部的胰蛋白酶消化容器。悬浮离心后6分钟1.2×10³r·敏⁻¹丢弃,上层清液,细胞颗粒与PBS清洗三次。这个实验是根据指令进行膜联蛋白V-FITC细胞凋亡。细胞培养后在黑暗中在室温下15分钟,细胞用流式细胞分析仪进行分析。

2.8。RT-qPCR测量的相对mRNA的GRP78的表达,排骨,物,Caspase-12

细胞总RNA提取试剂盒试剂。两毫升总RNA被凝胶电泳分离评价提取的完整性。用分光光度计测量和计算OD (260) / OD(280)的价值。总RNA反向转录产生cDNA根据指令TOYOBO™ReverTra Ace qPCR RT工具包。表1显示引物列表。根据指令的罗氏™由于“快速上手”项目普遍SYBR绿色主人混合(火箭),反应条件如下:最初的变性在95°C 10分钟,95°C 10年代,30年代58°C, 72°C 30年代总共45周期。

2.9。免疫印迹分析蛋白GRP78的表达,排骨,物,p-JNK, Caspase-12

蛋白溶解产物(50μg)在10%的分离胶电泳分离,随后转移到PVDF膜。PVDF膜被TBS-T溶液中含5%脱脂牛奶在室温下为90分钟。阻塞PVDF膜是孵化隔夜抗体1,2,3,4在4°C,然后与山羊90分钟anti-rabbit免疫球蛋白在室温下(1:1000)。最后,膜双色红外激光成像系统的开发。

2.10。统计和分析方法

在这项研究中被处理的数据使用SPSS 24.0软件,和给出的结果意味着±SD。方差分析的数据来自多个组比较,而两组的数据进行比较t测试。的值 被认为有统计学意义。ImageJ软件被用于定量分析蛋白质的灰度值。

3所示。结果

3.1。PhG-RE对细胞活力的影响

如图1与对照组相比,H9c2 PhG-RE组细胞的可行性(没有明显变化 ),但细胞的生存能力在H₂O₂和TG组显著降低。相比的H₂O₂组织细胞的可行性(PhG-RE) - h₂O₂(4-PBA) - h₂O₂组显著增加。的TG集团相比,细胞生存能力(PhG-RE) TG集团显著增加。所有的结果具有统计学意义( )。

3.2。PhG-RE对细胞损伤的影响

如图2,尽管PhG-RE组织受损的细胞与对照组相比,破坏并没有达到统计学意义( )。细胞损伤的H₂O₂和TG组显著增加。相比的H₂O₂组织细胞损伤(PhG-RE) - h₂O₂和(4-PBA) - h₂O₂组显著降低( )。的TG集团相比,细胞损伤(PhG-RE) TG组显著降低( )。

3.3。PhG-RE对细胞凋亡的影响

如图3与对照组相比,细胞凋亡PhG-RE组(没有明显变化 ),同时,在H₂O₂和TG组显著增加( )。相比的H₂O₂组,细胞凋亡(PhG-RE) - h₂O₂和(4-PBA) - h₂O₂组显著降低( )。的TG集团相比,细胞凋亡(PhG-RE) TG组显著降低( )。

3.4。PhG-RE对GRP78的表达的影响,剁碎,物,Caspase-12信使rna

相对mRNA表达在每个实验组与RT-qPCR定量测量。如图4与对照组相比,相对mRNA的GRP78的表达,排骨,Caspase-12显著增加( )在H₂O₂组和物的相对mRNA表达也增加了( )。在TG集团相对mRNA的GRP78的表达,切物,Caspase-12显著增加( )。相比的H₂O₂组,相对mRNA的GRP78的表达,排骨,Caspase-12 (PhG-RE) - h₂O₂和(4-PBA) - h₂O₂组显著降低( ),而相对的mRNA表达物(没有明显变化 )。的TG集团相比,相对mRNA的GRP78的表达,物,Caspase-12 (PhG-RE) TG集团降低( ),和相对的mRNA表达砍(没有明显变化 )。

3.5。影响PhG-RE蛋白GRP78的表达,排骨,Caspase-12

图5显示了蛋白GRP78的表达水平,切,Caspase-12。与对照组相比,这三种蛋白的表达在H₂O₂细胞治疗后和TG组显著增加( )。相比的H₂O₂组,GRP78的表达、排骨和Caspase-12显著降低(PhG-RE) - h₂O₂和(4-PBA) - h₂O₂组( )。的TG集团相比,GRP78的表达,排骨,Caspase-12 (PhG-RE) TG组显著降低。

3.6。p-JNK PhG-RE对物的影响

如图6与对照组相比,H p-JNK的表达₂O₂和TG组显著增加( )。相比的H₂O₂集团的表达p-JNK (PhG-RE) - h₂O₂和(4-PBA) - h₂O₂组显著降低( )。的TG集团相比,表达式(PhG-RE)的p-JNK TG组显著降低( )。关于物的表达,没有明显变化的实验组( )。

4所示。讨论

心血管疾病,例如I / R损伤,可以通过氧化应激诱导人队,钙超载和氧自由基的形成。在这种情况下,ER蛋白质正确折叠和过程失败,导致错误折叠或展开的积累蛋白质在内质网,然后诱发展开的蛋白质反应(UPR)。UPR最初是一个细胞应激反应,抑制细胞凋亡,但最终加速。

研究证实,人在一定程度上解释了为什么动脉缺血和缺氧会加剧心脏病(6,7]。凋亡因素,GRP78,半胱天冬酶12,排骨,和物,是重要的参与者在疾病的发生8- - - - - -11]。在这项研究中,我们研究的对抗和相关机制PhG-RE H9c2细胞凋亡的H₂O₂全身的人。使用100μ摩尔·毫升⁻¹H₂O₂作为诱导物,一个人的模型成立于H9c2细胞。确保模型的有效性和准确性,具体的内质网应激激活thapsigargin (TG)被用来确定PhG-RE保护细胞免受ERS-induced细胞凋亡。人队抑制剂4-PBA也用于确定是否PhG-RE产生的效果类似于4-PBA有效对抗细胞凋亡引起的H₂O₂全身的人。

在这项研究中,两个H₂O₂和人活化剂TG斡旋人引起细胞凋亡的细胞。LDH、稳定的酶存在于细胞质中,离开细胞,细胞破裂。因此,细胞损伤可以通过测量确定LDH泄漏的介质。细胞水平的可行性和LDH泄漏代表H9c2细胞受损,可以用来评估PhG-RE前处理对细胞的保护作用。接触PhG-RE有效减少细胞凋亡引起的TG和H₂O₂,提高生存率,减少LDH释放。这一发现表明,PhG-RE发挥作用类似于4-PBA在保护细胞。这个结果表明PhG-RE可以保护细胞免受ERS-induced损伤和细胞凋亡。

在正常细胞不受压力,GRP78,这是与人有关,结合多个ER跨膜蛋白在细胞表面,是处于不稳定的状态。当人第一次发生时,展开的蛋白质诱导UPR GRP78促进跨膜蛋白的分离。分离后,GRP78结合展开或错误折叠的蛋白质,以应对人通过蛋白表达增加12- - - - - -14]。随着人的发展,内质网的功能严重受损,和UPR启动细胞凋亡抄录和激活CCAAT / EPB同源蛋白质(切),c-Jun n端激酶(c-JNK)和Caspase-12。在正常细胞中,砍的表达较低,主要是在转录水平调节,它已经表明,人队和UPR诱导砍转录(15]。当人诱导细胞凋亡,砍的表达和其在细胞核的积累增加(16]。此外,由于pro-apoptotic影响UPR pro-caspase-12被释放,并启动细胞凋亡。pro-caspase-12裂解成其活跃的形式发布,Caspase-12。人启动细胞凋亡的一个重要原因是Caspase-12激活人队(17]。物,另一个元素,凋亡是由IRE-1-TRAF2-ASK1激活复杂,生成在细胞凋亡。下游半胱天冬酶家族起pro-apoptotic作用,也被激活。

利用基因和蛋白质检测技术,本研究调查的机制PhG-RE保护心肌细胞。ER应激发生时,转录因子砍会导致Cyt C的释放和凋亡诱导因素(aif),导致细胞凋亡(18- - - - - -20.]。此外,高度保守的ER IRE1膜蛋白质α可以被磷酸化和诱导细胞凋亡通过TRAF2激活另一个通路和细胞凋亡信号调节激酶1 (ASK1)介导的信号转导21]。预处理与PhG-RE mRNA的GRP78的表达,减少切,Caspase-12在H ER应激₂O₂全身的细胞,以及TG-induced mRNA的GRP78的表达,物,Caspase-12。对H PhG-RE预处理有拮抗作用₂O₂TG-induced增加GRP78,排骨,p-JNK, Caspase-12蛋白质表达水平。这些结果表明,PhG-RE扮演的角色类似于人抑制剂4-PBA保护心肌细胞,对抗ERS-induced凋亡减少的mRNA和蛋白表达与ERS-induced凋亡相关的因素。物蛋白质虽然没有显著变化,这一发现与文献一致表明物功能通过其活性形式,p-JNK。图7显示了信号通路,它可能清楚地解释PhG-RE作品对ERS-induced保护心肌细胞凋亡。

5。结论

心肌ischaemia-reperfusion损伤加重心肌损伤的主要原因。另一个因素,诱发心肌疾病,人已经研究的一个新焦点,旨在改善心肌疾病治疗的效果和功效。本研究进一步探讨PhG-RE保护心肌细胞的作用,表明PhG-RE-mediated心肌保护是ERS-induced细胞凋亡的调节密切相关。然而,随着心肌疾病是由多种因素引起的,进一步的研究将需要执行PhG-RE的影响。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了吉林省科技发展计划(批准号:20160101032 jc)。

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