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黄芩汤对尿液代谢特征指数的影响溃疡性结肠炎基于对UPLC-Q-Exactive Orbitrap质谱MS
Dunfang王，1 Xuran马，1 郭姗姗，1 艳丽王，1 李道，2 邹涤，1 宏鑫歌，1 Weipeng杨
，1
和
永祥戈3
1中国药物研究所，中国医学科学院的中国院士，北京100700，中国
2实验研究中心，中国医学科学院中国美术学院，北京100700，中国
3北京中西医结合医院，北京100039
摘要
作为一款经典的方子，黄芩汤（HQT）已广泛应用于治疗溃疡性结肠炎（UC），但其药理机制尚不清楚。本研究中，首先分析尿液代谢组学探索由TNBS诱发大鼠UC HQT的治疗机制。我们确定了28种受HQT潜在生物标志物，可能导致UC大鼠尿液中代谢的变化，映射的代谢途径的网络，并透露HQT如何影响UC大鼠的代谢。结果表明，UC影响的不饱和脂肪酸和损害三羧酸循环（TCA循环）氨基酸代谢和生物合成。UC通过抑制脂肪酸的运输和破坏氨基酸代谢引起的炎症和胃肠道反应。HQT通过调节氨基酸，脂质，等等，正火代谢紊乱的代谢生物标记的水平起着关键的作用。此外，组织病理学等生物信息学分析进一步证实HQT改变UC大鼠生理，病理，最终影响UC大鼠的代谢功能。
1.简介
溃疡性结肠炎（UC）是一种常见的炎性肠疾病，腹痛，腹泻，粘液，脓液和，持续或反复为主要症状[1]。本病被认为是结肠癌的癌前病变，它已被列为难治性疾病被世界卫生组织之一。人们普遍认为，UC是多种因素的组合，包括遗传学，胃肠道菌群失调，和炎症反应过度[结果2-4]。中医是一个复杂的、互动的系统，经常以方剂(几种不同草药的组合)的形式使用[五]。与化学处理相比，中药有副作用较少的优势，正日益吸引着研究者的关注胃肠疾病的治疗[6]。Huangqin Tang (HQT), a well-known classic prescription for curing diarrhea, is a combination of four herbal medicines 3 : 2 : 2 : 2 by weight, namely,黄芩格奥尔基,芍药颇尔，甘草甘草，和Ziziphus jujuba磨。我们以前的工作中发现，它在UC大鼠模型对肠道粘膜炎症很好的效果[7，8]。
代谢组学的定义是对给定的生物或生物样本中的代谢物进行系统的定性和定量分析[9]，其与基因组，转录，和蛋白质组学一起共同构成“系统生物学” [10，11]。作为一种系统的方法，代谢反映由“自上而下”的策略，并显示在一个整体的上下文引起的干预的完整系统的代谢变化的从代谢网络的终端症状生物体的函数[12，13]。基于lc - ms的代谢组学作为一个新兴领域，经常应用于纯化合物、提取物和复方方剂的毒性研究，是系统评价天然产物毒性和探索毒性机制的好工具。目前代谢毒性研究的重点主要集中在肾毒性、肝毒性、心脏毒性和中枢神经系统毒性[11]。
基于UPLC-代谢也被用于分析体液，这是目前越来越多地考虑在临床研究中，包括肝，肺，胃肠道，糖尿病，泌尿生殖，和其他疾病的新的诊断方法的关键内源性代谢物。同时，新的和更敏感的生物标志物被发现对这些疾病的早期检测和诊断[14-16]。代谢组学的临床应用提供了全面的信息，提高了高通量筛选的患者为疾病状态或风险评估诊断的可行性。最有可能的，临床相关的代谢物的鉴定，可能被视为潜在的新的生物标记物也将帮助与预后的评估，并有助于新的治疗策略的发展[17]。
通过文献检索，有上UPLC-MS与UC结合的代谢组学研究报道较少。因此，本研究采用代谢UPLC-MS技术寻找与UC的生物标志物。与此同时，黄芩汤对UC大鼠的代谢产物的影响进行了分析，并在老鼠可能的代谢途径，揭示进一步阐明HQT在UC的治疗机制。
2.材料和方法
2.1。化学制品
2,4,6-三硝基苯磺酸购自Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，MO，USA）获得。IL-17和PGE2ELISA试剂盒购自上海庞克实业有限公司（上海，中国）。该RNA PCR试剂盒是从宝（大连，中国）采购。甲酸（LC-MS级）从Tedia公司公司公司（费尔菲尔德，OH，USA）购买。乙腈和甲醇（LC-MS级）购自Sigma-Aldrich公司购买。
2.2。动物
Wistar male rats (180–200 g) were obtained from the Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences (Production license no. SCXK 2012-0004). All rats were housed at 23 ± 1.5°C. Animal experiment process was conducted in accordance with the ethical guidelines for local animal care and usage.
2.3。HQT的准备工作
黄芩乔治·我，芍药颇尔，甘草甘草，和Ziziphus jujuba磨机(重量比3:2:3)称量混合。第一次煎液时，将混合液加水(1:10,w/v)回流1.5 h，收集滤液，再将含残渣的水(1:8,w/v)煮沸1 h，收集两批滤液。然后将样品在减压下干燥，得到HQT提取物。采用液相色谱-串联质谱仪(LC-MS)检测处方中的主要活性成分。
2.4。UC大鼠模型构建和分组
TNBS结肠炎的影响根据以前报道的方法[诱导18]。禁食24小时后，用戊巴比妥适度麻醉Wistar大鼠，然后小心将0.56 mm导管插入结肠，导管尖距肛门近8cm。为打破肠上皮屏障，诱发结肠炎，将含50%乙醇和TNBS (100 mg/kg) 0.25 ml的混合试剂缓慢注入管腔，用1ml注射器插入导管。对照组大鼠均给予等量生理盐水。将动物倒立放置2分钟，然后放回笼子。
2.5。血清细胞因子检测
After a ten-day administration, blood samples were collected by the eyelid method and then centrifuged (3,000 rpm, 15 min) to get serum. Production of NO in serum was measured by Griess assay; the levels of proinflammatory cytokines IL-17 and PGE2按照说明书使用ELISA试剂盒检测血清。
2.6。组织学研究
结肠节段被从所有三个组的大鼠收集后，将组织包埋，切片如常。然后，4 μ制备m厚组织切片，苏木精和伊红染色(H&E)进行组织学研究。根据溃疡大小、炎症浸润和结构损伤比较结肠病变的程度。
2.7。反转录PCR
结肠段在液氮中冷冻和研磨。然后，2 μ克RNA用于反转录。对于FABP1和脂肪酸结合蛋白2和GAPDH引物列在表1。此外，将该混合物稀释10倍，和20的最终反应体积 μ升被用于数据分析。反应一式三份运行。FABP1和FABP2的相对水平是由2计算−ΔΔCt方法 [19]。
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2.8。尿样收集
最后一次给药后禁食24小时，次日上午收集尿液，3000rpm离心10 min。每个尿样(50份μL）加入到450 μL乙腈的代理。离心30秒，13000rpm, 4℃离心10分钟。此后,100年µL上清转移到一个自动进样瓶中，用UPLC-Q-Exactive混合四极轨道轨道质谱仪进行分析。流动相为A(0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸铵在水中)和B(乙腈)。梯度过程为:0~ 1min, 95~95% A;1~ 15min, 95%~5% A;15~ 16min, 5%~5% A;16~ 17min, 5%~95% A;17~ 18min, 95%~95% a。样品分析时间为0 ~ 18min。离子源的最佳条件设置为:蒸发温度350℃;护套气体，35 Arb;喷淋电压2.8 kV; auxiliary gas, 10 Arb; capillary temperature, 320°C; and S-lens RF, 50. The compound parameters were set as follows: grade I, full scan (±); resolution, 70,000; maximum TT, 100 ms; and AGC target, 1e6;M / Z，70-1050。
2.9。统计分析
所述mzCloud（赛默飞世尔科技）来获得精确质量[20]。然后，我们用TraceFinder软件（赛默飞世尔科技），以定性分析样品中的每个内源性代谢物的峰面积。接着，识别的离子通过数据库，包括METLIN确认（http://metlin.scripps.edu/），人代谢物组数据库（http://www.hmdb.ca)[21]，以及基因和基因组的京都百科全书（http://www.genome.jp/kegg/ligand.html)[22，23]。使用MetaboAnalyst 4.0来识别判别的代谢物进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）。采用SPSS 11.0（SPSS公司，芝加哥，IL，USA）中的数据进行统计学处理。Øur data were expressed as mean ± standard deviation (SD), and Student’st组间比较采用-检验或单因素方差分析。
2.10。代谢途径分析
潜在生物标记的途径分析（VIP值> 1）使用MBRole评估。关键从通路分析获得的值设定为 。然后，我们使用了Metscape模型，这是利用可视化Cytoscape中化合物，酶之间的相互作用，和基因，以映射相关的UC的主要内源性代谢物的功能性网络。
3.结果
3.1。HQT的化学成分
LC-MS鉴定HQT的主要活性成分。11种主要活性成分化学成分分别为:黄芩苷(10.4149%)、槐甙(2.4179%)、槐甙a -葡萄糖苷(0.8229%)、黄芩苷(0.6754%)、槐甙(0.2215%)、槐甙a(0.0967%)、甘草苷(0.0384%)、异甘草苷(0.0354%)、甘草素(0.0280%)、异屈草苷(0.0865)μ克/毫升），和isoliquiritigein（0.0049％）[24]。
3.2。HQT促进了UC大鼠恢复
通过TNBS诱导的大鼠UC表现出一系列症状3天之内，如精神萎靡，嗜睡，食欲不振，体重减轻，腹泻和脓性凳子。长期HQT曝光后，大鼠对上述症状的反应均显著改善。他们的胃口腹泻减少刺激。模型组大鼠出现症状无明显改善。
3.3。HQT降低血清炎症细胞因子水平
促炎因子NO, IL-17和PGE水平2模型组明显升高。此外，NO、IL-17和PGE水平2在HQT组较模型组中，明显较低（图1)。
(一)
(b)
（C）
3.4。组织学研究
tnbs诱导大鼠结肠黏膜炎性细胞浸润，杯状细胞和上皮细胞丢失或增大，水肿。部分结肠消失了。与UC组比较，HQT组的组织学切片显示，与UC组相比，HQT组的肠道溃疡逐步恢复，炎症细胞浸润和水肿减少(图)2)。
(一)
(b)
（C）
3.5。FABP1和脂肪酸结合蛋白2的mRNA水平
实时PCR分析的结果表明，FABP1的mRNA水平（ ）和脂肪酸结合蛋白2（ ）UC模型大鼠的结肠组织中均高于正常大鼠的显著较低，但可以有效地增加了治疗HQT（图3)。
(一)
(b)
3.6。尿数据的模式识别的多元化分析
使用无监督的PCA从对照组和模型组的尿液分析数据。它可以从图中的得分可以看出图4（a）每一组样本都有一定的聚集趋势。为了获得更理想的组间分离，增强对有助于分类的变量的识别，我们进一步进行了有监督的PLS-DA分析。如图图4（b）模型组显然从正常组分开，并且对大鼠体的正常的生理代谢扰乱。从生理代谢的变化的角度来看，UC模型可以被认为是成功的。在图图4（c），有正常组，模型组，和HQT组之间没有重叠。该HQT组是逐渐接近正常组相比，模型组。它指出，UC大鼠的尿部的内源性代谢图案HQT给药后发生改变，这表明HQT对UC组，调节代谢异常有一定疗效。UC车型的质量参数为准确性，0.8947;[R2，0.8255;和Q2，0.6065。
(一)
(b)
（C）
（d）
3.7。识别潜在的生物标记
在PLS-DA模式，28个变量（VIP> 1.0）被确定为代谢标记，如表2和3。与正常组，模型组，L-异亮氨酸，焦谷氨酸，L-组氨酸，4-羟基脯氨酸，3-甲基组氨酸，γ-氨基丁酸，L-缬氨酸，L-脯氨酸，L-亮氨酸，甘氨酸，米相比-methylhippuric酸，5-羟基吲哚乙酸，1,2,3-丙烷三羧酸，乙醇胺，己二酸，和4-羟基苯乙酸进行显著升高;花生四烯酸，棕榈油酸，α-亚麻酸，油酸等进行显著降低。HQT干预后，上述多路延迟代谢物具有接近正常水平的倾向，表明HQT对上述代谢物的调节效果。然而，己二酸，4-羟基脯氨酸等，没办法药物处理后的正常值。考虑其原因可能如下：在一方面，处理时间仍然是短;在另一方面，疾病的变化还需要一定的过程。
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与正常的控制;
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与模型组。箭头表示模型组与对照组相比升高(↑)或下降(↓)代谢物，HQT组与模型组相比。 |
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3.8。潜在生物标志物的相关及聚类分析
潜在分子标记的趋势之间的相关性以热图的形式显示(图)五)。水平和垂直轴代表的内源性物质的可变信息中，光颜色表示弱的相关性，和深色反映强的相关性。蓝色表示负相关性，红色表示正相关。越接近的相关值是1，则两个分子之间越相似的趋势是。相反，相关性小于零，这表明两种分子标记之间的变化趋势是相反的。如图五，模型组氨基酸和有机酸积累呈上升趋势，脂肪酸积累呈下降趋势。
3.9。多元化ROC曲线的探索性分析
筛选临床诊断泌尿潜在生物标志物的代谢组学的一项重要任务，并采用ROC曲线来评价的生物标志物诊断的准确率已经成功在许多研究[25，26]。0.9和0.7之间AUC表示的生物标志物的诊断的准确性。与AUC值大于0.9的生物标志物是高度精确的。如图6中，AUC值是> 0.9，和诊断的敏感性和特异性高，表明用作疾病诊断标志物的代谢产物具有高的临床诊断价值。
(一)
(b)
3.10。代谢途径分析
共有8条代谢途径(值 ）与UC尿液中的影响。这些途径包括缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，不饱和脂肪酸，精氨酸和脯氨酸代谢，和ABC转运生物合成（表4)。上述途径可能是HQT暴露10天后内源性物质代谢变化的潜在机制。此外，几种主要的代谢紊乱是串联的，表明UC是一种涉及多种代谢紊乱的疾病(图)7和8)。
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4。讨论
本研究试图通过UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS高灵敏度检测平台从代谢角度阐明复杂的病理生理过程。监测这些差异代谢物有助于进一步了解HQT对UC的作用机制。下面将讨论上述潜在分子的分子标记的生物学意义。
4.1。在UC大鼠HQT对氨基酸代谢
氨基酸是构成蛋白质分子，是人体必需的营养物质的一个基本功能单元。在UC模型组中，所述氨基酸的含量普遍增加。一些学者提出，体可以通过分解蛋白修复受损粘膜，引起氨基酸积累[27]。亮氨酸和异亮氨酸以特殊的方式促进机体合成代谢(肌肉生长)，缓解肌肉分解，在骨骼肌微损伤的修复中发挥重要作用[28]。中国中医认为，腹泻表现为运输损失，缺乏的精微物质，没有肌肉生长，乏力，消瘦等，这些症状与尿液中的异亮氨酸，缬氨酸的过度流失，和亮氨酸相关的，这可能会导致缺乏营养。
近年来，研究表明组氨酸和甘氨酸具有抗氧化和抗炎作用。它们被用于治疗消化性溃疡、贫血和过敏等疾病。对于胃肠道炎症的治疗，组氨酸可以发挥抗炎作用，排除毒素，从而增强机体的抗氧化能力[29]。
-氨基丁酸(GABA)是一种活性氨基酸，是胃肠道神经系统中一种重要的抑制性神经递质[三十]。GABA调节中枢神经系统，促进大脑皮质功能和自主神经功能的恢复，增强肠胃蠕动[31]。模型组GABA含量明显升高，提示大鼠胃肠神经系统异常。这也可能是UC大鼠胃肠功能障碍的主要原因。给予HQT后，GABA含量显著增加。HQT可通过调节GABA提高胃肠道敏感性，从而改善腹泻。
4.2。对脂肪酸合成HQT的影响和FABPs在UC大鼠
亚油酸是一种功能性多不饱和脂肪酸，增强人体的免疫功能。它主要用于增加生产的非特异性抗体，促进淋巴细胞增殖，增强吞噬细胞的吞噬能力。亚油酸可以增加的IgG，IgA和IgM抗体从鼠分泌肠淋巴结和脾脏淋巴细胞，减少炎性细胞因子的释放[32]。本研究结果显示，模型组尿亚油酸水平明显降低，炎症因子IL-17、PGE水平降低2，血清NO升高，提示炎症因子升高可能与亚油酸水平降低有关。
同时，图7显示花生四烯酸水平与长链酰基辅酶A连接酶的表达高度相关。减小花生四烯酸可影响脂肪酸合成，与代谢途径分析是一致的。在尿液，亚油酸的水平，α亚麻酸，和油酸，密切相关的长链脂酰辅酶A合成酶的活性，也呈减弱趋势。结果表明，脂肪酸合成通过UC干扰。另外，脂肪酸的输送被认为是由所述FABP家族来执行，并且FABPs活化可以脂肪酸增加的摄取[33]。结果表明，FABP1和脂肪酸结合蛋白2在发炎的UC黏膜下调。这表明，FABP1和FABP2的基因受到抑制，影响脂肪酸摄取。这也印证了ABC转运蛋白的代谢途径。后10天暴露于HQT，花生四烯酸，亚油酸，α-亚麻酸、油酸、FABP1、FABP2表达上调，说明HQT深刻调控了被破坏的脂肪酸合成和代谢。
4.3。HQT对UC大鼠TCA循环和能量供应的影响
葡萄糖，丙酮酸，和富马酸是TCA循环重要的内源性物质。丙酮酸和富马酸的比例显着低于在正常大鼠和葡萄糖和乳酸的比例分别为比在对照大鼠更高（表3和五)。结果说明，它可能已经造成损害TCA循环。在UC乳酸的增加的趋势可以验证的假设，即从无氧糖酵解大鼠取得能量，因此，即使在有氧条件下产生乳酸[34]。
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与正常的控制;
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与模型组。箭头表示模型组与对照组相比升高(↑)或下降(↓)代谢物，HQT组与模型组相比。 |
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肌酸为肌肉和神经细胞提供能量。它是一种天然存在于脊椎动物体内的含氮有机酸[35]。由于体内储存的ATP很少，现有的ATP会在运动中很快被消耗掉。肌酸能快速合成ATP，提供能量满足身体的运动[36]。洛蒂格[37认为UC是一种能量缺乏的疾病。UC大鼠体内大量ATP消耗，肌酸迅速合成ATP提供能量，这可能是UC大鼠肌酸水平下降的主要原因。肌酸水平的下降也是ATP供应不足的另一表现。
本研究从代谢组学的角度探讨HQT在UC大鼠中的作用机制。它通过调节多种代谢途径发挥作用，如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、不饱和脂肪酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸的代谢以及ABC转运体。它体现了中药复方的多靶点、协同等特点。除氨基酸、脂类等成分外，胆固醇硫酸酯、2-甲基马尿酸、4-羟基苯乙酸等成分也会影响UC的进展。
在这个实验中获得的生物标志物UC有共同之处诊所[38，39]。精氨酸和脯氨酸代谢和甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢是他们共同的途径，这证明了UC的发展是关系到上述代谢途径。此外，HQT有不同程度的上述生物标记物的监管。这些生物标记主要是氨基酸，神经递质和脂肪酸。这些生物标记是类似于UC人类相关的那些。因此，我们推测，HQT可以通过调节上述代谢途径的工作。对于这部分的猜测还需要与目标代谢组学研究相结合来进行验证。其次，蛋白质组学，转录和其他生物的实验方法来详细探讨这些生物标志物的生物学意义。
数据可用性
目前的研究中使用和分析数据集的服务或合理要求通讯作者。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
作者的贡献
Dunfang王Xuran马同等贡献这项工作。
致谢
这项工作是由中国国家自然科学基金（编号81273662和81473592）和基本科研业务费专项资金中央公共福利研究所（zxkt17029和zxkt18016）的支持。
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