文摘

越来越多的证据表明睡眠剥夺(S-Dep)是一个萧条的关键风险因素。电针刺激(EA)治疗改善创伤后应激障碍的报道——(PSTD)像行为和提高海马神经发生。然而,EA治疗是否有益影响S-Dep-induced类似抑郁的行为仍然是未知的。在目前的研究中,我们关注是否EA Baihui (GV20)可以改善S-Dep恶化影响的老鼠。小鼠随机分为正常、S-Dep S-Dep + EA, S-Dep +假EA组。认知行为测试和体外试验进行了分别以避免行为测试对突触传递和蛋白质表达的影响。类似抑郁的行为是由强迫游泳试验(置),尾部测试(TST)和莫里斯水迷宫(微波加工)。神经发生被BrdU、克莱斯勒和NeuN免疫荧光染色。体外长期势差是探测到高频刺激(HFS)在海马切片谢弗collateral-CA1突触。脑源性嗜神经因子(BDNF)和原肌球蛋白受体激酶B (TrkB)蛋白表达水平受到免疫印迹的化验。 Our results indicated that D-Sep mice demonstrated depression-like behaviors determined by prolonged immobility duration in FST and TST; D-Sep mice also manifested spatial memory retention deficit in MWM. Furthermore, EA treatment ameliorated D-Sep-induced depression-like behaviors and spatial memory retention deficit. Mechanically, EA treatment alleviated neuron progenitor cell proliferation and differentiation, ameliorated the field excitatory postsynaptic potentials (fEPSPs) slope impaired by S-Dep, and elevated BDNF/TrkB protein expression. Taken together, our data suggested that EA treatment has a protective effect on S-Dep-induced depression-like behavior and cognitive impairment, which may be through regulating BDNF/TrkB protein expression.

1。介绍

作为一个国家发现了睡眠,巩固新制定的记忆,对学习新信息和心理性能至关重要(1]。睡眠不足或失眠已被证明有助于hippocampal-dependent认知赤字和类似抑郁的行为;突触可塑性的潜在机制包括中断电生理学和分子水平以及在结构层面上(2]。长期势差现象(LTP)是一种形式的突触可塑性作为一个体外生物模型的学习和记忆。充分的证据表明,睡眠不足会对记忆形成不利影响和LTP感应3- - - - - -5]。脑源性神经营养因子,生成家族的一员,是一个重要的调制器在突触可塑性和记忆形成。BDNF需要绑定到它的高亲和性蛋白激酶受体,TrkB,展示其生物效应(6]。

针灸,传统疗法起源于中国古代,是一种替代和补充医学早就知道对各种神经退行性疾病,包括抑郁症治疗效果(7]。大量研究表明,针灸或电针刺激治疗改善认知障碍和提高hippocampal-dependent突触可塑性。GV20坐落在先端auriculate,中线的头。临床上,针灸在GV20已广泛应用于神经心理疾病,包括抑郁症、焦虑,帕金森病,神经衰弱,虽然这种现象的潜在机制还没有完全体现。针灸刺激在GV20已经证明改善scopolamine-induced认知障碍和减轻脑源性神经营养因子表达式(8]。前研究表明,针灸GV20产生即时镇静效果和脑电图改变α和β波频率在睡眠剥夺模型(9]。EA GV20和被羞辱的(GV24)减毒的表达在下丘脑单胺神经递质和il - 1β在睡眠剥夺大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤(10]。

EA处理或预处理可以调节ESPS-induced焦虑行为,防止海马神经发生中断的创伤后应激障碍大鼠模型(11,12]。然而,EA的影响在GV20 S-Dep-induced海马突触可塑性损伤和类似抑郁的行为仍然难以捉摸。本研究调查的影响在GV20穴位EA S-Dep小鼠抑郁症行为测试,神经发生检测,LTP感应和BDNF / TrkB信号蛋白测定。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性BALB / c小鼠2 - 3月岁来自湖北的实验动物研究中心(武汉)。动物们被安置在一个12 h(07: 00-19: 00)和每个周期有免费的食物和水。房间温度保持在23±1°C。所有老鼠都是适应环境前1周的实验。小鼠随机分为4组:正常组,S-Dep集团S-Dep + EA组,和S-Dep +假EA组,每组包含34个老鼠(图1)。正常组不接受任何治疗但被固定化的手温柔的塑料限制就像治疗组。S-Dep和EA治疗后,动物被用于行为测试的子集(n= 10 /组),LTP感应(n= 8 /组),和生化分析(n= 6 /组)。所有实验程序符合实验动物保健原则的指导方针和中华人民共和国的法律为实验动物的使用和护理。

2.2。睡眠剥夺模型

采用多平台设备建立睡眠剥夺小鼠如前所述[13]。简而言之,动物是放置在一个与多个小平台室(直径:3.5厘米)是1厘米。当动物进入快速眼动(REM)睡眠,他们的肌肉张力减弱和动物落入水中,唤醒他们,阻止他们睡觉。对正常小鼠、小平台被替换为大班(直径:13厘米),允许他们进入快速眼动睡眠没有落入水中。这个实验S-Dep诱导了48 h。

2.3。电针刺激刺激

EA治疗期间每日服用一次S-DEP 48 h。EA与插入刺激持续了30分钟,5毫米的深度Baihui(问20)。一项研究发现,EA马2的强度和100赫兹(脉冲宽度:0.2毫秒,时间:10 - 30分钟)在小鼠具有显著的镇痛效果(14];在这项研究中,两相的平方脉冲(2,0.2 ms)与高频、100 Hz,是通过医学管理EA装置(青岛鑫升仪器、青岛)。针(0.25毫米×25毫米)从苏州Hualun购买医疗器械有限公司(苏州、中国)。在虚假的EA治疗组、针灸针表面上插入了没有电刺激穴位。去年EA治疗结束的时候,老鼠受到行为、电生理、免疫化学分析分开。

2.4。尾巴暂停测试

结核菌素被用于分析则行为如前所述[16]。短的纸胶带(约6厘米)是沿尾部长度的一半(约3厘米)。老鼠的头离地面约20厘米。测试进行了6分钟,在此期间小鼠不动时间记录,与没有发起运动定义为不动。第一个2分钟活动被认为是预处理阶段,期间视频和静止的时间最后4分钟。

2.5。强迫游泳测试

三个小时测试后,老鼠被放置在一个圆柱体容器(25厘米直径;高度50厘米)含有淡水(温度24±1°C) 6分钟,和行为活动视频。第一个2分钟被认为是进行预测和被排除在分析游泳。固定期限的最后4分钟数。

2.6。莫里斯水迷宫

采用微波加工评估spatial-related工作记忆如前所述[15]。坦克的实验(直径124厘米)装满水(32厘米深度)。水是不透明的白色无毒油漆,和温度保持在22±1°C实验。老鼠训练来找到一个圆筒形平台(直径10厘米)。微波加工测试分为两个阶段,培训阶段和探索阶段。每个鼠标执行四个试验连续5天每天在训练阶段;老鼠被允许游泳对60年代寻找隐藏的平台。如果老鼠成功达到了平台在60年代,他们被允许呆在那里15年代,如果他们失败了,他们是手动的平台。探索测试进行了最后的EA治疗后7天而平台删除。探索的痕迹,在目标象限,时间和次数的交叉平台探索会话进行了分析。

2.7。LTP记录

从每组八个老鼠最终EA治疗后被牺牲了。大脑被立即删除并放置在冰冷的含氧人工脑脊液(ACSF)包含100蔗糖(mM), 60氯化钠,氯化钾,8 MgCl₂1.3不₂阿宝₄,30 NaHCO₃0.5、5 d -葡萄糖和CaCl₂(pH值7.2 - -7.4)饱和carbogen(95%啊₂−5%股份有限公司₂)。大脑的左侧是放置在免疫印迹的液氮,右边是用于LTP录音。日冕海马切片(300μ米)被使用vibratome (VT1000S、徕卡、德国)在冰冷的含氧切割解决方案。记录解决方案包含(125毫米)氯化钠,2 CaCl₂,2.5氯化钾,1 MgCl₂25 NaHCO₃1.25不₂阿宝₄pH值和25 d -葡萄糖(7.2 - -7.4)。LTP实验进行了使用双极刺激电极,刺激电极位于谢弗抵押,和记录电极位置是在CA1镭地层。刺激强度将唤起fEPSPs最大振幅的40 - 50%。fEPSPs记录每30年代,LTP被强直刺激诱导2 s的100赫兹。基线反应记录20分钟,其次是持续记录fEPSPs 60分钟。

2.8。免疫荧光

顶尖EA治疗后,每组6小鼠被牺牲和PBS其次是10%福尔马林灌注。然后大脑样本切成20μ片冠方。从每个大脑,三片选择包括海马的DG染色。片是被0.3% BSA和0.3% Triton x - 100块非特异性结合,然后孵化BrdU主要抗体,NeuN,和doublecortin(克莱斯勒)24小时在4°C,其次是孵化与二次抗体Alexa萤石488驴anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 1000年,表达载体,热费希尔科学)和Alexa萤石594山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 1000年,表达载体,热费希尔科学)在室温下2小时。荧光显微镜下图片被抓获(ECLIPSE 90 i、尼康、日本)。

2.9。免疫印迹分析

海马组织在100年被孤立和细胞溶解μl Radioimmunoprecipitation试验(里帕)缓冲区(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)加蛋白酶抑制剂。蛋白质浓度由Bicinchoninic酸蛋白量化分析工具(Beyotime生物科技、上海、中国)。总蛋白(50μg)为12% sds - page和加工转移到PVDF膜(微孔、Billerica MA)。屁股被5%脱脂乳和免疫印迹anti-BDNF(1: 2000年,Abcam) anti-TrkB(1: 300,手机信号),和anti-GAPDH(1: 1000年,Abcam)。膜是辣根peroxidase-conjugated二级抗体孵育1 h在室温下。乐队的蛋白质被发现使用ECL和分析Image-Pro + 6.0。

2.10。统计分析

GraphPad Prism 7.0软件被用来执行所有分析。数据是平均数±标准差。使用两个示例学生的数据进行了分析t两组比较,以及和双向方差分析(方差分析)是多个组进行比较。意义阈值被设定值< 0.05。

3所示。结果

3.1。EA逆转S-Dep引起类似抑郁的行为

置和结核菌素都是经典行为测试模型类似抑郁的症状。置的静止时间S-Dep组明显升高(121.50±8。94年代)与正常组相比(76.56±7。12,由EA逆转治疗(81.35±6。95年代)。然而,虚假的EA治疗(117.36±7。91年代)无显著影响了时间静止而S-Dep组(图2(一个),所有 )。浮置板轨道的结果,依照结核菌素的静止时间S-Dep组显著增加(97.58±6。15秒)和虚假的EA组(95.20±5。与正常组相比74年代)(58.64±5.71);EA治疗(62.12±4。93年代)中和S-Dep诱导静止的时间(图2 (b),所有 )。这些数据表明,EA的治疗改善S-Dep-induced类似抑郁的行为。

3.2。EA减轻空间记忆保留S-Dep引起的赤字

我们进一步研究了EA治疗的效果在空间记忆保留MWT。活动由老鼠的痕迹,如图3(一个)。由S-Dep空间记忆保持能力明显受损,增加的交叉平台(图3 (b), )和更少的时间花在目标象限(图3 (c), )在探索阶段。然而,EA治疗显著改善记忆力S-Dep-induced老鼠的能力。与S-Dep组相比,次穿越平台的减毒,时间在目标象限是减轻。综上所述,EA治疗防止赤字S-Dep所致小鼠空间记忆保留。

3.3。EA减轻海马神经元DG的祖细胞分化

确定S-Dep诱导小鼠EA治疗对神经发生的影响,我们进行了免疫荧光染色实验。BrdU标记的增殖细胞,NeuN用于标签成熟的神经元。作为显示在图4(一),BrdU NeuN双阳性细胞显著减毒D-Sep组但在EA治疗组升高,而虚假的EA治疗没有影响BrdU NeuN双阳性细胞数量(图4 (b),所有 )。上述结果表明,EA治疗增加了神经祖细胞分化成神经元。

3.4。EA减轻海马神经元DG的祖细胞增殖

进一步确定EA治疗神经发生的影响,BrdU和克莱斯勒双重免疫荧光染色法进行了DG的海马。克莱斯勒被广泛采用标签未成熟的细胞。作为显示在图5(一个),S-Dep减毒BrdU和克莱斯勒双阳性细胞表达,由EA逆转治疗,但不被虚假的EA改变治疗(图5(一个),所有 )。本研究表明,EA治疗促进神经祖细胞的自我更新和增殖能力。

3.5。EA废除LTP S-Dep引起的损伤

确定EA对学习和记忆的突触传递的影响水平,海马谢弗collateral-CA1 LTP被记录。fEPSPs斜率明显受损S-Dep组与正常组相比HFS后60分钟,期间由EA废除治疗,但被虚假的EA治疗(数据没有改变6(一)和6 (b),所有 )。平均fEPSPs斜率值的50 - 60分钟S-Dep组(105.68±8。95)明显低于正常组(152.50±9。EA 34)和治疗组(148.72±8。83)(图6 (c),所有 )。上述数据表明,EA治疗改善LTP D-Sep恶化。

3.6。EA逆转BDNF / TrkB表达S-Dep老鼠

调查潜在的保护作用分子机制的EA S-Dep-induced认知障碍,进行免疫印迹检测海马的蛋白表达。BDNF蛋白表达水平和TrkB被S-Dep大大减轻,而被EA治疗明显增加。没有明显的差异蛋白表达BDNF水平和虚假的EA TrkB治疗组(数字7(一)和7 (b),所有 )。总的来说,EA治疗废除S-Dep-induced减少TrkB /脑源性神经营养因子的蛋白质水平。

4所示。讨论

针灸治疗已被证明对失眠患者起到antidepression作用,可以安全地应用于治疗失眠17]。刺激在GV20位于头顶被广泛接受的治疗神经精神疾病的临床实践中,然而,潜在的分子机制是有争议的。目前的研究方法使用剥夺睡眠的小鼠模型研究的潜在机制EA在认知障碍GV20穴位。与先前的研究一致(18),我们的研究表明,S-Dep 48 h诱导类似抑郁行为如图所示降低浮置板轨道和结核菌素不动时间。EA连续2天治疗后,静止时间在置和结核菌素S-Dep + EA组明显低于S-Dep集团的指示antidepression EA的效果。进一步,微波加工的空间记忆力能力估计。穿越平台次数越少,和更少的时间花在目标象限表明显著改善的空间记忆力障碍S-Dep + EA组相比S-Dep组。相比之下,S-Dep +产生虚假的EA组与S-Dep组相比没有明显的保护作用。这些数据表明,EA在S-Dep-induced抑郁GV20有保护作用。使用p-chlorophenylalanine-induced失眠大鼠模型研究表明,EA治疗促进褪黑激素分泌(19],它产生一个重要antidepression效果。另一项研究报道,针灸治疗GV20有镇静效果,增加α波频率,减少β波的频率在72 h后大鼠睡眠剥夺(20.]。有趣的是,一项研究使用72 h睡眠剥夺大鼠模型表明,EA在GV20 ST36同时改善内存赤字(21),这是按照我们的结果使用48小时睡眠剥夺小鼠模型在使用EA GV20孤单。相比之下,我们的数据扩展的有益作用EA S-Dep从老鼠到老鼠和证明EA只有穴位GV20可以实现这种效果。集体,我们得出的结论是,EA GV20 S-Dep-induced抑郁症有保护作用。值得注意的是,我们在当前的研究中使用的刺激强度导致的表现温柔的头点头,表明刺激同时老鼠。更重要的是,没有明显的行为改变后的第一个小时。行为测试的改进EA刺激后出现一个小时;这种延迟效应可能表明需要时间EA治疗调节神经功能和网络活动。因此,我们推测,EA改善睡眠deprivation-induced类似抑郁的行为是依赖于GV20穴位,而不是直接电休克冲击。

海马神经发生已经证据确凿的记忆形成spatial-related发挥关键作用,类似抑郁的行为;因此,我们进行免疫荧光染色评估BrdU-labeled增殖细胞和DCX-labeled未成熟的细胞表达。BrdU-positive神经元和DCX-positive细胞明显减轻S-Dep组与正常组相比,但在S-Dep + EA组明显升高。上述结果表明,EA治疗促进神经祖细胞增殖和分化S-Dep老鼠。EA在GV20 GV14报道改善卒中后神经发生(22]。综上所述,我们证明了神经发生进化在EA的有益影响治疗认知障碍。

LTP,长期持久的突触传递效能的增强,作为电流变广泛采用存储学习和记忆的机制23,24]。我们的研究结果表明,HFS-induced势差S-Dep fEPSPs斜率是抑制的,由治疗而不是虚假的EA逆转治疗。我们的结果与之前的研究一致,这表明,针灸可以防止在血管性痴呆大鼠海马LTP的障碍25]。

研究表明EA治疗和预处理改善创伤后应激障碍(PTSD)像老鼠的行为(11,12,26]。而非创伤后应激障碍,创伤事件引发了积极的事件或冲突等情况(27),S-Dep-induced抑郁症是接近或轻度应激抑郁。因此,我们得出的结论是,EA对PTSD-induced抑郁症或有保护作用S-Dep-induced轻微抑郁。

脑源性神经营养因子在突触可塑性和记忆的形成中扮演着关键角色,针对其的高亲和性受体蛋白激酶TrkB [28,29日]。越来越多的证据解决海马脑源性神经营养因子的差别S-Dep-induced对这些基因(30.,31日]。48 h S-Dep,极大地降低了BDNF表达在CA1, CA3,和齿状回(DG)的海马体,伴随着减毒Ca^{2 +}/ calmodulin-dependent蛋白激酶2 (CAMKII)和营地反应元件结合蛋白(分子)表达和减轻磷酸化分子(32,33]。LTP是由不同的信号分子包括CAMKII和磷酸化分子。Downregulation CAMKII和磷酸化分子受损LTP感应(34]。这反过来会降低关键目标基因包括BDNF的表达,这样循环回到调解活动分子(35]。在当前的研究中,我们发现EA治疗预防S-Dep-induced BDNF的衰减和高亲和性受体TrkB海马体和恢复LTP感应反应;因此,我们推测EA可能发挥antidepression-like效应通过调节BDNF / TrkB信号通路。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

修订手稿是由徐副主任,《王。实验数据的采集和分析是由徐副主任。研究概念和设计是彭郑的责任。

确认

这项工作得到了中国国家重点基础研究计划(973计划)(没有。2014 cb543100);吉林省(没有的教育部门。2016134);和吉林省中医药管理局(没有。2016011):吉林省科学技术厅(治疗评价中医综合康复方案治疗卒中后肢体痉挛)。作者要感谢宋拯救教授指导课题研究。