参附注射液对心肺复苏后猪肾功能的影响

抽象的

目标。通过中性粒细胞明胶酶相关脂质沉积蛋白（NGAL）综合评价参附注射液（SFI）对心肺复苏（CPR）后肾缺血/再灌注损伤（IRI）的保护作用，探讨CPR后早期肾损伤的有效监测。方法．30头健康小型猪随机分为3组:假手术组(SO)N = 6), control (N = 12), and SFI (N = 12). The SO group underwent only catheterization, whereas the control and SFI groups were subjected to program-controlled electrical stimulation to establish a cardiac arrest (CA) model due to ventricular fibrillation. After CPR, the return of spontaneous circulation was achieved. Each animal in the SFI group was intravenously injected with SFI after resuscitation. Haemodynamic parameters were monitored at baseline and 2, 6, 12, and 24 hr after CPR. At each time point, venous blood samples were collected for NGAL, creatinine, and ATPase screening.结果．CA后，在控制动物和SFI组的MAP，CPP，和CO显著降低。However, at 6 hr after CPR, the MAP, CPP, and CO of the animals in the SFI group began to recover gradually; the differences between the control and SFI groups were significant ( ）。心肺复苏术后肾损害在病理检查中表现明显。而SFI组肾损伤程度明显改善，细胞凋亡指数也明显降低。心肺复苏术后血、尿NGAL明显升高。NGAL在对照组中增幅最大，与SFI组有显著差异( ）。SFI可以显着增加CPR后肾组织的ATP酶活性，并改善Caspase-3蛋白表达异常。结论．SFI通过改善能量代谢、抑制细胞凋亡，可有效预防CPR引起的急性肾损伤。

1.介绍

持续改善生活水平和人口老化，心血管和脑血管疾病的发生率每年都在增加。由于心血管事件导致的最常见的死因是心脏骤停（CA）。在美国，每年患有医院外的CA的估计数量为300,000。即使具有成功的心肺复苏（CPR），患者放电后患者的存活率也仍然很低，中位数为4.1％[1］.CPR后通常是由于患有全身性缺血/再灌注损伤（IRI）引起的重要器官的失败，例如心脏，脑或其他重要器官[2]，其中肾衰竭是共同的结果。

参附注射液（SFI）是一种传统的中药溶液，采用现代医药加工技术，以一种名为“参附汤”的中药配方为基础制备而成。参附注射液通常用于治疗休克综合征、心力衰竭和心律失常。动物研究表明SFI可以提高CPR成功率[3.- - - - - -5］.在这项研究中，我们使用了快速，高度敏感和特异性诊断标记的中性粒细胞明胶凝胶酶相关的Lipocalin（NGAL）以检测急性肾损伤，并对CPR后SFI对肾IRI的保护作用进行综合分析。该研究旨在提供理论基础和实验数据，用于发现更有效的措施，以监测与早期CPR相关的肾损伤并改善肾功能。

2。材料和方法

2.1。动物准备

三十个健康的武柱（WZS）MINIPIGS购自北京实验室动物研究中心（牌照号码：SCXK 11-00-002）。MINIPIG在12至14个月内，体重约为（30±2）千克。手术前一天，MINIPIGS接受了禁食，可免费获得水。通过喷射2mg·kg诱导麻醉后⁻¹在耳静脉异丙酚，将动物在一个固定的仰卧位结合在手术台上。The first dose of the anaesthetic drug (3% pentobarbital sodium) was intravenously injected at 30 mg·kg⁻¹·H⁻¹然后保持在8毫克·kg⁻¹·H⁻¹．放置6.5 F气管插管并连接呼吸机(Drager-Evata IV, Dräger，德国)以协助呼吸。呼吸机参数设置如下:吸入氧浓度，21%;换气频率，12次/min;初始潮气量(TV)， 15 mL/kg。采用呼吸监测器(美国呼吸科CO2SMOplus)监测潮末二氧化碳分压(ETPCO2)和TV。调节呼吸频率和TV，使ETPCO2维持在35 ~ 40mmhg范围内。皮肤准备后，将动物连接到心电图机(HP-M1165, Hewlett Packard, USA)进行心电图。在左颈内静脉置入7f鞘，以方便放置双电极临时起搏器至右心室。左股动脉置5f动脉导管至升主动脉，连接压力传感器和HP监护仪测量主动脉压力(AOP)。 A 7 F floating catheter was placed in the left femoral vein all the way to the pulmonary artery to measure the right atrial pressure (RAP) and cardiac output (CO) and to collect blood samples.

2.2。建立心室原纤化模型和实验程序

允许动物在操作后恢复45分钟，并使用随机数表分为以下三组：假手术（SO）（SO）（N = 6), control (N = 12), and SFI (N = 12). Pacemaker leads were inserted into the internal jugular vein catheters of the animals except for those in the SO group and connected to an external medical program-controlled stimulator (GY-600A, China Kaifeng Huanan Instrument Co., Ltd.) for CA. Ventricular fibrillation (V-fib) was induced in the animals by continuous electrical stimulating pulses at 10 ms in an 8 : 1 ratio [6］.室颤的诊断标准是动脉血压突然快速下降和心电图上出现室颤波形。8分钟的室颤后，开始标准的CPR程序(即，30:2压缩/通气比，频率100次/分钟，深度50毫米;放松后让胸部完全反弹，每按压30次后暂停10秒，并在每次300毫升的电视机上用人工气囊通气两次)。使用Q-CPR技术监测CPR质量(HeartStart MRx Monitoring/ de纤颤器，飞利浦，荷兰)[7]. 心肺复苏2分钟后，第一次除颤以150的双向波进行 J（HeartStart MRx监测/除颤器，荷兰飞利浦）。如果不成功，肾上腺素（0.02 mg/kg），然后再进行2分钟的CPR。每隔2分钟监测一次心率10秒 心肺复苏记录。如果在4个除颤周期后未发生自发循环恢复（ROSC），则停止CPR，并允许动物死亡。ROSC的标准如下：血压恢复正常，AOP超过50 毫米汞柱或脉冲压力达到>20 毫米汞柱，持续时间至少为1分钟[8］.对于SFI组，在成功复苏后，静脉注射1ml / kg的SFI;对于对照组，用相同的体积注射生理盐水溶液。所有动物都接受了100％纯氧的机械通气，并监测4小时。如果出现的低血压或室性心律失常，则施用多巴胺或胺碘酮。在监测4小时后，除了保留静脉通路的一套外，所有气管插管和其他动静脉导管都从动物中移除。然后，将微型剂置于笼中并观察24小时。除了所以组中的动物没有接受V-FIB诱导和CPR之外，所有实验程序都是相同的。通过静脉注射一次过量的麻醉药物和氯化钾的组合溶液，在笼式观察24小时后处死所有存活的动物。立即收集相应器官的病理标本。

2.3。监测血流动力学参数

The heart rate (HR), mean arterial pressure (MAP), and CO at baseline and 2, 6, 12, and 24 hr after CPR were monitored and recorded. The CO was examined by injecting a salt solution (4°C) into the right atrium through a central venous catheter using the pulmonary thermodilution method [6]. 在肌酐和NGAL分析的相同时间点采集血液和尿液样本，并记录尿量。

2.4。血液和尿液中的Ngal和肌酐水平

使用酶联免疫吸附测定套件（北京新公式生物科学有限公司）按照制造商的说明，测量血液/血清和尿液中的NGAL水平。每个样品进行两次测试，并且平均用作最终读数。使用比色测定（Labassay TM; Wako Pure Industration Ltd.，Japan）进行血清和尿液中的肌酐水平，根据套件的说明。通过在碱性溶液中通过其与雾化酸的反应产生的亮黄色来检测样品中的肌酸酐水平，以碱性溶液（jaffe反应）。通过在520nm波长下使用分光光度计测量反应的吸光度，并从标准曲线中测定样品中的肌酐浓度。

2.5。测量Na.⁺k⁺-ATPase和CA.²⁺-ATPase活动

处死动物后，解剖肾脏，并纳米⁺k⁺腺苷三磷酸酶（ATP酶）和CA²⁺- 使用特异性分光光度套件（南京江城生物工程研究所）测量酶活性。ATPase活性的一个单元（U）定义为可以分解ATP产生1的每毫克组织蛋白中的ATP酶的量 μ.每小时无机磷的摩尔。

2.6。Western印迹分析

进行蛋白质印迹以检查相关蛋白质（Bcl-2，Bax和活化Caspase-3）的表达水平。从左心室前壁收集心肌组织，通过蛋白质印迹评估Bcl-2，Bax和Caspase-3蛋白表达水平。用于相应蛋白质的抗体浓度及其来源如下：Bax，1：500（Santa Cruz Biotechnology，USA）;BCL-2,1：200（EMD Millipore，USA）;活性Caspase-3,1：500（Abcam Biotechnology，英国）;和GAPDH，1：250（Santa Cruz Biotechnology，USA）。

2.7。组织学测试及分级标本

从肾脏的左上极将组织取出并置于10％中性甲醛溶液。石蜡包埋固定后，脱蜡，切片，和苏木精和伊红（HE）染色，进行了光学显微镜下观察在组织中的病理变化。根据先前报道的方法，病理变化半定量评价通过专业病理学家在显微镜下进行[9］.将样品根据以下标准分级：A级:≤25%的肾小管上皮细胞变性或坏死，肾小球、间质、血管未见异常，≤5个肾小球和间质有慢性变性(纤维化或硬化);B级：>25%，但≤50%的肾小管上皮细胞显示变性和坏死，和/或≤5%显示肾小球自溶和小球和间质轻度变性（纤维化或硬化），大于5%，但≤10%; 和丙级：肾小管上皮细胞≥50％显示变性坏死肾小球和血管内皮细胞变性和核溶胞一起，≥10％显示肾小管基底膜塌陷和/或断裂，并且≥20％表现出简单的退行性改变。从各组动物的左心室石蜡标本以下在试剂盒中提供的说明（Roche Diagnostics公司，德国）的常规TDT介导的生物素化的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法进行了测试。凋亡细胞和细胞的总数量的数量，使用光学显微镜计数五次下放大200倍。The apoptosis index (AI) was calculated using the following formula: AI (%) = number of apoptotic cells/total cell number × 100%.

2.8。统计分析

The statistical analyses were performed using SPSS 10.0 software, and the data are expressed as the (mean ± standard deviation). The measurement data were analysed by analysis of variance of repeated measures, and the count data were analysed with theχ²测试。被认为是统计学意义的。

结果

3.1。评估复苏结果

所以群体中的所有动物都幸存了整个实验程序。对照组中的一种动物和SFI组中的一个动物没有从复苏中恢复。对照组的活性CPR期为（4.9±1.2）分钟，（4.8±1.3）分钟为SFI组，哪些没有显着差异（ ）。

3.2。血液动力学参数（表1）

在基线时，各组之间的血流动力学参数没有显著差异( ）。SO组动物在整个实验过程中各项参数保持稳定。对照组和SFI组CA的HR在复苏后显著增加，而MAP、CPP和CO显著降低。心肺复苏后6小时，SFI组动物的MAP、CPP、CO逐渐恢复，与对照组相比差异有统计学意义( ）。

3.3。肾组织学

在一个光学显微镜下，来自肾脏损伤的疾病迹象的动物的组织，包括肾小管和肾小球毛细血管的拥塞，肾动脉瘤中的肾小球毛细血管，Mesangial增生，炎症细胞浸润和微生物瘤形成。与对照组相比，SFI组的肾损伤显着降低，而在该组中的动物的肾脏病理学中没有发现明显的损害（图1). SO组所有动物的肾脏损伤均为A级。对照组不同程度肾损伤的动物数量如下：A级，0；乙级，3级；SFI组的分级为：A级，1级；乙级,九级;；与对照组相比，SFI组出现C级肾损害的动物数量显著减少(χ² = 7.425, ）。

SO，对照和SFI组的AI（11.01±0.3）％，（47.46±18.67）％，分别为（27.37±16.43）％。与如此组相比，对照和SFI组的AI显着增加（ ）。此外，当我们的控制和SFI组间比较的AI，所述SFI组的AI被显著减少（ ）(图2）。

3.4。与肾功能有关的参数的变化

在整个实验中，与肾功能相关的所有参数仍然是稳定的。复苏后，与那些群体相比，对照和SFI组的尿量显着减少（ ）。然而，SFI组的尿量随着时间的推移逐渐增加，并在6小时时与对照组显著不同 心肺复苏术后数小时( ）。24岁 心肺复苏后，SO组和SFI组的尿量差异消失( ）。在每组中检测到CPR后Cr的轻微增加，但差异并不重要（ ）。与SO组相比，SFI组和对照组CPR后的血、尿NGAL水平显著升高( ）。但是，在对照组中的NGAL水平的增加是更显著和比所述SFI组显著更高（ ）（桌子2）。

3.5。ATP酶活性

na⁺k⁺- 假，控制和SF组的酶活性（8.79±1.07），（2.17±1.45），分别为（5.46±1.23）U / L;加利福尼亚州²⁺-ATPase活性分别为(8.66±1.31)、(3.15±1.24)、(5.678±1.77)U/L。在心肺复苏术后，两种类型的atp酶活性在对照组均显著下降( ），但是，与对照组相比，SF组出现了显著的增加( ）。

3.6. 心肌细胞凋亡相关蛋白的表达水平

SFI和对照组的肾脏中的Bax和活化的Caspase-3表达水平明显高于如此组。Bcl-2和Bcl-2 / Bax水平均显着降低（ ）。与对照组相比，SFI组中的BAX和活化的caspase-3表达水平也明显减少，而SFI显着增加BCL-2和BCL-2 / BAX表达水平（ ）(图3.）。

4。讨论

通过重新分配血液供应来响应CA，以确保足够的血液流向重要的器官，例如心脏和大脑。伴有同时缺血和缺氧的肾动脉的反复收缩可以导致体内抗性激素和儿茶酚胺的分泌增加，这反过来导致肾脏血液灌注和减少肾小球过滤速率（GFR）和尿量减少，最终导致肾脏血液灌注（GFR）和尿量减少在肾小球和管状损伤中。在ROSC之后，恢复身体的正常血液流动，并且血液将血液恢复为整个身体的组织和器官提供。肾动脉反应地将扩张作为对恢复血液供应的反应，这可能导致肾脏再灌注损伤。因此，无论CA的原因如何，肾脏都会遭受因缺血/再灌注反应引起的损害。

CR和血尿尿素氮（BUN）是用于诊断和评估肾功能的传统生物标志物。然而，在检测急性肾损伤方面，Cr在敏感性和迅速效率方面是一个不太理想的标记。事实上，CR只在肾脏损失超过其功能的50％后显示异常。因此，上述诊断方法是有限的，用于治疗肾疾病。在最近的研究中，NGAL被鉴定为一种快速生物标志物，用于诊断急性肾损伤（AKI），具有出色的敏感性和高特异性。与其他生物标志物相结合，例如Cr，NGAL可以显着提高AKI的诊断能力[10］.在大鼠肾缺血-再灌注模型中，肾缺血2小时内尿NGAL产量显著上调[11]. NGAL增加的时间窗口出现在24–48 肾损伤后比血Cr早h；因此，NGAL是早期肾小管损伤的高度敏感生物标记物，可用于诊断各种原因引起的急性肾小管损伤，如肾毒性药物、造影剂、环境毒素和缺血[12］.大多数CA相关的肾脏伤害，尤其是缺氧引起的肾脏损伤，是肾小管损伤。因此，组合NGAL，Cr和BUN的检测测定可以快速更准确地反映肾功能的变化，并提高其肾脏损伤的诊断能力。在我们研究中使用的动物中，CPR后2小时内血液和尿液中的NGAL水平增加，而CR在实验结束之前没有显示出任何显着的变化。因此，NGAL是一种更敏感和有价值的标记，用于评估CPR后的肾损伤。

“申孚汤”最初记录在一本名为“Jisheng裁员”的医学书中，宋代。它主要由人参和川岩组成，并在中国使用了800多年。SFI是使用现代提取技术制备的“Shenfu Soup”的可注射解决方案。SFI已申请各种疾病的临床治疗，其心血管保护作用，例如扩张冠状动脉，稳定血压，减少IRI和改善心功能，特别令人印象深刻。与此同时，它也可以增强身体的免疫功能[3.- - - - - -5]. 现代医学研究已确认SFI的主要成分是人参皂甙和乌头碱。红参和附子具有多种药理作用，如防止缺血缺氧、清除氧自由基、抑制脂质过氧化、降低细胞内钙离子浓度等²⁺过载和稳定膜结构。SFi的其他益处包括降低血液粘度，改善微循环，降低器官缺血性损伤[13］.我们以前的研究证实，SFI还对降低外周电阻，肺动脉抵抗和肺楔压具有出色的效果;越来越多的co;提高组织灌注和氧代谢[14］.在这项研究中，接受SFI的动物表明CPR后CP的增加，这缓解了SVR的血液动力学作用。地图的增加主要是由于CO的增加。随着身体的血流动力学改善，肾灌注反过来缓解，表现为尿量的增加和血液和尿液中的降低。其他研究表明，SFI的一些药理作用，例如还原器官功能障碍和IRI并在复苏后改善身体的血液力学，与其增加NA的能力有关⁺k⁺-ATPase和CA.²⁺-ATPase活动[15，16］.与CPR后肾损伤相关的机制可能与CPR后发生的因素有关，包括中断的能量代谢，无氧自由基损伤，细胞内钙过载和炎症介质损伤[17- - - - - -19］.与上述调查结果一致，我们指出了NA⁺k⁺-ATPase和CA.²⁺- atp酶活性在心肺复苏术后降低，而在SFI治疗后升高。SFI的改善在器官的病理变化上表现为细胞凋亡的减少，其机制可能与调节凋亡的caspase-3通路蛋白的异常表达水平的提高有关。

5.限制

SFI溶液是一种中药混合物，配方相当复杂。本研究未检测溶液中各种成分之间的潜在相互作用。此外，该结果仅在动物模型中进行了测试，SFI在人体中的作用还需要在大规模的临床试验中得到证实。

6。结论

在这项研究中，我们建立了一种猪CA模型，并将SFI应用于成功复苏后肾损伤的治疗干预。使用高敏感，快速，高效，特异性的NGAL测定用于诊断急性肾损伤。在CPR后检查肾脏损伤过程中肾脏的结构，灌注，功能，代谢和病理变化，我们能够确认SFI对CPR相关肾功能损伤的保护作用。该机制可以与SFI改善肾灌注，增加ATP酶活性的能力，并调节Caspase-3途径，从而最终降低细胞凋亡。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

沈昭博士和唐自仁博士作为第一作者对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金的青年项目（美国专利号81601662）;中国福建科技创新联合计划（2016年第2016年）;福建省优秀健康奖学金基金会（20105701）;北京自然科学基金会（7162071）;北京市科技委员会支持的临床研究项目（Z17110000117056）。

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