文摘

Qu-Zhuo-Tong-Bi (QZTB)是一个经验主义传统中药处方治疗急性痛风性关节炎的临床在中国大陆没有严重副作用。然而,生化机制产生的治疗作用QZTB治疗急性痛风性关节炎和对复发性攻击的影响仍然未知。在这项研究中,我们调查的抗炎、镇痛作用QZTB在大鼠急性痛风性关节炎和复发性攻击,以及底层机制。痛风性关节炎模型建立了关节内注射谷氨酸钠尿酸盐(MSU)晶体悬架(2毫克/ 50μL)的右脚踝关节的雄性SD雄性大鼠(SD)中。QZTB(500毫克/公斤)和阳性对照药物meloxicam被填喂法管理为7天前,一天两次或3天后,第一MSU注入不同的实验,分别。好像疼痛的镇痛效果评估行为和后爪机械撤出阈值测试。抗炎活动被脚踝肿胀测量评估,组织学检查,NLRP3 inflammasome,和炎性细胞因子的表达。免疫印迹和定量实时PCR被用来检测蛋白质和mRNA表达NLRP3。il - 1β和肿瘤坏死因子-α水平血清中检测到酶联免疫吸附试验(ELISA)。QZTB可以抑制脚踝肿胀和滑膜炎症MSU-induced痛风性关节炎大鼠模型。QZTB缓解急性痛风性关节炎的攻击和防止复发性攻击。此外,QZTB治疗显著降低NLRP3信使rna和蛋白质含量,以及il - 1、TNF -的生产α踝关节的大鼠模型。总的来说,这些结果表明,QZTB可能是一个有前途的草药配方对痛风性关节炎的预防和治疗。

1。介绍

痛风性关节炎是一种炎症性疾病有单钠尿酸盐沉积造成的关节(MSU)晶体,与嘌呤代谢紊乱(1,2]。特点是高血清尿酸水平,急性炎症、肿胀的一个或多个滑膜关节,和严重的疼痛,它通常是第一个痛风的临床表现3]。痛风性关节炎反复发作可导致痛风石的形成和密集的水晶矿床周围纤维组织,导致毁容,骨质破坏,和残疾4]。痛风的管理,尤其是慢性痛风性关节炎反复急性发作,仍然是一个问题得到解决(5]。成员NLRP3 inflammasome nucleotide-binding寡聚化域——(点头)像受体(NLR)家庭,扮演着关键的角色在痛风性关节炎和许多病理炎症条件(6,7]。目前的研究表明,密歇根州立大学晶体触发炎症反应的激活NLRP3 inflammasome,促进il - 1β生产。il - 1β可以激活其他促炎细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),这是至关重要的起始和传播炎症反应在痛风性关节炎8,9]。化合物,如非甾体类抗炎药物,包括萘普生和吲哚美辛,秋水仙素、糖皮质激素,或它们的组合,推荐为一线系统性治疗急性痛风性关节炎(1,10]。然而,这些药物相关的严重副作用,包括慢性肾毒性、消化道出血,肝损害(11]。

中药(TCM)是一个重要的补充和替代医学的一部分,已广泛应用于治疗痛风性关节炎和应对复杂的病理状态的痛风在不同阶段(12]。我们先前的研究显示,Qu-Zhuo-Tong-Bi (QZTB),实证传统中药处方,对痛风性关节炎治疗高尿酸血和有明确的影响较低的不良反应(13]。此外,QZTB是临床经验丰富的处方,它在中国被广泛用于类风湿患者。其他的功能QZTB,如加强肾脏功能,促进血液循环,缓解疼痛,也被临床证明(13- - - - - -15]。然而,这种现象的潜在机制的anti-gouty关节炎和镇痛属性仍然是模糊的。

在这里,探讨急性anti-gouty关节炎和镇痛的效果QZTB我们应用MSU crystal-induced动物模型。我们进一步研究了其对第二痛风发作的复发的影响。我们的结果表明,QZTB有可能强劲的抗炎、镇痛效果和防止复发性痛风性关节炎的发作。抗炎的机制QZTB可能会导致抑制活化的NLRP3 inflammasome。

2。方法

2.1。动物

雄性sd雄性大鼠中体重(180±20 g)购自浙江中医药大学实验动物中心(SCXK (Yu) 2005 - 3001年,浙江省,中国公关)。他们适应了一个星期在一个标准的光,温度控制在22±2°C, 55年±10%相对湿度12 h暗光周期,他们自由地喂食了充足的食物和水。动物治疗和照顾按照实验动物管理的指导方针国家科学技术委员会颁发的中华人民共和国。实验协议是我们部门伦理委员会批准。

2.2。准备工作的QZTB和试剂

在我们之前的论文报道13,16,17),QZTB是由土茯苓(杜甫凌,60克),薯蓣属septemloba研究。(Bi谢,30 g),Maydis耻辱徐(Yu Mi, 15克),薏苡仁任(Mi, 30 g),Alismatis粉末(泽谢,15克),Humulus飞(15克),Parasitc桑(唱盛霁,15克),草Siegesbeckiae曹(Xi钱,18 g),紫堇属之植物根茎(Yan胡锦涛锁,18 g),姜黄(江黄12 g)柑橘类的书(12 g)。草药都是首先浸泡在10次蒸馏的水的总重量1 h,然后用蒸馏水提取两次下回流2 h。过滤提取集中使用一个旋转蒸发器在50°C和冷冻干燥成粉末(QZTB)。所有的草药都采购从医疗有限公司,有限公司,浙江中国医科大学(杭州,浙江,中国)。Meloxicam购买从华东制药有限公司,杭州,中国。的QZTB粉和meloxicam溶解在0.5%羧甲基纤维素在磷酸盐所需的浓度。新的解决方案是在每个实验之前准备的。去离子水的纯化是Milli-Q系统(美国贝德福德微孔)。其他试剂均为分析纯,在当地采购。抗体对NLRP3猫(# 15101)β肌动蛋白(猫# 4970)从细胞信号技术(丹弗斯,MA)。细胞因子il - 1的水平β(化学猫# 583311,开曼公司,美国)和肿瘤坏死因子-α(化学猫# 500850,开曼公司,美国)测量了酶联免疫吸附试验(ELISA)包根据制造商的指示。RNA隔离设备是从试剂盒(猫# 300112,表达载体、钙、美国)。

2.3。痛风性关节炎的感应MSU晶体和医学治疗

2.3.1。密歇根州立大学晶体的合成

密歇根州立大学晶体被报道之前的准备18- - - - - -20.]。短暂,约4 g的尿酸溶解,加热在800毫升H₂O与氢氧化钠(9毫升/ 0.5 N),调整pH值8.9 60°C,冷却一夜之间在寒冷的房间,洗净,晒干。针状晶体,悬浮在无菌生理盐水中被发现。

2.3.2。密歇根州立大学Crystal-Induced痛风性关节炎的动物

成年雄性SD雄性大鼠随机分为以下5个组,由6 - 8的动物:(1)虚假的集团(假的),(2)痛风性关节炎模型组MSU晶体注入(密歇根州立大学+车辆),(3)QZTB治疗组(500毫克/公斤体重)与MSU水晶注入(密歇根州立大学+QZTB),(4)meloxicam-treated组(3毫克/公斤体重)与MSU水晶注入(密歇根州立大学+ meloxicam)。0.2毫升(4毫克)MSU水晶悬挂注入了右脚踝关节(19,21]。为了评估预防功效,QZTB(500毫克/公斤)和meloxicam(3毫克/公斤)是口头管理对MSU注入前7天,一天两次。在第二个实验中,QZTB(500毫克/公斤)和meloxicam(3毫克/公斤)是口头管理第一次注射后3天MSU水晶悬挂。治疗后QZTB,没有证据表明在任何研究小组观察系统性不良反应。的剂量QZTB在这项研究中的应用是基于以前的研究中使用的那些,和meloxicam药物的剂量计算基于大鼠的体重14,15,22]。QZTB和meloxicam悬浮在0.5%羧甲基纤维素在磷酸盐和管理。

2.4。测量的脚踝肿胀

炎症是量化通过测量使用数字卡尺脚踝厚度(毫米)在不同时间点为每个老鼠之前和5 h, 24小时,30 h, 48 h后MSU水晶注射在第一个实验中。结果表示为脚踝厚度的测试值。最后实验周期(48小时)第一或第二MSU水晶注射后,分别,老鼠被异氟烷过量安乐死。从眼眶静脉血样采集后24 h MSU水晶注入和离心机在3000转10分钟在4°C,和血清收集和储存在−80°C,直到进一步的测试。

2.5。动物被评估为痛觉过敏(碰触诱发痛和明显的疼痛,如行为)Post-MSU注入

测量碰触诱发痛(爪撤军阈值显著降低(佩恩表的编制者)与基线值)进行了通过使用先前报道得·冯·弗雷单丝(23]。行为测试(n= 6 - 8动物/组)进行了16 h后注入MSU的审查员蒙蔽了。动物被放置在一个室与网状金属地板(20×30厘米),由一个不透明的塑料圆顶10厘米高,和总是可以适应任何测试前1 h。退出对触觉刺激阈值测量的冯·弗雷头发弯曲力从2.0到26克的老鼠。刺激是应用于跖侧表面后爪。每根头发都是缩进在midplantar皮肤,直到它只是弯曲。清晰的爪撤军,摇晃,或者舔视为nociception-like响应。8 g的灯丝是第一次使用。刺激应用五次为每个审判(几秒)的间隔至少5分钟。下纤维的强度降低如果动物反应或增加动物没有回应。最小的力量,诱发疼痛的反应至少三次的五个试验被认为是机械撤出阈值。 Animals that did not respond to all filaments were given a maximal strength of 26.0 g. Overt pain-like behaviors induced by MSU injection were assessed using a standing scale from 0 to 3, as previously described by Coderre and Wall and dos Santos et al. [24,25)(0:同等重量后爪;1:完全在地板上,但脚趾不是传播;2:脚卷只有脚轻轻触碰地上部分;3:脚完全升高)。

2.6。组织学检查

最后实验周期(48小时)第一或第二MSU水晶注射后,分别老鼠深深使用戊巴比妥钠麻醉(60毫克/公斤,i.p)。老鼠孤立的踝关节,neutral-buffered 10%福尔马林固定,然后脱钙与乙二胺四乙酸(EDTA) 3 - 4周,如前所述[26]。在12个部分被削减μ从矢状面,然后嵌入在石蜡进行组织学分析。石蜡切片是苏木精和伊红染色())。的部分进行评估通过分析细胞浸润,血管翳形成,和软骨损伤。

2.7。炎性细胞因子的测定

il - 1β痛风的关键细胞因子,由密歇根州立大学晶体触发NLRP3 inflammasome [27]。评估的抗炎作用QZTB治疗的老鼠,我们测量了炎性细胞因子。血样孵化在室温下30分钟凝块,然后在3000转离心10分钟在4°C。上血清转移到1.5毫升微型离心机管和存储−80°C,直到进一步的应用。肿瘤坏死因子的水平α和il - 1β在测量血清酶联免疫吸附试验(ELISA)包(开曼化学品公司、美国)根据制造商的协议。吸光度是阅读在使用标450海里。

2.8。表达NLRP3 Inflammasome在脚踝关节

2.8.1发布。定量实时聚合酶链反应分析

总RNA分离治疗脚踝关节使用试剂盒试剂(表达载体、钙、美国),和核糖核酸的浓度决定使用NanoDrop 2000(美国热费希尔科学、威明顿、德)。0.5μg的rna是reverse-transcribed cDNA cDNA逆转录工具包(Bio-Rad、钙、美国)。使用SYBR绿色PCR定量PCR扩增了主人混合(Bio-Rad、钙、美国)。老鼠NLRP3和引物β肌动蛋白是由Sangon合成生物技术(上海,中国)。引物序列见表1。实时PCR实验都是运行在四。NLRP3的信使rna表达水平进行了分析使用ΔΔCt正常化后比较量化方法β肌动蛋白。

2.8.2。免疫印迹分析

脚踝关节收集并使用液氮磨成粉末。联合粉被转移到1.5毫升埃普多夫(EP)管和细胞溶解在寒冷的裂解缓冲包含1毫米phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)。样品被漩涡高速15年代,在冰上孵化15分钟,再涡在高速15 s。离心后(15000克15分钟在4°C),上层清液中总蛋白获得量化使用BCA蛋白质分析工具包(Tiangen生物技术有限公司,中国),根据制造商的指示。蛋白质是混合了5 x加载缓冲区和加热在100°C 3分钟变性。免疫印迹然后执行使用10% sds - page。蛋白质被转移到PVDF膜(德国默克)(83毫米×75毫米)。1 h后阻止5%脱脂奶粉溶解在PBST渐变20(0.05%),膜被单独孵化主要抗体在一夜之间在4°C,然后用二次孵化抗体1 h。数据分析通过使用分子微分析软件(美国加州Bio-Rad实验室、大力神),和量化水平正常化各自的印迹β肌动蛋白。

2.9。统计分析

结果表示为均值±sem,然后分析了GraphPad Prism 8.0 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。采用单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett为多个比较或未配对的测试学生的t双官能团的比较测试,值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。预处理的效果QZTB在密歇根州立大学Crystal-Induced脚踝肿胀

评估的影响QZTB在急性痛风的模型,我们管理QZTB每天口服500毫克/公斤两次7天前MSU水晶注入(图1)。的用量QZTB就足以显著降低踝关节肿胀的初步实验。5 0 h, h, 24 h, 30 h, 48 h后第一个MSU水晶注入,我们测量了脚踝的厚度MSU crystal-induced老鼠。如图1没有区别,脚踝直径在所有实验大鼠模型建立之前。密歇根州立大学晶体注入造成脚踝直径的增加;肿胀达到最大24小时但逐渐减少30 h和48 h,而QZTB(500毫克/公斤)和meloxicam(3毫克/公斤)治疗显著降低了脚踝肿胀。QZTB能够抑制水肿,抑制活动( )5小时,24小时,30 h,和密歇根州立大学48 h后注入24.5,28.5,16.5,分别和22.7%的抑制。我们的研究表明,预处理QZTB能够防止脚踝肿胀由注入密西根州立大学晶体中的老鼠,证实了其临床使用。

3.2。预处理的QZTB减毒MSU Crystal-Induced关节炎疼痛,如行为和机械触诱发痛

确定预处理QZTB防止关节炎疼痛,如行为和发展机械异常性疼痛,疼痛,如行为和异常性疼痛测试进行4小时或16小时后第一个MSU注入,分别。我们发现MSU注入导致增加疼痛,如行为评分( )和著名的机械触诱发痛( ),如MSU-vehicle集团在图所示2。预处理的QZTB和meloxicam减少疼痛,如行为分数和增加了爪子提取阈值,如图2。

3.3。QZTB减毒第二注射MSU Crystal-Induced关节炎复发疼痛,如行为和机械触诱发痛

痛风性关节炎反复发作的诊所的一个突出问题。确定影响复发的攻击,QZTB进行了第一次注射后3天MSU晶体。脚踝厚度测量每个MSU注射后24小时。疼痛,如行为和机械触诱发痛测试每4小时或16小时后注入密西根州立大学晶体,分别(图3(一个))。我们发现QZTB抑制关节水肿( )和疼痛,如行为评分( )和增加了爪子撤军阈值( )在第二次注射MSU水晶,如图3 (b)- - - - - -3 (d)。的抑制作用QZTB也比较和规范化第一注入密西根州立大学,如图3 (e)- - - - - -3 (g)。

3.4。的影响QZTB在密歇根州立大学Crystal-Induced脚踝组织学表现

进一步评估anti-gouty关节炎的活动QZTB、关节滑膜和周围组织从踝关节和分析使用)染色。如图4组织学分析显示,没有炎症和炎性细胞的浸润踝关节对照组。大剂量注射的密歇根州立大学晶体(2毫克),痛风性关节炎大鼠显示明显的关节炎症,炎症细胞浸润,和增生滑膜。这些病理状态被处理在一定程度上改善QZTB和meloxicam。虽然轻微增生的滑膜组织中观察到QZTB组,预处理QZTB可以抑制炎症细胞的浸润,减轻症状MSU crystal-induced急性关节炎与模型组相比。

3.5。的影响QZTB在表达NLRP3脚踝关节

NLRP3 inflammasome被建议作为一种重要的炎症疾病控制的目标。调查是否QZTB调节NLRP3的表达,我们发现两个信使rna和蛋白质水平的NLRP3 qPCR和免疫印迹,分别。

如图5,与正常组相比,MSU诱导晶体的upregulation NLRP3 mRNA和蛋白表达水平在老鼠的脚踝( )。QZTB可以抑制mRNA ( )和蛋白表达( )水平的NLRP3 MSU-induced模型组相比。Meloxicam也可以减少NLRP3的mRNA和蛋白表达水平在MSU-induced痛风关节炎大鼠踝关节。

3.6。的影响QZTB在Interleukin-1β(il - 1β)和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)生产

据报道,NLRP3激活可能导致增加释放il - 1β和肿瘤坏死因子-α。如图6,海拔在血清il - 1的含量β( )和肿瘤坏死因子-α( )同时观察MSU-induced老鼠。MSU-induced组相比,meloxicam治疗(3毫克/公斤)导致降低血清il - 1β( )和肿瘤坏死因子-α( )的水平。QZTB抑制血清il - 1β( )和肿瘤坏死因子-α( )水平(图6在密歇根州立大学crystal-induced老鼠,暗示QZTB可以抑制NLRP3途径导致这种急性痛风关节炎模型。这些数据表明QZTB可以减弱MSU-induced炎症抑制il - 1的产品吗β和肿瘤坏死因子-α的水平。

4所示。讨论

QZTB是一个实证中医对痛风性关节炎的临床治疗处方。在最近的研究中,的镇痛和抗炎作用QZTB在密歇根州立大学研究crystal-induced老鼠,其潜在的机制进一步调查。我们的结果表明,QZTB可以抑制关节肿胀、疼痛,如行为,造成的异常性疼痛MSU crystal-induced炎症,以及关节炎症,炎性细胞浸润,增生滑膜。效果由QZTBmeloxicam相提并论,这是最常用的药物对痛风性关节炎的临床治疗。此外,QZTB可以缓解痛风性关节炎的复发,这是一个重要的问题在诊所。NLRP3的抑制QZTB的mRNA和蛋白表达下降,证明NLRP3踝关节,和较低的血清il - 1的生产β和肿瘤坏死因子-α水平,进一步表明的功效QZTB在诊所痛风性关节炎。

急性痛风发作期间,受影响的联合展览炎症的典型症状,尤其是影响关节的剧烈的疼痛。急性痛风发作可引起剧烈疼痛,有些病人甚至有截肢的欲望受影响的肢体(28]。痛风性关节炎反复攻击仍然是一个具有挑战性的问题。随着时间间隔缩短,痛风性关节炎,俗称第一痛风的临床表现,可能发展为慢性关节炎和最终导致生活质量下降3,29日]。此外,在urate-lowering治疗的早期(过错),它总是与急性和复发有关痛风的攻击和攻击的预防是必要的(30.,31日]。因此,痛风性关节炎治疗的目标不仅是降低血清尿酸水平和终止急性发作也防止痛风性关节炎反复攻击和并发症32]。然而,非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),秋水仙碱,或皮质类固醇通常是推荐的6个月甚至更长的时间来防止复发(33]。病人应仔细监控不利影响,尤其是对患者肾功能障碍。秋水仙素经常引起肠胃不适,肾脏损害,骨髓抑制等不良反应。非甾体抗炎药可引起消化道出血、肾功能损害和心血管事件(11]。长期使用激素会导致内分泌代谢紊乱和消化系统和心血管并发症。这些副作用在一定程度上影响了病人的依从性;因此,补充和替代药物是可取的。在这里,我们发现QZTB可以缓解疼痛,如行为和密歇根州立大学的关节内注射引起的异常性疼痛。值得注意的是,QZTB防止肿胀、疼痛,如行为和异常性疼痛引起的第二个注入密西根州立大学,这意味着QZTB也可能影响痛风性关节炎的复发。

痛风性关节炎是一种炎症性疾病引起的沉积MSU水晶关节的血清尿酸水平增加。尿酸和密歇根州立大学从组织或细胞损伤可以激活释放nod样受体家族(pyrin域包含3,NLRP3)。蛋白质复合体的NLRP3 inflammasome,据报道在痛风性关节炎MSU-induced发挥着重要作用(6,34]。在这里,我们发现QZTBNLRP3信使rna和蛋白质含量降低,这可能归因于其对降低尿酸的影响报道在我们之前的研究13]。激活NLRP3诱发procaspase-1主动caspase-1的转换,进而不活跃的前驱细胞因子pro-IL-1劈开β为促炎的il - 1β(27]。il - 1的激活β信号通路导致转录的促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α,最终导致炎症反应。符合这些结果,我们进一步证明QZTB减少肿瘤坏死因子-α和il - 1β水平,大大减轻的证明QZTB疼痛和脚踝肿胀。因此,结合我们的先前的研究QZTB展品疗效在治疗高尿酸血13),这进一步表明,QZTB会有很高的潜在治疗急性痛风性关节炎的疼痛和复发的诊所。

主要问题的实证传统中药处方治疗健康问题是处方的化学成分及其质量控制。在先前的报道中,我们确定了四个主要组件QZTBastilbin,薯蓣皂苷配基、姜黄素和槲皮素。尽管目前尚不清楚,它的化学成分QZTB导致其抗炎和anti-gouty关节炎影响本研究。根据我们之前的研究(13,16),astilbin可能的主要功能性成分QZTB。有效成分的鉴定QZTB、相关的分子生物学机制和临床研究需要进一步深入调查。

5。结论

本研究首次证明QZTB,实证传统中药处方在诊所,抑制MSU crystal-induced肿胀和疼痛的老鼠和发挥抗炎作用。潜在的anti-gouty关节炎的影响QZTB可能是由于抑制NLRP3 inflammasome和下游促炎细胞因子(il - 1β和肿瘤坏死因子-α)的水平。这些发现表明QZTB公式可能是一种有前途的治疗痛风性关节炎的预防和治疗,尤其是反复攻击,在临床设置。

缩写

密西根州立大学:	谷氨酸钠尿酸盐
QZTB:	Qu-Zhuo-Tong-Bi公式
il - 1β:	Interleukin-1-beta
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α
NLRP3:	nod样受体家族pyrin domain-containing 3
非甾体抗炎药:	非甾体类抗炎药
中医:	中国传统医学。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

h·l . j . y .负责设计的工作。J。C、F。L z . X, y J负责数据的采集和分析。h·l·和J.Y.起草了手稿。C。W和J.Y.批准了最终版本出版。

确认

这项研究是由美国国家科学基金会支持浙江省(LY16H100003),中国国家自然科学基金(81971052,81971052,81971052,81771774),浙江省级项目高层创新卫生人才的培养,和中国国家重点研发项目(2018 yfc1705501)。