来自Maprang种子的戊酰葡萄糖和富含乙酯的富含乙酸乙酯的提取物，通过线粒体介导的途径诱导MCF-7乳腺癌细胞的细胞凋亡

摘要

羹大利格里菲思在当地被称为maprang，作为一种泰国果树具有重要的经济价值。maprang seed extract (MPSE)已被证明具有抗菌和抗癌活性。然而，MPSE的生物活性成分及其抗癌作用的分子机制尚不清楚。本研究旨在鉴定MPSE中的活性化合物，并探讨MPSE诱导MCF-7处理的癌细胞凋亡的机制。采用MTT法测定细胞毒作用。从ROS的产生、线粒体膜电位去极化和凋亡相关基因的表达等方面评价MPSE诱导细胞凋亡的作用。经高效液相色谱和质谱联用分析鉴定为五没食子醇葡萄糖、没食子酸乙酯和没食子酸。MPSE处理可降低MCF-7细胞增殖，推测MPSE可诱导G2/M期细胞周期阻滞。MPSE被发现可以促进MCF-7处理的细胞内ROS的产生，并影响线粒体膜电位的去极化。此外，MPSE治疗可导致Bax/Bcl-2提示mpse诱导的细胞凋亡是线粒体依赖的通路。我们的研究结果表明，从maprang种子中获得的天然产物在乳腺癌治疗中具有靶向凋亡通路的潜力。

1.导言

乳腺癌是全球妇女中最主要的癌症形式，是影响其发病率和死亡率的重要因素[1]．近年来，包括外科手术、化疗和放疗在内的乳腺癌常规治疗方法得到了改进，提高了治疗效果，减少了妇女癌症相关死亡人数。然而，持续使用化疗药物或放疗治疗乳腺癌经常导致治疗耐药性的问题。传统疗法的潜在机制是抗凋亡途径的激活[2，3.]癌细胞对凋亡细胞死亡的抵抗是消除癌细胞的主要障碍之一。目前的研究工作主要集中在鉴定某些能够有效触发细胞凋亡的化合物。此外，理想的抗癌药物必须对癌细胞具有选择性和细胞毒性，而不会对正常细胞产生不良影响[4]细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，通常被认为是一种普遍的细胞死亡形式[5]．细胞凋亡的潜在机制是通过线粒体依赖或线粒体独立途径发生的[6]．线粒体依赖途径(内在途径)主要由非受体刺激触发，包括DNA损伤和氧化应激[7，8]．活性氧(ROS)在细胞功能和肿瘤进展中起着至关重要的作用。线粒体是细胞ROS的主要来源，ROS的过量生成可导致线粒体功能障碍，从而诱导凋亡细胞死亡[9]．众所周知，癌细胞表现出高氧化应激的明显特征，这反过来又暴露了这些癌细胞，使它们更容易受到进一步的氧化应激[10]．因此，针对ROS具有很大的承诺，并且可能是癌症治疗有效方法的一个重要方面。

植物源性植物化学物质对正常细胞毒性低，疗效高，被认为是潜在的抗癌药物。事实上，大多数临床应用的抗癌药物都是从植物中生产的，如足叶乙甙、拓扑替康、长春花碱和长春新碱[11]．近年来，许多天然产物被发现具有诱导癌细胞凋亡的细胞毒作用。这些物质也可与化疗或放疗联合使用，可提高许多常见癌症治疗的疗效和减少副作用[12，13]．许多研究人员现在正在关注对植物的潜力的调查，可以产生植物化合物，成为有用的制药工业。特别是,1、2、3、4、6-penta-O-galloyl -β- d -葡萄糖或pentagalloyl glucose (PGG)是一种可水解的单宁，属于一组没食子苷，是一种天然的多酚化合物，发现在各种草药和植物，如Galla Chinensis.，盖拉语Rhois,芍药［14]．PGG因其治疗潜力而受到关注，并显示出某些功能特性，如抗菌、抗炎、抗癌、抗糖尿病和抗氧化活性[15]PGG对包括前列腺癌在内的多种癌细胞具有抗增殖作用[16]、肝癌[17]，以及乳癌[18]．

尽管在中药中常用的植物中已经发现了PGG，但最近的研究人员已经在一些农用工业副产品中发现了PGG，如芒果种子仁和芒果种子月见草paradoxa［19，20]．食物浪费和副产品被认为是新的廉价的有价值成分的来源，已经引起了更多的关注。近年来，人们对从农用工业废物中取得附加价值的可能性越来越感兴趣[21]．已经很好地确定了许多植物副产品（皮肤，纸浆和种子）是有价值的营养素来源，含有各种生物活性分子[22，23]。从植物副产品中获得的有价值化合物的回收和利用将对相关植物产区的潜在社会经济效益产生显著的积极影响。

玛丽安李子(羹大利格里菲思)是东南亚的本地水果，在泰国被称为“maprang”。该物种与芒果属同一科(芒果科)。Maprang树是泰国最受欢迎和重要的经济果树。一般来说，马普朗水果要么是新鲜的，要么是加工后用于一系列产品，如果汁、甜点和腌小吃。除了日常食用的果肉外，种子通常会作为一种废物被消费者除去。这些非商业副产品可能是各种应用中天然成分的可开发来源。这些副产品可作为植物化学药物用于预防或治疗一些人类疾病。有报道称maprang种子提取物或MPSE对药物敏感和耐药白血病和肺癌细胞具有抗增殖活性[24]最近，我们报道了马槟榔种子的氢乙醇提取物（MPSE）的HPLC图谱包含四种主要化合物。众所周知，MPSE具有抗氧化和广谱抗菌活性，并对肿瘤细胞具有抗癌作用[25]有趣的是，在暴露于X射线辐射之前，用MPSE对MCF7细胞进行预处理，可阻止上皮-间充质转化（EMT）过程，并减少在治疗后阶段因应激刺激而产生的癌症干细胞（CSC）的发生。此外，MPSE的预处理抑制了参与治疗耐药过程的多药耐药蛋白的表达[26，27]．这些都表明MPSE可能是一种有效的癌症治疗形式的重要组成部分。然而，抑制肿瘤增殖的潜在机制尚未得到充分的研究和报道。

在此，我们旨在研究MPSE对人乳腺癌MCF-7细胞系模型的抗癌作用，并探讨其潜在的机制。利用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)和高效液相色谱(HPLC)分析其抗癌活性。为了探讨MPSE可能的作用机制，探讨MPSE对ROS生成、细胞周期进程、线粒体膜电位的破坏、表达的改变等的影响Bax.和Bcl-2基因和凋亡诱导的过程全部在MCF-7细胞中进行研究。调查结果可能导致建立一种新的替代药物，可以改善有效乳腺癌治疗的疗效。

2.材料和方法

2．1．材料和试剂

乙腈、三氟乙酸（TFA）、乙醇和甲醇从Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）获得。HPLC级乙腈和二甲基亚砜从默克公司（德国达姆施塔特）获得。RPMI 1640、Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F-12）、胰蛋白酶EDTA、链霉素和青霉素从Caisson实验室（美国犹他州）购买。胎牛血清由Sigma Aldrich（美国圣路易斯）提供。此外，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）、人胰岛素、表皮生长因子和氢化可的松购自Sigma（美国圣路易斯）。Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒和二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）也从Sigma购买。JC-1线粒体膜电位测定试剂盒购自Calbiochem（美国加利福尼亚州）。此外，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）从Thermo Fisher Scientific（MA，美国）获得。所有标准化合物，包括没食子酸（GA）、没食子酸乙酯（EG）和五邻没食子酸酯-β-D-葡萄糖水合物（PGG）购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。

2．2．植物材料及提取

50公斤马槟榔果实，未成熟（花后50天以上），成熟的两个品种，包括马槟榔湾（甜马槟榔）和马槟榔普里约（酸马槟榔），于2017年3月至4月从位于泰国Nakhon-Nayok省的马里安李种植园收获。果实用自来水三次冲洗并横切面。移除种子，称重并切碎。根据Dechsupa等人描述的方法提取MPSE[25]．简而言之，在60℃下用热空气干燥剁碎的种子以进一步提取。随后，将350g碎片浸入3.5升氢乙醇系统（75％EtOH）中，以使它们在每日摇动时浸泡7天。通过kieseluhr过滤提取溶液，并在40℃下以旋转蒸发器（Buchi Rotavapor R-210，瑞士）以200rpm的近似旋转速度在40℃下蒸发干燥。将MapRang种子的粗提物收集并在干燥器中储存在室温下进行进一步研究。为了制备储备溶液，将MPSE的粉末样品以1mg / mL的终浓度溶解用DI水。然后用0.22过滤溶液 μm注射器过滤器，ali引号，并储存在−70°C直到使用。

２．３．高效液相色谱法分析MPSE中PGG、EG和GA

MPSE的HPLC分析通过反相HPLC（配备SPD-M20A突出紫外可见二极管阵列检测器的LC-20AD突出液相色谱仪；日本岛津）进行表征和鉴定。使用的分析柱涉及250个样品 嗯 × 4.6 身份证号码是5 μm ZORBAX Eclipse Plus-C18，防护柱为12.5 嗯 × 4.6 身份证号码是5 μm ZORBAX Eclipse Plus-C18（安捷伦，美国）并在25℃下操作。流动相由0.1（v/v）三氟乙酸（TFA）水溶液（洗脱液A）和乙腈（洗脱液B）组成。在1℃下记录流速 mL/min，通过特定的时间指示（min）和洗脱液B（%）优化线性梯度程序，如下所示：0,5；5,5；7,10；12,10；12,10；14,15；19,15；21,20；26,20；30,25；35,25；37,30；45,30；50,100；55,100；60,5；和65,5。马普朗种子提取物（MPSE）的储备溶液于2000年新鲜制备 μg/mL，并通过使用0.2μM注射器过滤器置于生物安全柜下，供进一步研究之用。没食子酸原液;-250 - 6.25μg/mL)和五戊基葡萄糖(PGG;-400 - 6.25μg/mL）用水连续稀释，而没食子酸乙酯（例如：25-500 μg/mL)用DMSO稀释，以获得每个分析物的第七个浓度水平，以制备校准曲线。方法验证按照ICH指南进行[28]．通过计算决定系数(r²)，应大于0.999。分析物的定量是通过测量面积峰来完成的。根据斜坡上响应的标准差(SD)，由校准曲线的信噪比确定检测限(LOD)和定量限(LOQ)。将GA、EG和PGG标准溶液加到500中，鉴定出三种主要的MPSE植物化学成分μg/mL MPSE溶液，最终浓度为10、100和37.5 μ分别g / mL。Ga的数量，例如1000的PGG μg/mL MPSE的面积峰为20μL每名分析员的注射量一式三份。

2.4.MPSE中PGG、EG和GA的LC-MS分析

枸杞籽提取物中没食子苷含量的LC-MS分析μl注射体积为500 μ采用RP-C18 LiChroCART RP-18e色谱柱(125 mm × 4.6 mm, 5μ米)(美国默克公司)。洗脱液为0.1% TFA (A)和100% hplc级乙腈(ACN) (B)(默克)。色谱条件(时间(min)， B(%))为:0,5;5、5;7, 10;12、10;12、10;14、15;19日,15;21日20; 26, 20; 30, 25; 35, 25; 37, 30; 45, 30; 50, 100; 55, 100; 60, 5; and 65, 5. The flow rate was 1 mL/min. Detection was performed with a UV detection system L-7400 LaChrom Merck Hitachi (Merck KGaA) at 270 nm and a Hewlett Packard 1100 Series Diode Array Detector (DAD) (Agilent Technologies, Germany). Mass spectra systems were registered by a Hewlett Packard 1100 MSD SL (Agilent Technologies, USA), operating in nitrogen flow at atmospheric pressure, and by applying the electrical ionization (API-ES) mode. The voltage in the capillary was 4000 V (positive) and 3500 V (negative). The flow rate of nitrogen was 13 L/min, and the temperature was set at 320°C. The scanning range was set at 70–1000 m/z (positive) with an interval of 0.20 m/z.

2.5.细胞系和培养条件

雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7 (ATCC®HTB-22™)，三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 (ATCC®HTB-26™)和正常乳腺上皮细胞MCF-10A (ATCC®CRL-10317™)细胞系均购买自美国类型和培养收集(Manassas, VA, USA)。MCF-10A在添加10%胎牛血清(FBS)、2 mM谷氨酰胺、0.5 mM谷氨酰胺的DMEM/F12中维持μ10 g / mL氢化可的松,μg/mL胰岛素，20 MCF-7和MDA-MB-231细胞在添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，在95%空气增湿空气中，添加5%CO₂在37°C。

2.6。MTT法测定细胞活力

MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵）法测定细胞增殖和MPSE的抑制作用[26]．简单地说，将细胞接种到24孔培养皿中培养24小时，然后用不同浓度的MPSE (0-90μg / mL)。在MPSE孵育24、48、72 h后，加入终浓度为1 mg/mL的MTT溶液，进一步孵育4 h，使福马赞晶体形成。孵育后，每孔中的溶液弃用200μ添加1 L二甲基亚砜以溶解福尔马赞晶体。在560℃下测量福尔马赞溶液的吸光度 通过紫外-可见分光光度计（安捷伦8453，美国）测定细胞存活率与MPSE浓度的关系图，并通过IC测定细胞毒性效应₅₀，指的是与对照组相比，抑制50%细胞生长所需的MPSE浓度。

2.7。流式细胞仪分析细胞周期

采用碘化丙啶(PI)染色分析MPSE诱导的细胞周期分布变化。简而言之，将细胞接种到6孔板中，用不同浓度的MPSE处理24和48小时。孵育期结束后，收集悬浮细胞和贴壁细胞，PBS洗涤，7000 rpm离心1分钟。弃上清，收集微球，用70%乙醇在4℃下固定过夜。随后，用冰冷的PBS清洗固定的细胞，然后用含有0.1% Triton X-100、0.2 mg/mL RNase和10的结合缓冲液染色μ克/毫升的π。染色后的细胞在37℃黑暗中孵育30分钟。最后，采用Beckman Coulter、Epics XL-MCL流式细胞仪对染色细胞进行分析。流式细胞术数据采用FlowJo 10软件进行分析。

2.8。mpse处理的MCF-7细胞内ROS水平的测定

采用双氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法测定细胞内ROS水平。简而言之，2 × 10⁵将细胞接种在6孔板中，培养24小时，使细胞附着。用不同浓度的MPSE处理细胞3、6、9、12和24 h。在此之后，通过胰蛋白酶收获细胞，然后在7000 rpm离心1分钟。弃上清，收集细胞微球。然后用冰冷的PBS洗涤细胞颗粒，用1μM DCFH-DA在37℃下保存30 min，避光。随后，用PBS再次冲洗细胞，立即置冰，然后进行流式细胞仪分析。流式细胞术数据采用FlowJo 10软件进行分析。

2.9。线粒体膜电位(ΔΨm)流式细胞仪分析

采用流式细胞术评价ΔΨm的损失。不同浓度的MPSE孵育12和24 h诱导细胞凋亡，阴性对照在MPSE不孵育的情况下诱导细胞凋亡。收集细胞，7000转/分离心1分钟。丢弃上清，将细胞颗粒重悬于0.5 mL含JC-1染料溶液的PBS中，最终浓度为2.5μ克/毫升。然后细胞颗粒在37°C孵育15分钟。用0.5 mL温PBS再次冲洗样品，然后在488 nm的激发波长下进行流式细胞仪分析。通过JC-1单体分析获得的数据，并在FL1通道和FL2通道中进一步检测JC-1聚集物。

2.10。DAPI染色形态学检测细胞凋亡

采用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染色法检测凋亡细胞的形态特征。简而言之，2 × 10⁵将细胞接种在6孔板中，培养24小时，使细胞附着。用不同浓度的MPSE处理细胞24 h。MPSE处理后，用PBS洗涤细胞，然后用4%甲醛PBS在室温下固定15 min，再用PBS洗涤2次。用含1% BSA和0.2% Triton X-100的渗透缓冲液在PBS中渗透1小时，然后用300 nM DAPI染色液孵育5分钟。在整个过程中，细胞被保护起来不受光照。PBS洗涤细胞两次，荧光显微镜(尼康，Eclipse Ts2)拍照。

2.11。流式细胞仪Annexin-V FITC/PI染色检测细胞凋亡

Annexin-V FITC/PI染色检测凋亡细胞。细胞群很容易被Annexin-V fitc结合的细胞区分，被认为是凋亡的早期迹象，而pi结合的细胞则是坏死的指标。此外，两种染色结合细胞(Annexin-V FITC/PI)均可作为晚期凋亡/坏死的指标。简单地说，以2 × 10的密度播种细胞⁵细胞在6孔板中培养24小时 用不同浓度的MPSE处理细胞，然后孵育24小时 h、 通过胰蛋白酶消化收集细胞，并在7000℃下离心 每分钟转数为1 分钟。丢弃上清液，在用Annexin-V FITC/PI染色之前，用PBS洗涤细胞颗粒。然后将细胞颗粒重新悬浮在100%溶液中 μL的1X binding buffer和5μL的Annexin-V FITC, 10μ加入PI溶液L，直至漩涡完全混合。室温避光孵育15分钟。最后,400年μ加入1X结合缓冲液L，立即通过流式细胞术（Beckman Coulter，Epics XL-MCL）分析样品。每个样本需要10000个细胞才能收集数据。使用FlowJo 10软件分析流式细胞仪数据。荧光分布显示为每个象限中荧光细胞的百分比。

2.12。凋亡相关基因的RT-PCR表达

使用e.z . n.a®总RNA Kit I (Omega Bio-tek，美国)提取总RNA，并根据制造商指南使用ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix with a gDNA Remover Kit (TOYOBO，日本)进行逆转录反应。此外,10μ通过30个循环的PCR得到反应混合物的L。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中溶解，用RedSafe™核酸染色液染色。GAPDH以甘油醛3-磷酸脱氢酶(甘油醛3-磷酸脱氢酶)作为装载对照，认为该基因是一个家政基因。引物序列如下。

Bax.forward primer: 5ʹ- CCC CCG AGA GGT CTT TTT CC- 3ʹ

反向引物：5ʹ-GGA CAT CAG TCG CTT CAG TG-3ʹ

Bcl-2前向底漆：5ʹ-GAA CTG GGG GAG TGT GG-3ʹ

反向引物:5ʹ- TTC ACT TGT GGC CCA GAT AGG- 3ʹ

帕尔普正向引物:5ʹ- GGC AAG CAC AGT GTC AAA GG- 3ʹ

反向引物：5ʹ-GGC TAC CTC TCC CAA TTA CC-3ʹ

GAPDHforward primer: 5ʹ- CACCATCTTCCAGGAGCGAGATC- 3ʹ

反向引物:5ʹ- GTGGTGCAGGAGGCATTGCTGA- 3ʹ

2.13。统计分析

数据表示为至少三个独立实验的平均值±标准偏差（SD）。通过单向分析的差异（ANOVA）进行分析数据，然后进行Tukey的测试，以检测使用OriginPRO 2018软件的每个因素之间的显着差异。价值被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．采用高效液相色谱和质谱联用技术对MPSE中1,2,3,4,6- pentagalyl Glucose (PGG)、没食子酸乙酯(EG)和没食子酸(GA)的活性化合物进行了鉴定

PGG、EG、GA的化学结构如图所示1(一)．PGG、EG和GA对光能的最大吸收波长分别为279 nm、271 nm和270 nm，如图所示1 (c)．选择271 nm和279 nm的吸收波长监测每种分析物的数量，PGG、EG和GA在指定波长下的线性级数方程列于表中1．检测限(LOD)和定量限(LOQ)(见表)1)在279 nm处与EG相似，分别为0.09和0.28μ但LOD和LOQ值分别为271 乙二醇纳米级（LOD） = 0.08 μg/mL，定量限= 0.26μg/mL)略低于PGG (LOD = 0.09)μg/mL，定量限= 0.28μg / ml），而遗传透露在0.11时显示相同的检测限。 μ在271处记录两个波长的g/mL 纳米和279 此外，GA的LOQ值分别为0.34和0.32 μ波长为271时的g/mL 纳米和279 在本研究中，我们证明了马普朗种子提取物（MPSE）由PGG、EG和GA组成，是主要的植物化学物质（图1）1 (b))．在279 nm处检测GA、EG和PGG的保留时间分别为9.00±0.04、24.35±0.15和30.99±0.23 min。三种植物化学成分在1000μg/mL MPSE的标定曲线如表所示1．通过在271 nm处的面积峰，我们得到了PGG、EG和GA的浓度分别为510.60±47.86、306.33±21.06和26.83±1.36μ分别为g/mL。用于测定279处的面积峰 在155.46 nm处，我们获得了PGG、EG和GA的浓度 ± 11.13, 91.72 ± 4.15和15.09 ± 0.98 μ分别g / mL。3种植物化学物质的浓度之和分别为843.10±69.66和843.75±70.28μG / ml分别在271nm和279nm处测定。Maprang种子提取物中发现的三种植物化学物质的百分比为84.37±8.33％（844 μg/mL检测从1000μg/mL，注射量20 μ在没食子苷含量中，PGG的含量最高，为51.1%，其次为EG(30.6%)和GA(2.7%)。

如前所述，通过高效液相色谱分析，PGG、EG和GA被鉴定为maprang种子提取物的三种主要植物化学成分。在本节中，我们使用LC-MS和API-ES阳性模式测定分子质量(m/z)确认了这三个化合物的存在。结果如图所示2和表2．根据MPSE的LC色谱图，如图所示2，共观察到14个化合物峰。然而，14个化合物中的3个，峰号1（Rt 4.764 最低），第2峰（Rt 22.501 最小）和峰值9（Rt 28.671 在Rt为4.764时，鉴定了其分子质量 最小时，m/z比记录为171.1，并确定为没食子酸（GA，分子量170.12 Da）as[GA-H]⁺和其他加合离子[GA-Na]⁺为194.1 m/z。在rt22.501 min，没食子酸乙酯(EG，分子质量198.17 Da)与两个加合离子的结果对应为[EG- h]⁺， 1991 m/z，和[GA-Na]⁺在28.671 min时，该化合物与五戊基葡萄糖(PGG，分子质量940.68 Da)相对应。我们发现了两种形式的PGG，无水的和一水的，可以被纳⁺([PGG-Na]⁺, 963.1 m/z；[PGG.H₂O-Na]⁺， 981.0 m/z)和H⁺([PGG.H₂O-H]⁺, 959.0 m / z)。此外，PGG还能被K包合⁺([PGG-K]⁺, 980.0 与PGG、EG和GA的API-ES阳性模式相关的其他片段和加合产物如表所示2．

３．２．MPSE对人乳腺癌细胞的抗增殖作用

使用MTT法评估MPSE和分离化合物对MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A细胞的细胞毒性作用。如表所示3.和图3.， MPSE抑制MCF7、MDA-MB-231和MCF-10A细胞的增殖均呈浓度依赖性(0-90μg/mL)，随时间变化(24、48、72 h)。MPSE对MCF-7细胞毒性最强，伴有IC₅₀价值6.94 ± 1.57 μ72时的g/mL 与含IC的MDA-MB-231和MCF-10A相比的培养时间₅₀分别为18.92±1.20和30.08±3.70μ分别g / mL。对于MCF-7细胞，MPSE的细胞毒性最强，提示MPSE对MCF-7细胞的抗增殖作用可能是由于粗提物中这些生物活性化合物的协同作用。PGG是MPSE的主要活性成分，在72 h (IC)时对MCF-7和MCF-10A细胞的毒性最小₅₀> 100μg / mL)。然而，PGG对er阴性MDA-MB-231伴IC乳腺癌细胞的细胞毒性作用更为显著₅₀值为26.46±6.53μg/mL，孵育72 h。这些结果提示，MPSE对er阳性MCF-7乳腺癌细胞的细胞毒性作用比er阴性MDA-MB-231细胞更明显。流式细胞仪测定的细胞凋亡百分率支持这一发现。结果显示，与MDA-MB-231细胞相比，MPSE对MCF-7诱导的凋亡细胞死亡比例更高(图)4)．有趣的是，MPSE对乳腺癌细胞的细胞毒性作用比正常乳腺上皮MCF-10A细胞更明显。可以看出，MPSE诱导MCF-7抑制作用生长所需的剂量至少比MCF-10A细胞低4倍。提示MPSE能有效诱导乳腺癌细胞的细胞毒性作用。

３．３．MPSE对乳腺癌细胞MCF-7细胞周期分布的影响

MPSE处理MCF-7细胞24 h的细胞周期分布如图所示5．用30,60和120处理MCF-7细胞 μ24小时的MPSE的g/mL h、 MPSE处理诱导G2/M期细胞周期阻滞，呈剂量依赖性，G2/M期细胞数显著增加( ）从未处理细胞的20.80%到30和60细胞的30.57%和40.20%μg/mL的MPSE。与此同时,在120年μg/mL的MPSE，细胞继续循环为G0/G1期，与60相比，G2/M期细胞数量减少 μMPSE g / mL。这一结果伴随着亚g0 /G1期和S期人群的增加。此外，MPSE处理MCF-7细胞可诱导亚g0 /G1凋亡细胞数量增加，且呈浓度依赖性。值得注意的是，MPSE对MCF-10A细胞系的处理并没有显示MPSE对细胞周期分布的影响(图)5 (c))．

3．4．mpse诱导细胞内ROS生成并触发线粒体膜电位的破坏(ΔΨm)

为了确定细胞内ROS参与MPSE对MCF-7细胞生长抑制作用的细胞机制，2ʹ，7ʹ-二氯荧光素二乙酸酯(H₂荧光探针DCFDA)检测MPSE诱导的细胞内ROS生成。对于暴露于30和60的MCF-7细胞μg/mL的MPSE处理6 h, MPSE处理后绿色荧光强度升高的细胞比例增加，呈浓度依赖性(图)6(一))．MPSE处理MCF-7细胞(30和60μg/mL)孵育0 ~ 24 h，如图所示6，MPE在3-9小时的剂量依赖性方式激发了增加的细胞内RO的产生。随后，该值逐渐减少，重大（ ）24小时还原。相比之下，MPSE对人正常乳腺上皮MCF-10A细胞中ROS的产生影响很小，这与MCF-10A中观察到的线粒体膜电位相关(图)7)．结果表明，mpse诱导的ROS产生导致部分线粒体膜去极化。这些结果解释了MPSE对正常乳腺上皮MCF-10A细胞的低细胞毒性作用。

细胞内氧化应激可能导致线粒体膜电位的破坏(ΔΨm)。ΔΨm缺失提示线粒体膜完整性丧失，这反映在细胞凋亡的初始信号中。为了阐明MPSE诱导的ROS生成是否引发线粒体介导的凋亡，使用JC-1荧光染料在MPSE治疗后12和24小时通过流式细胞术评估线粒体膜通透性(0-120)μg / mL)。采用流式细胞术分析红/绿的荧光强度比(绿色荧光是指低膜电位下的JC-1单体，而红色荧光是指高膜电位下的JC-1聚合)。MPSE处理12 h后，由于单体JC-1的存在，处理后的MCF-7细胞的绿色荧光强度呈剂量依赖性增加，MPSE 15、30、60和120的荧光强度分别为13.90%、23.60%、53.27%和85.93%μ未经处理的细胞显示81.53%的红色荧光和17.80%的绿色荧光，这表明细胞具有较高的Δψm值（图1）8)．在MPSEs处理24 h后，观察到类似的趋势。值得注意的是，MPSE在3-9小时内逐渐诱导ROS生成，当该过程伴随着ΔΨm在12小时的破坏时，在6小时产生显著的ROS。这一发现表明，MPSE处理诱导了过量ROS的产生，导致ΔΨm的破坏，并参与了MCF-7细胞线粒体介导的凋亡。

3．5．mpse诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡

采用DAPI(4′，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸)染色，观察凋亡细胞的形态特征，以确定MPSE是否诱导凋亡细胞死亡。不同浓度的MPSE处理24小时后，MCF-7细胞通过发出明亮的荧光显示出典型的凋亡形态，而片段染色质呈剂量依赖性增加(图)9（a）)．Annexin-V FITC/PI双荧光染色进一步量化凋亡细胞的死亡。细胞凋亡早期指标磷脂酰丝氨酸的外化通过测量Annexin-V结合来分析。MCF-7细胞处理不同浓度(0-120μg/mL)，处理24、48 h。随着MPSE浓度的增加和治疗时间的延长，细胞凋亡的百分比增加(图)9（b）和9（c）)．处理24 h, MCF-7细胞凋亡率从8.01±1.03%增加到44.11±3.18%μg/mL浓度，而48 治疗h后，观察到的百分比更高，为8.8% ± 3.73%和52.90% ± 2.65%的细胞在相同浓度下发生凋亡 治疗后h，这种增加主要归因于促进早期细胞凋亡，而在48小时 h在相同浓度的MPSE处理的MCF-7中，晚期凋亡更为显著（图1）9（c）)这一结果表明，MPSE处理的MCF-7细胞随着处理浓度增加超过24小时而诱导凋亡细胞死亡 H

3.6.MPSE增加Bax/Bcl-2乳腺癌细胞MCF-7的比率

根据细胞凋亡途径，促凋亡的Bax和抗凋亡的Bcl-2作为细胞死亡的启动子或抑制剂在细胞凋亡调控中发挥重要作用。探讨MPSE对凋亡细胞死亡通路相关基因表达的影响，探讨MPSE对凋亡细胞死亡通路相关基因表达的影响Bax.，Bcl-2,帕尔普确定了。在这项研究中，比率Bax/Bcl-2以确定细胞凋亡的发生。根据结果如图所示10，用MPSE处理MCF-7细胞可显著降低Bcl-2以及显著提高的就业水平Bax.浓度依赖性的基因表达。此外，随着浓度的增加Bax/Bcl-2MPSEs处理后MCF-7细胞的比例显著升高。同时，表达水平帕尔普总之，凋亡相关基因表达值发生的一系列变化，以及线粒体膜电位的破坏，表明MPSE可以通过固有的线粒体途径诱导MCF-7细胞凋亡。

4.讨论

今天，许多乳腺癌治疗都未能成功治愈患者，因为为了生存，癌细胞发展，以避免由传统治疗方案诱导的凋亡过程[6]．因此，针对癌细胞的凋亡细胞死亡可能是一种有前途的癌症治疗策略的一部分。目前，植物源药物，无论是基于粗提物还是分离的生物活性化合物，由于其调节细胞凋亡的能力，在癌症治疗方面受到了科学的广泛关注。此外，它们的毒性相对较小，产生副作用的可能性也较小[29，30]．

在本研究中，我们报道了MPSE以剂量和时间依赖性的方式引起细胞毒性作用并抑制乳腺癌细胞(MCF-7)的增殖。相反，MPSE对具有IC的永生化正常乳腺细胞(MCF-10A)的毒性较小₅₀价值超过36.67 μg/mL，提示MPSE是一种很有前途的抗癌药物。此外，mpse诱导的G2/M期阻滞并触发MCF-7乳腺癌细胞系的凋亡信号。我们的发现有助于更好地理解MPSE中的植物化学成分含量与抗癌活性之间的强正相关关系。

MPSE的植物化学分析通过高效液相色谱和液相色谱/质谱分析显示，在提取物中存在一个富含没食子苷的部分，包括五戊基葡萄糖(PGG)。结果表明，该化合物是MPSE的主要活性成分，其次是没食子酸乙酯(EG)和没食子酸(GA)。在此之前，我们的报告公布了maprang (羹大利以75%乙醇为提取溶剂的马蓬草(maprang prieyo)最高(11.92%)，其次为马蓬草(11.72%)和马蓬草(mayongchid)，分别为10.08% [25]．表的方程1通过对三种泰国品种的HPLC分析，将这三种主要化合物标准化，结果如表所示4.计算三种化合物的总含量（%w/w；g GA） + 如 + MPSE的PGG/g值在马普朗湾的99.42%处显示最高，其次是马普朗普里约的80.48%和马荣池的45.92%。基于100%的HPLC分析估计三种植物化学物质的存在 新鲜成熟果实重1.03公斤 千克PGG，0.62 千克乙二醇和0.05 公斤 马普朗湾的GA为0.77 千克PGG，0.50 千克乙二醇和0.04 公斤 maprang prieyo.PGG的GA（MPSE中的主要组件）已被证明对ER+和ER-乳腺癌细胞系都具有抗癌活性。此外，PGG通过抑制细胞周期蛋白D1和影响特定的凋亡相关蛋白如Bax和Bcl-2，诱导T-47D和BT-474细胞的G0/G1期和S期细胞周期停滞和凋亡[31]．PGG还能够通过抑制JAK1-STAT3通路，并通过抗血管生成、抗增殖和诱导凋亡抑制三阴性乳腺异种移植瘤的生长和转移[32]．没食子酸乙酯(EG)是MPSE中的第二大主要生物活性化合物。EG已被证实能抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭。在MDA-MB-231细胞中，通过PI3K/Akt途径调节抑制，而EG则降低了基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)和MMP-9的活性。Bax/Bcl-2比值的变化调节细胞凋亡的诱导[33]．另一种多酚化合物没食子酸(GA)也被发现在MCF-7细胞中具有抗癌活性。该化合物已被证实可通过提高p27水平诱导MCF-7细胞的增殖和凋亡^Kip1p21和^Cip1通过抑制增殖和诱导G2/M期细胞周期阻滞[34]．基于PGG的抗癌特性，例如和GA，其是MPSE中生物活性化合物的主要成分，可以得出结论，MPSE对MCF-7细胞的抗增殖作用可能是由于这些生物活性的存在化合物或其在原油提取物中的协同作用。

为探讨MPSE抗癌作用的分子机制，从细胞周期分布、线粒体膜电位破坏、诱导凋亡及凋亡相关基因等方面进行研究。众所周知，响应DNA损伤或细胞应激的细胞周期阻滞对维持基因组完整性是不可或缺的。细胞周期检查点在控制抑制细胞周期过渡或诱导细胞应激后凋亡信号通路的机制中起着至关重要的作用[35]．细胞周期分析显示，mpse处理的MCF-7细胞在细胞周期的G0/G1和G2/M期阻滞，并在G1以下增加，提示细胞周期阻滞后发生凋亡。这些结果表明，MPSE可能通过剂量依赖性的G2/M期阻滞作用抑制细胞增殖。G2检查点是由多个共同抑制细胞周期蛋白B1/cdc2激酶复合物活性的通路的激活所调节的。此外，p53和p21似乎对维持人类细胞的细胞周期检查点至关重要。在细胞应激或DNA损伤时p53和p21的上调可通过与广泛的cyclin/CDK复合物的相互作用导致细胞周期阻滞在G1, G2或S期，是改变癌症生长的重要关键[36]．Pentagalloyl glucose (PGG)，主要存在于MPSE中，是gallotannin的前体，已被证明可诱导细胞周期阻滞和凋亡[37]此外，Chen等人的一项研究描述了PGG在MCF-7中的抑制作用 PGG通过强烈诱导G1期细胞周期阻滞，逐渐增加G1期细胞周期蛋白/CDK复合物抑制剂p27和p21的水平，导致PGG处理后G0/G1期细胞的积聚，并有助于PGG的抗癌活性[38]我们的初步研究表明，MPSE通过增加p21的表达和抑制细胞周期蛋白B1和D1（未发表；手稿在准备中）在G2/M期诱导细胞周期阻滞。我们还检测了MPSE处理的MCF-7中的各种凋亡标记物 经MPSE处理后，MCF-7 细胞显示浓缩染色质和凋亡小体（图8（a）流式细胞仪Annexin-V FITC分析证实，细胞凋亡率增加。因此，我们的研究结果表明，细胞凋亡诱导和G0/G1和G2/M期细胞周期阻滞均有助于MPSE的抗癌活性。

细胞凋亡是一种基本过程，对组织稳态的开发和维持至关重要。在细胞凋亡过程中涉及两个主要信号传递途径：一种是无线电池无关的途径，另一个是线粒体依赖性途径。通过DNA损伤或ROS增加触发细胞凋亡的线粒体依赖性途径。众所周知，ROS在触发细胞损伤，细胞周期进展和细胞死亡中起着至关重要的作用[39，40]．在本研究中，我们报道了MPSE治疗可影响乳腺癌细胞内ROS的产生和线粒体功能障碍。根据DCFH-DA实验获得的数据，发现MPSE以剂量和时间依赖性的方式增加MCF-7细胞中ROS的产生。早在3 h就开始诱导ROS生成，6 h时达到最大值，12 h时ROS水平逐渐下降至基础水平。这种ROS的减少可能是由于癌细胞保护细胞免受氧化应激的多种适应机制[41]．在氧化应激的上限，当ROS上升到一定水平时，抗氧化系统启动，减少多余的ROS，使ROS水平降至基础状态。因此，MPSE诱导的细胞表面ROS水平在基础值周围呈正或负振荡，这取决于MPSE对ROS产生的功率和细胞抗氧化系统的能力。然而，高浓度MPSE处理MCF-7细胞(60μg/mL)显示在孵育24小时ROS水平增加，这与ΔΨm的下降密切相关(图8)．这种较高的氧化应激可能与线粒体破裂增强有关，因为MPSE诱导了过度的ROS损伤细胞通过氧化线粒体膜中的脂质和受损细胞产生更多的ROS [42]．如结果所示(图8)，MPSE 60岁 μg/mL处理MCF-7细胞系JC-1单体的绿色荧光略有升高，这是线粒体膜破裂和线粒体膜电位破坏的指标。而在MCF-7中，30处理的红/绿荧光强度比变化较少μ克/毫升MPSE。这表明，在浓度为30时μg/mL MPSE时，ROS的产生对线粒体膜的损伤无影响。这一结果表明，60μg/mL MPSE在24小时时ROS生成水平升高 h处理，部分原因是受损细胞释放的ROS增加，这一过程称为ROS诱导的ROS释放（RIRR）[42]然而，必须对线粒体ROS的产生进行进一步深入研究，以证实这一点。线粒体ROS的产生是由mitoSOX与MPSE处理的乳腺癌细胞效应的相关性确定的。

此外，线粒体中产生的ROS与线粒体膜破裂和线粒体膜电位（Δψm）的丧失有关。这一结果随后与促凋亡蛋白的线粒体释放有关[43]．我们观察到MPSE处理后ROS水平升高，以及MPP对MCF-7细胞的破坏。MPSE在MCF-7细胞中以剂量依赖的方式崩溃ΔΨm。这些结果表明，乳腺癌细胞内ROS的增加可能是ΔΨm下降的结果。然后它会通过线粒体途径触发细胞凋亡。此前的一项研究也报道了类似的结果，植物雌激素中富含苷元的提取物可以诱导ROS的增加，从而调节线粒体膜电位，触发和释放某些线粒体促凋亡因子，如细胞色素c，所有这些最终都会激活线粒体介导的凋亡通路[13，44]．

线粒体介导的细胞凋亡受Bcl-2等抗凋亡蛋白和Bax等促凋亡蛋白调控。随后，Bax/Bcl-2比值似乎是细胞存活或死亡的关键决定因素[45]．我们的研究结果显示MPSE治疗可导致Bax.以及对Bcl-2mRNA的表达会触发细胞凋亡的进程。因此，我们推测促凋亡基因和抗凋亡基因比例的变化可能在很大程度上参与了线粒体介导的凋亡通路。Mun等人也报道了类似的结果，他们发现盖拉语Rhois提取物中含有没食子酸甲酯、没食子酸、PGG和没食子苷等重要成分，这些成分均通过切割caspase-3和PARP诱导细胞凋亡，从而抑制结直肠细胞的生存能力;caspase-8、caspase-9、Bcl-2、Bcl-xL表达下调;以及Bax的上调[46]．此外，一些化学制剂如氧化苦参碱已被报道具有抗乳腺癌活性。采用real-time PCR和Western blot方法研究氧化苦参碱对人乳腺癌MCF-7细胞的作用。结果发现氧化苦参碱提高了Bax蛋白的表达，降低了Bcl-2蛋白的表达。氧化苦参碱处理对乳腺癌MCF-7细胞具有促凋亡作用，这种作用与乳腺癌MCF-7细胞的表达上调有关Bax.转录和蛋白表达的下调Bcl-2转录和蛋白表达具有时间和剂量依赖性。这一发现揭示了氧化苦参碱通过介导人乳腺癌MCF-7细胞Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平而促进细胞凋亡[47]．

5.结论

综上所述，我们的研究结果表明，MPSE的主要成分PGG、EG和GA可诱导MCF-7细胞的氧化应激。这一结果导致了线粒体膜通透性的丧失和比例的增加Bax/Bcl-2基因表达，激活线粒体介导的凋亡通路。此外，MPSE还能诱导G2/M期细胞周期阻滞，从而抑制MCF-7细胞增殖。我们的结果表明，从maprang种子中获得的富含没食子酸的提取物可能用于开发一种靶向乳腺癌细胞凋亡通路的替代药物。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

感谢泰国研究基金、泰国（拨款号RDG5750047）和清迈大学提供的财政支持。

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