文摘
有一种趋势使用药用植物初级医疗保健或膳食补充剂;然而,许多这些植物的安全并没有被研究过。这项工作的目的是确定的水提物的毒性作用Calea ternifolia(c . zacatechichi),通常被称为“梦幻草”在活的有机体内和在体外为了验证其安全性。体内,提取有中等毒性赛利娜。在体外,提取诱发eryptosis浓度的100年的73%μg·毫升−1它抑制CYP3A 99%浓度的375μ克/毫升。后管理8.5毫克/公斤c . ternifolia老鼠,我们发现血小板和白细胞的减少和增加尿素和肝脏酶丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)。组织学分析显示海绵状改变肾近端小管的组织和肝脏组织的淋巴浸润。这种植物用于治疗糖尿病,是作为膳食补充剂在几个国家商业化。我们的结果显示肾和肝毒性;因此,这种植物的毒性更深刻的研究是必要的。
1。介绍
因为当前的倾向于采用一种更“自然”的生活方式,目前中药有着极大的兴趣,一个医疗系统,搜索效率和轻度或无毒的治疗选择。药用植物已被用来作为在传统医药文化遗产,但他们需要科学验证1),因为它们含有活性物质的生物活性和毒性2]。
Calea ternifolia(syn。c . zacatechichi)(Astereaceae)是一种植物原产于墨西哥和中美洲,在本土文化(它拥有着悠久的历史传统3]。它也被称为“梦草”,因为它暂时加剧了清晰的梦想和显著影响中枢神经系统。为此,c . ternifolia使用在一些国家,尽管它被禁止工厂名单在波兰2013年(4]。最近的一项研究的neuropharmacological行动的水提物c . zacatechichi表明它已经无关紧要neuropharmacological影响,也减少了腹部疼痛知觉(5]。它也是传统上用于治疗内分泌和肠胃问题6]。工厂在线销售作为一种膳食补充剂治疗糖尿病引起低血糖(由于其能力7]。尽管它的作用机制是未知的,这个活动可以是由于化合物被孤立于植物,如类黄酮(8)和倍半萜烯内酯(9),有毒性。类黄酮引起变形、渗透脆性和红细胞的聚集10]。儿茶素等黄酮类化合物在大鼠胚胎产生毒性(11],槲皮素,除了能够捕捉自由基和作为一种抗氧化剂,氧化剂反应,也可以进行施加对细胞和组织细胞毒性的影响(12]。这项工作的目的是确定毒性作用在活的有机体内和在体外水提物的Calea ternifolia(c . zacatechichi)被称为“梦草”。虽然在这项工作的一些化学成分c . ternifolia被确定,我们只评估和展示了完整的水提物的毒性。
2。材料和方法
2.1。植物材料的记忆和识别研究
植物被收集在2012年在德萨卡特卡斯的情节的一个农场,墨西哥(24°N 103°O)。植物的识别进行了自治大学Agraria安东尼奥Narro CRB-Agroecology注册002/12。水提物的获得了研究植物的叶子和冻干(Labconco Corp .,密苏里州堪萨斯城序列号00627212 f,目录没有7400030三和弦™)。
分析了植物提取高分辨率的液相色谱(HRLC)。植物化学的测试是在描述的水提物进行Bruneton [13],HRLC上执行一个安捷伦1200型色谱仪(安捷伦科技,圣克拉拉,CA)四元泵和二极管阵列检测器。分离了两个发现®C18柱15厘米×4.6毫米,5μ米(Supelco分析、Bellefonte PA)连接在系列20μL循环。磷酸铵的流动相由50 mM调整与磷酸pH值为2.6 (a),乙腈:磷酸铵80:20 (B)和磷酸200毫米(C) a和B的不同梯度特征提取的化合物是由比较保留时间与标准,芦丁(猫。不。78095)、绿原酸(猫。不。00500590)、没食子酸(猫。不。G7384), syringic酸(猫。不。S6881)、儿茶素(猫。 no. 43412), epicatechin (cat. no. 68097), and quercetin (cat. no. 1592409) of Sigma-Aldrich, respectively, at a concentration of 1000 μg·毫升−170:30甲醇:水(14]。
2.2。评价人类红细胞中提取的生物活性
人类红细胞从健康志愿者无偿献血者获得执行下面描述的测试。所有参与者把他们的书面知情同意。
2.3。通过流式细胞术红细胞中提取的细胞毒性
与抗凝外周血样本CDP / ADSOL™收集,和一个完整的血细胞计数决心Sysmex KX-21N血液学分析仪(Sysmex美国,Inc .,林肯郡,IL)。一个细胞调整1×106毫升−1在5毫升PBS(电池包磷酸缓冲盐)和1μL的全血5毫升汉克斯′平衡盐溶液(猫。h - 2387 Sigma-Aldrich, Inc .,圣路易斯,MI)。流式细胞术,FACSCalibur E4807设备(Becton Dickinson和有限公司,富兰克林湖,NJ)使用。在0.4%(红细胞被暂停15)和/或105-10年6细胞·毫升−1。一个使用利福平50 eryptosis曲线运行μg / mL的积极控制和提取物浓度的1000,500,100,10μ克/毫升。样本离心机,小球在1毫升resuspended汉克斯获得了解决方案;从这100μg / mL被放置在一个fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)管,200μ汉克斯的L′的解决方案是添加,样本被流式细胞术读。
2.4。流式细胞术
与膜联蛋白染色V-FITC(膜联蛋白V FITC,猫。11 - 8005),这些细胞被洗汉克斯′的解决方案和随后resuspended缓冲区1 - 5×10 1毫升的绑定6·毫升−1。从这个暂停,100μ我是和5μL的膜联蛋白V-fluorochrome共轭添加和孵化22°C 10 - 15分钟。细胞被洗在绑定缓冲和resuspended在200年μL的缓冲区,在黑暗中保持在2 - 8°C和4 h后,流式细胞术分析。
2.5。意思是血细胞比容(MCV)
最初,细胞的数量被调整至1×106毫升−1在磷酸缓冲(电池包)。
500年提取物的浓度μg与细胞稀释1:1(精华:细胞)和24小时维持在20 - 25°C;以后这是读”自动化设备Sysmex KX-21考虑80 - 97 fL作为一个正常的值(16]。
2.6。硫代巴比土酸/丙二醛
500年的水提物的浓度μg化验了硫代巴比土酸/丙二醛反应物质(TBARS / MDA)搜索脂质过氧化作用作为细胞损伤机制,描述的方法由Dawn-Linsley et al。17),使用TBARS化验设备项目编号10009055开曼化工有限公司(http://www.caymanchem.com)。
2.7。活性氧
量化的活性氧,过氧化氢细胞分析从开曼群岛使用化学物品编号为600050。总共有100μL细胞和96μ每个提取的L(1500、1000、750、500、250、100、10日和1μg / mL)存入一个96孔板和孵化公司的氛围中13 - 15%2在37°C 24 h。然后他们被离心机,上层清液被转移到一个黑色的板加10μL分析缓冲区的提取和标准样品。过氧化氢酶是添加到积极控制和反应酶解标准,控制和提取。之后,他们被孵化与常数轨道搅拌20分钟的温度20 - 25°C,和荧光测量在530 - 590海里的ELISA读者(101)为什么18]。
2.8。毒性的提取物对卤虫盐沼
的杀伤力化验答:盐水湖执行所述由Leos-Rivas et al。19),使用相同的毒性标准。数据收集与IBM SPSS统计与概率单位回归版本20来计算LD50。
2.9。组织病理损害男性纯种老鼠的器官
2.9.1。实验动物
这个研究机构委员会批准的实验室动物保健和使用UAC,墨西哥,25-03-14号文件,根据官方的规定墨西哥动物园笔名- 062 - 1999标准。老鼠被安置在聚碳酸酯笼子在湿度和适当的温度条件与12 h光/暗周期和水和老鼠的食物(Prolab 2500)随意。
2.9.2。组织病理损伤的动物模型
25雄性Wistar鼠(鼠属novergicus), 6 - 8周大的近似重量200克。老鼠被分为5组,每组5大鼠:三组有1.25、3.75或8.5毫克/公斤的冻干植物提取物resuspended盐水。组4给出了利福平8.5毫克/公斤(积极控制)和组5、盐水(负控制)。处理管理每24小时7 d,并根据口服剂量选择参考剂量毒性noncarcinogenic物质(20.,21]。确定时间后,通过心脏穿刺收集血液样本;一管含有抗凝血液分析,另一管,没有抗凝,被送到生化分析。由位错老鼠立即牺牲,组织和器官进行组织病理学分析10%缓冲福尔马林。
2.9.3。肝脏和肾脏组织病理学分析
器官保存在10%缓冲福尔马林放在解剖板。肝脏和肾脏的主瓣被选中时,组织是放置在一个福尔马林胶囊7 h。组织后来被放置在一个Histokinet (Van Wissel-digital组织处理器)12 h胶囊准备和嵌入石蜡。然后,把组织的石蜡块被使用斯宾塞820旋转切片机。石蜡切片的被置于浮选槽(组织漂浮浴xh - 1001) 52°C。他们在费舍尔科学deparaffinized 15 - 30分钟IsoTemp孵化器60°C。随后,他们被淹没在集中二甲苯显微观察了10分钟。
2.9.4。分析参数评估男性纯种老鼠的血液接触后治疗
试验前的二十五重实验动物模型和分布式在笼子里5×5实验单位。既定的时间后,与抗凝血样收集和血液参数使用传统的方法进行了分析。
2.9.5。感应CYP450的提取
CYP450感应是由酶动力学方法与商业套件生动®CYP450红色(猫。不。P2856) [22]。酮康唑10μ(作为一个积极的抑制剂)(Sigma-Aldrich猫。不。UC280)、利福平10μ米(Rifadin作为诱导物),2 x缓冲用高效液相色谱级水稀释被安置在96与100年微型板块μ不同浓度的提取和100μL反应缓冲和200年作为目标μL的缓冲区。共有50个μL 5 nM baculosomes被添加到每个好了,10分钟的板是孵化的温度°C,年龄在18岁至25岁之间,进行课前阅读。Vivid-NADP +衬底制备,10μL是添加到每个和立即读一个ELISA(为什么101)读者在520海里。
2.9.6。统计分析
所有的实验进行了一式三份,和数据表示为平均值±标准偏差(SD)。半数致死剂量(LD50)确定使用概率单位回归与SPSS软件20版本。数据分析与负控制使用的比较对治疗手段(t以及),建立了统计显著性在99%的置信区间。
3所示。结果
收集到的植物被确定在UAAAN石塔单位登记号CRB-Agroecology 002/012,获得率为17% (p / p)水提物。的描述c . ternifolia提取,高效液相色谱法(图1),30种化合物被发现,他们三个的保留时间与标准使用:芦丁(56.652),甙、槲皮素(53.409),和表儿茶素(34.661)。
表1显示了水提物的结果c . ternifolia引起的感应eryptosis浓度的100年的73%μg·毫升−1;积极的控制(利福平)引起的感应76%的浓度为25μg·毫升−1。专门有一个轻微的增加对正常价值(> 97 fL)。TBARS / MDA值在7.5和8.6之间μ大于正常范围(18.6 - -39.4μ米)。在H的决心2O2,平均值是14μ与4.0相比μ米的控制(没有暴露在提取)。的水提物c . ternifolia有轻微的毒性反答:盐水湖。
在实验中提取的c . ternifolia口服药物只雄性Wistar鼠剂量为8.5毫克/公斤,海绵状的变化被发现肾近端小管的组织(图2)和淋巴浸润在肝组织(图3)接触后的提取测定在动物模型上的一式三份。
(一)
(b)
(一)
(b)
动物的血值在研究之前和之后的水提物的管理c . ternifolia在8.5毫克/公斤如表所示2。
在这些,血小板和白细胞减少和尿素和肝酶(ALT、AST和高山)增加。表3显示了人类baculosomes CYP3A4抑制的结果在不同浓度提取。
4所示。讨论
从植物中提取获得的产量为1.7%。没有先前的报道虽然已经发现,家庭菊科有8 - 10%的收益率当乳胶是从它的根中提取的23)和航空零部件(24]。在化学研究C。ternifolia芦丁和槲皮素被发现,还有以前的报告从Escandon-Rivera这些黄酮类化合物的存在9]。
一些药物如ipratropium溴化和硫酸沙丁胺醇,用于阻塞性肺疾病,产生eryptosis [25]。已报告工厂组件,因为这同样的问题(26]。这些天然成分具有抗菌、抗炎、抗癌的,强心剂,免疫抑制,anti-infertility,神经保护,antiatherosclerotic属性。其中一个例子是plumbagin(5 -羟基- 2 -甲基- 1.4 -萘醌)。这些酚类化合物诱发eryptosis和/或细胞凋亡的线粒体去极化,抑制蛋白bcl - 2家族。在这项研究中,我们发现,C。ternifolia红细胞具有酚类化合物,接触引起的提取eryptosis的感应。多酚成分显示最少的人类红细胞溶血活性(27]。在这项研究中,C。ternifolia提取显示关于正常值略有增加。
在另一项研究中,人类红细胞的膜暴露在辐射中槲皮素的存在进行了分析,并发现TBARS浓度的增加在这种化合物的存在,除了引起溶血(28]。在这项研究中,观察到类似C的存在。ternifolia提取物,含有槲皮素(TBARS值增加/ MDA)。
浓度大于或等于50μM的纯化合物被认为是细胞毒性的动物,植物,和细菌。然而,在人类血液,细胞毒性浓度∼35μ米(29日]。其他作者报告说它是接近于零30.]。的水提物c . ternifolia本研究中使用低毒性和弱毒性答:盐水湖在777μg·毫升−1。根据以下标准,DL50> 1000μg·毫升−1是无毒的;≥500,≤1000μg·毫升−1是弱毒性;和< 500μg·毫升−1是有毒的31日]。没有以前的研究发现这种植物的毒性。
有研究酚类化合物对细胞功能的影响。在这些化合物中,槲皮素与口服毒性有关(32]。的提取c . ternifolia浓度为8.5毫克/公斤产生海绵状改变肾近端小管的组织和淋巴浸润在肝组织的存在。Mossoba et al。33),在一项研究在人类细胞中细胞和线粒体功能的肾脏近端小管(HK-2),报告中肾毒性生物标志物水平升高的c . ternifolia。辛格et al。34)的研究e·阿尔巴的家庭Astereaceae含有类黄酮,报告了类似的结果在肝脏与不良的生化和组织学的影响的浓度为2500毫克/公斤。他们观察到的水提物的口服e·阿尔巴在雌性大鼠产生有害影响生化参数和增加肝损伤后转氨酶水平由于诱导膜透性;在类似的研究中发现变更(33]。后来,同一个作者的水提物进行评估菲niruri叶子,发现肝损伤更大剂量(35]。
的酶代谢外源性物质被称为P450细胞色素(cyp),特别是CYP3A4酶。抑制cyp的活动导致体内毒性作用,诱导增加其表达,影响新陈代谢,消除和功效的药物。流程可以评估和量化CYP3A4的调制36]。
在最近的研究中,人们已经发现,CYP450的配体与有机分子(37]。在这项研究中,暴露的研究CYP450的反应观察植物。
植物中的植物化学的成分是有机物质在肝脏代谢,抑制或诱导表达的可能性CYP3A4的哺乳动物。这种酶底物的特点占领活动网站会导致不适当的减少水和减少活化氧气在水中的位移;因此,水合作用被认为是高度依赖于一些CYP的配体亚型。此外,cyp代谢药物的特点是低程度的底物选择性[38]。CYP3A4参与底物的氧化和负责药物的代谢和植物化学的组件,如槲皮素,一种物质,存在于植物和传统医学中使用。这种物质被认为是这种酶的抑制剂,同时,需要评估风险和收益的使用天然产品(32]。这些抑制剂的功能导致的增加的影响由于其植物化学的成分,因为他们的消费并不在肝脏代谢体内或任何其他地方。
酚类组件,如芦丁、表儿茶素和绿原酸,研究中还发现了工厂。至于槲皮素,表儿茶素、芦丁,它已经表明,他们有可能减弱辐射和cytogenic损伤(39]。在这项研究中,一个试验来确定执行CYP3A4的感应,观察活动。因此,可以认为,酚类化合物作为抗氧化剂,但也可以开展助氧化剂反应,发挥细胞毒性对细胞和组织的影响以及CYP450的诱导和抑制。也可以认为有抑制CYP3A4当暴露在研究植物提取物。
在这个在体外研究中,水提物的c . ternifolia显示中度毒性反答:盐水湖、改变人类红细胞和CYP3A4的抑制。在活的有机体内结果表明高水平的生物标志物的肾毒性、肝毒性,可能由于化合物,如类黄酮,在这项研究中发现的。
5。结论
研究的基础上,c . ternifolia应该用于短时间的因为它有低毒性反对答:盐水湖并产生不良影响的肝脏和肾脏Winstar老鼠在8.5毫克/公斤。在传统医学,这种植物通常是长时间使用,比如在hiperglycemia的控制。重要的是要继续研究确定化学成分的生物活性,毒性和作用机理。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这个项目是由国家科学技术委员会(CONACYT、墨西哥)注册号355424和特殊项目,促进青年科学家的科学生产2018 UANL。特别感谢Alejandra大肠Arreola特里亚纳在编辑这手稿提供支持。