文摘
生活方式和饮食习惯的深刻的修改导致一个重要的痛风的患病率增加。不幸的是,当前有未满足的需要治疗的疾病,促使寻找新的替代能源。Paullinia pinnata是一种植物,用于治疗各种疾病,包括关节炎。目前的工作旨在调查antigouty活动的水(AEPP)和methanolic (MEPP)提取的p . pinnata以及他们的体内抗氧化性能。注射引起的痛风性关节炎是50μ单钠尿酸盐的l(密歇根州立大学,100毫克/毫升)在左后老鼠的脚踝。p . pinnata提取口服剂量的100和200毫克/公斤/天,6天,MSU注射后24小时开始。别嘌呤醇5毫克/公斤/天药物被用来作为参考。炎症和痛觉过敏日常监控从治疗后24小时内开始,连续6天。髓过氧化酶(MPO)量化是在收集滑液。氧化亚硝酸盐(NO)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)在脊髓和大脑进行评估。此外量化血清SOD含量。AEPP和MEPP显著( )减少MSU-induced炎症(22.41%到93.65%)和痛觉过敏(33.33%到64.44%)在脚踝和爪子。AEPP和MEPP显著( )降低滑膜MPO生产比例从76.30%到85.19%不等。AEPP和MEPP显著(p< 0.001),降低血清,脊柱,左右半球不,和MDA和SOD活性增加( )。p . pinnata叶提取物具有强大的疗效与MSU-induced相结合的痛风性关节炎镇痛,抗炎,抗氧化活性。这些发现支持使用p . pinnata叶子提取物治疗痛风性关节炎和进一步有效antigouty医学的植物作为强有力的来源。
1。介绍
痛风性关节炎是一种痛苦的炎性疾病,表现为关节肿胀和疼痛,通常延伸到周围组织。痛风性关节炎通常发生高尿酸血后,确定为主要的风险因素(1,2]。这个关节疾病的特点是降水,沉积,和单钠尿酸盐结晶在关节,导致强烈的炎症和痛苦的过程3]。痛风患病率范围4 - 6.8% (4,5]。其发病率不断上升,这与许多并发症。在病理学的发展,尿酸盐的危害主要是由于其能力引发活性氧簇(ROS)的生产,从而促进痛风性关节炎患者的氧化状态。认识提高,氧化应激状态已经证明在痛风性关节炎6]。
治疗痛风的时间集中在治疗炎症和降低高尿酸血。很多代理,包括别嘌呤醇,febuxostat,秋水仙碱,非甾体类抗炎药、糖皮质激素,以及最近白介素1 (IL)抑制剂,开发并演示了痛风治疗的效率。不过,他们其中有一些限制是影响急性痛风发作,禁忌症和并发症,药物的副作用,包括发热、皮疹、过敏反应、肝炎、肾病,和胃肠道毒性/出血[7- - - - - -9]。因此,较低的一个重要的需要更有效的新疗法的副作用。
最可靠的来源之一的新化合物的药用植物。他们获得了更大的兴趣最近几十年,现在集中使用的工业生产phytopharmaceuticals和保健品。
寻找新的天然药物与antigouty效果,结合抗炎,镇痛,抗氧化性能,是这个手稿的焦点。Paullinia pinnata林是一个爬虫(无患子科)植物广泛分布在西部和喀麦隆的中心地区。经验用于感染和疼痛和炎症性疾病的治疗。叶子汤在东非地区使用,治疗蛇咬伤的10]。这种植物提取物植物化学的研究揭示了存在酚类(11),类黄酮、三萜烯皂甙和丹宁酸12),类固醇,甾体苷、脑苷脂和神经酰胺(13]。2 -等化合物O-methyl-L-chiro-inositol,β谷甾醇,无羁萜隔绝p . pinnata(14]。以前的药理研究证明了抗菌活动和对CCl4-induced肝损伤和氧化应激保护作用[14,15]。我们最近的研究表明,水和甲醇提取物的叶子p . pinnata拥有强有力的预防对类风湿引起的影响(16]。但这些植物提取物是否可以治疗痛风性关节炎是未知的。本研究进行评估疗效的水和甲醇提取物p . pinnata在痛风性关节炎MSU-induced Wistar鼠。
2。材料和方法
2.1。植物提取的材料和制备
新鲜的叶子p . pinnata收获在Poumougne Koung-khi部门(西部地区、喀麦隆)2017年3月。植物标本的鉴定是在喀麦隆国家植物标本在雅温得先生Tadjouteu Fulbert相比,一个参考号10701 / SRF凭证标本。凸轮。
树叶是阴凉干燥和研磨成细粉。水提物是由煎煮。粉(500克)在3.5 L的蒸馏水煮15分钟。混合物过滤在绘画纸纸1号。残留是re-extracted如前所述在2 L的蒸馏水15分钟。获得的两个滤液被汇集在一起,消失在一个通风的蒸汽房72小时40°C到89.54克(17.91%)。
甲醇提取制备浸渍。粉(500克)在3.5 L的甲醇浸泡72小时,过滤使用绘画纸纸1号。植物材料的甲醇残留在2 L re-extracted 24小时。获得的两个滤液涨跌互现,集中在旋转蒸发器在40°C和低压下产生111.04克(22.21%)的甲醇提取物。
也准备了水和甲醇提取物4% DMSO溶液的实验前政府的动物。
2.2。化学品和药物
尿酸,hexadecyltrimethylammonium溴化、肾上腺素O-dianisidin,叠氮化钠从Sigma-Aldrich购买化工有限公司(德国Taufkirchen)。氢氧化钠、盐酸、牛血清白蛋白、氯化钠、Dimethylsufoxide (DMSO)从Carl-Roth购买(Kalshur,德国)。硝酸从Qualikems购买。别嘌呤醇是来自Aspen-Pharma(爱尔兰)。醚是购自当地的药房(Dschang、喀麦隆)。格里斯试剂、双缩脲试剂和碳酸盐缓冲准备在实验室的成分Sigma-Aldrich化工有限公司(德国Taufkirchen)。硫代巴比土酸购自上海徐占云(音译)先生办化学有限公司(中国)。三氯乙酸是购自Guangdon光华科技有限公司(中国)。
2.3。谷氨酸钠尿酸盐(MSU)晶体的合成
密歇根州立大学晶体合成修改协议的坦克等。17]。二百毫升氢氧化钠的水溶液中(1米)搅拌,加热到70°C。在获得所需的温度,1 g的尿酸加入氢氧化钠溶液和盐酸(1 n)被用来维持混合物在pH值为7.2。解决方案是搅拌在一个恒定的温度(70°C) 4小时,然后慢慢地搅拌在室温和储存在4°C 24 h。微粒的密歇根州立大学晶体被发现底部的玻璃。密歇根州立大学粒子被过滤回收,用蒸馏水洗净;风干,悬浮在无菌生理盐水(100毫克/毫升)。
2.4。动物
白化Wistar鼠(150 - 200 g)在实验室饲养现场Dschang大学生理学和植物药理学的喀麦隆。42动物(10 - 12周)的被分成7实验动物组6(3男性和女性)。老鼠习惯痛阈记录和爪子体积测量实验。大鼠痛阈与基线低于或等于7.5克被丢弃。
2.5。MSU-Induced痛风性关节炎
实验设置后张法等。18),与一些修改,执行如下描述。简单地说,老鼠与乙醚麻醉,左后腿皮肤与75%乙醇消毒,和外踝位于触诊。然后,插入一个胰岛素注射器针头垂直穿透皮肤,远侧地为插入到关节腔之间的差距胫腓的跗骨,直到一个明显的阻力损失。50毫升的密歇根州立大学被注入到清晰度诱发痛风性关节炎(第0天)。同样的步骤之后的所有组除了虚假的组中只有无菌生理盐水注射的清晰度。密歇根州立大学注射后的一天,炎症和疼痛阈值的第二个基线。然后,6 MSU-injected组治疗如下:负控制治疗口头和DMSO在蒸馏水(4%),积极控制与别嘌呤醇治疗(5毫克/公斤/天;溶解在蒸馏水),剩下的4个治疗组口服剂量与AEPP或MEPP的100和200毫克/公斤/天。MSU-injected老鼠治疗每日连续6天。脚踝处的痛阈和爪子记录使用analgesimeter(尤格Basile 37215型)在天1,2,3,4,5,6启动后的治疗。简单地说,醒了,老鼠scruffed放在analgesimeter。 For each measuring time point, two trials were completed on the ipsilateral ankle and the values averaged. The same measurement procedure was conducted on the ipsilateral paw.
后痛阈测量,爪子和脚踝卷记录使用电子卡尺(好科学,海德堡,德国)。老鼠稍微克制,爪子的直径测量之间的空间都贼从后面(背表面)到前面(足底表面)的爪子甚至脚踝。
7天MSU注射后,动物被腹腔内注射15%氨基甲酸乙酯麻醉方案(1.5克/公斤)。血液、脊髓和左右半球进行抗氧化试验。滑膜液的注入脚踝被洗联合与100年收集的μl氯化钠9‰的髓过氧化物酶水平的评价。
血液收集nonheparinized管离心机在3000 rpm,和血清一直−20°C到使用。整个脊髓和左右半球均相溶液在10%和15%的冰冷的0.1米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.4)在4°C,分别在4°C和离心机在10000 rpm 15分钟。上层清液收集和保持在−20°C。血清、脊髓、左、右半球上层清液用于超氧化物歧化酶(SOD)、氧化亚硝酸盐(NO)、丙二醛(MDA)的评估。
2.6。一氧化氮、超氧化物歧化酶和丙二醛的化验
格里斯试剂用于估算一氧化氮含量。到250年μ增加了250 l的组织样本μl 1% sulfaniladide准备5%磷酸。混合物在黑暗中孕育了5分钟,然后250年μl 0.1%萘基乙二胺添加,然后在黑暗中孵化额外5分钟。光密度在530海里。一氧化氮的数量计算的亚硝酸钠的标准曲线。
SOD活性的评估是根据协议进行Wandji et al。19]。到70年μ增加了830 l的样本μl(碳酸盐缓冲(pH = 10.2)和100年μl(肾上腺素(0.3毫米)。均相混合物,肾上腺素吸光度读60 - 120秒后,使用分光光度计在480海里(Heliosε)。氧化的抑制百分比是根据以下公式计算: 在哪里我% =抑制百分比和Ab =吸光度。
SOD活性被计算为:
MDA测定,500μl(磷酸(1%)和500年μl(硫代巴比土酸(1%)被添加到100μl血清/上层清液。混合均质,放在沸水浴15分钟。此后,管在冰浴冷却和离心机3000 rpm 10分钟。上层清液收集,使用分光光度计吸光度是阅读532海里(Heliosε)。MDA的浓度计算基于吸光度系数按照下列公式:d . o . =ε。c . L (d . O。=光密度,ε= MDA的摩尔消光系数(1.56×105米−1Cm。−1),C= MDA浓度l=光学长度之旅(1厘米))。
2.7。髓过氧物酶测定
这个试验是如前所述Garca et al。20.),做了一些调整。在每一个96孔板,25岁μ滑膜液的l, 25岁μl(磷酸钾缓冲,25岁μl 0.5%的溴化hexadecyltrimethylammonium缓冲区。混合物在室温下孕育了30分钟。然后,10μl(叠氮化钠(0.1毫米)和150年μl(磷酸钾缓冲(50 mM;pH值5.5)包含0.026% ortho-dianisidine盐酸盐和0.018%过氧化氢被添加到反应介质。整个板再次孵化在室温下30分钟。最后,光密度的96孔板的阅读使用450 nm的伊丽莎标。使用任意单位MPO水平表达。
2.8。统计分析
结果表示为±SEM。时间分析了痛觉过敏和炎症使用双向方差分析Bonferroni紧随其后的后续测试虽然时间点数据进行了分析与单向方差分析之后,图基的期末测验。所有的分析GraphPad Prism 5.01软件包。一个值小于0.05的被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。的抗炎作用p . pinnata提取物在MSU-Induced痛风
Intra-ankle注入密西根州立大学导致严重的炎症,是保持至少6天。每日口服p . pinnata提取物显著降低炎症引起的密歇根州立大学的脚踝和爪子。双向方差分析(主要影响时间、治疗和交互)演示了显著影响使用的剂量( ; ; )(数据1(一)-1(d))。约,AEPP和MEPP显示剂量依赖性的影响。的剂量200毫克/公斤,AEPP和MEPP表现出最大的抑制百分比的98.40%和99.23,分别。别嘌呤醇诱导的抑制百分比(5毫克/公斤/天)从90.81%至26.76不等,一般来说,效率较低p . pinnata提取(图1)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。Antihyperalgesic的影响p . pinnata提取物在MSU-Induced痛风
密歇根州立大学的关节内的管理导致痛觉过敏的脚踝和爪子。的口服p . pinnata提取开始一天MSU注射后显著降低机械痛觉过敏与Randall Sellito衡量方法(双向方差分析影响时间、治疗和交互 ; )。证明Bonferroni期末测验,AEPP, MEPP诱导时间和剂量依赖性antihyperalgesic效果(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。MEPP的剂量200毫克/公斤几乎完全废除了机械痛觉过敏,爪子的水平和脚踝(数字2 (b)和2 (d))。别嘌呤醇的效果等于MEPP的剂量100毫克/公斤。
(一)
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3.3。抑制的影响p . pinnata提取物在滑膜MPO活性液体在痛风的老鼠
在炎症过程中,通过氧化破裂产生MPO中性粒细胞。如图3在密歇根州立大学内注入大幅增加( )滑液的MPO活性比虚假的组。AEPP和MEPP显著( ; )MPO的活性降低,最高的效果观察与AEPP剂量200毫克/公斤(图3(一个))。积极的控制allopurinol-treated组(5毫克/公斤)(数据3(一个)和3 (b))也显著( )降低MPO水平比未经处理的密歇根州立大学控制和更有效地比AEPP和MEPP两剂量(100和200毫克/公斤)。
(一)
(b)
3.4。p . pinnata提取物抑制脊髓没有生产和痛风的左右半球老鼠
免疫细胞在炎症过程中,起着关键作用,而防守的有机体产生亚硝酸盐氧化。的抗炎活动更深刻p . pinnata提取,我们评估的影响AEPP和MEPP脊髓一氧化氮产量和左、右两半球。对照组(MSU-DMSO)显示显著增加( )没有内容的所有收集到的样本地区。这增加明显,完全逆转( )通过p . pinnata提取和别嘌呤醇在所有收集到的器官和使用的剂量,相对于对照组(数字4(一)- - - - - -4 (f))。
(一)
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3.5。的影响p . pinnata在血清中的SOD活性,脊髓,左右半球痛风的老鼠
的影响p . pinnata提取物对氧化应激评估通过血清中的SOD活性测定,脊髓,左、右两半球。MSU脚踝注入并没有显着影响的所有组织中的SOD活性,而虚假的组。然而,AEPP的日常管理和MEPP诱导tissue-dependent增加SOD活性。事实上,p . pinnata提取并不影响评价参数在右半球。此外,MEPP显示没有影响左半球(图中SOD活性5 (h))。别嘌呤醇能显著提高血清中的SOD活性只有左半球,而提取血清和脊髓。更多,AEPP增加参数的剂量依赖性的方式(图左半球5 (g))。
(一)
(b)
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(g)
(h)
3.6。p . pinnata提取降低MDA含量的脊髓和左右半球痛风的老鼠
MDA是脂质过氧化作用的最终产品,可以表明氧化应激的状态。评估的保护作用p . pinnata提取物对疼痛调制/综合结构的氧化损害,我们量化的MDA含量脊髓和大脑半球。正如预期的那样,我们发现一个重要的 )MDA含量的增加MSU-injected老鼠比虚假的集团(数字6(一)- - - - - -6 (f))。AEPP和MEPP显著(p< 0.001)降低MDA含量脊髓和左右半球相比MSU-control组。积极的控制也别嘌呤醇产生显著( )效果,但这种抑制活性低于提取独立的组织。
(一)
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4所示。讨论
本研究调查的能力进行水(AEPP)和甲醇提取物(MEPP)p . pinnata对疼痛、炎症和氧化应激在痛风性关节炎、肌肉骨骼系统的一种疾病,其特征是痛苦的炎性关节和oxidatives。痛风是单钠尿酸盐的积累的结果(密歇根州立大学)联合晶体。因此,实验MSU-induced痛风性关节炎是一个值得信赖的痛风模型,模拟临床人类状况。在目前的研究中,intra-ankle注入密西根州立大学导致炎症和痛觉过敏在身体的同侧的脚踝和爪子,伴随着MPO活性的增加滑液和氧化应激在脊髓和大脑。这些结果在很大程度上证实了以前的发现(21- - - - - -23]。
口服AEPP和MEPP显著降低炎症和痛觉过敏在剂量和时间的方式,减少了滑液,髓过氧化物酶活动,表现出显著的体内抗氧化作用不,MDA和SOD。
累积文献整合在physiopathological MSU-induced痛风的过程。事实上,在第一步,吞噬细胞在关节如巨噬细胞、单核细胞、或中性粒细胞激活检测MSU晶体,产生积极的il - 1β将随后的转录激活NF-КB触发细胞因子和趋化因子以及炎症介质的释放。释放介质最终将激活“后发制人,TRPV1和TRPA1渠道直接或通过细胞内的信号级联。此外,逆向的发射关节痛觉受器从周围神经释放神经肽终端,从而更容易局部炎症反应称为神经源性炎症(24,25]。由于这些错综复杂的通路,将hypersensitization痛觉受器结束hypernociception和异常性疼痛以及关节和周围组织炎症。AEPP MEPP显示按时间的镇痛和抗炎作用,这表明这些提取具有生物活性分子,可能会干扰上述不同的路径。p . pinnata因此,提取可能直接作用于吞噬细胞和神经系统。先前的研究相同的提取p . pinnata证明他们的镇痛和抗炎作用完全弗氏佐剂(CFA)诱导感染引起,建议提取可能的效果在中央和周边水平(16]。除此之外,它也表明,这些提取物抑制il - 1的生产β和肿瘤坏死因子-α巨噬细胞在炎症条件。作为il - 1β扮演一个关键的角色在疼痛和炎症的发展的背景下,高尿酸血或密歇根州立大学积累的关节,它可以建议的镇痛和抗炎作用p . pinnata提取相关的il - 1β抑制能力。因此,植物提取物的镇痛效应将高度依赖其抗炎作用。
然而,AEPP和MEPP能够减少辅助镇痛的爪子。这个结果表明p . pinnata提取可能直接作用在中枢神经系统,二次疼痛主要取决于敏感的中枢神经系统(26]。
显然表明,嗜中性粒细胞招募和激活是单钠尿酸盐的炎症反应的基石(MSU)晶体27]。中性粒细胞渗透和积累的滑膜关节将进行脱粒和释放分泌产品包括髓过氧化物酶(MPO)。以确定的影响p . pinnata提取在中性粒细胞浸润和激活,我们评估了滑液中MPO活性。AEPP和MEPP强有力地降低MPO活性,证实这些提取物降低细胞渗透正如前面演示(16]。同时,的可能性p . pinnata提取物能显著抑制炎症介质的释放白细胞不能推出,正如前面所讨论的那样。它已经表明,甲醇提取的叶子p . pinnata拥有β谷甾醇和无羁萜14]。这些化合物的镇痛和抗炎特性已经证明(28,29日]。因此,可以认为,甲醇提取物的镇痛和抗炎作用p . pinnata相关的存在吗β谷甾醇和无羁萜。
痛风的早期事件之一是氧化应激(30.关节)水平的影响。此外,不断传播的有害刺激脊髓和大脑,促进释放活性氧(ROS),从而导致这些组织氧化应激。已经证明,ROS调解的开发和维护疼痛和关节疼痛进一步促进周边和中枢敏感化(30.]。想法一致,本研究中观察到,MSU-induced痛风是伴随着大量生产没有和丙二醛的脊髓和大脑,而超氧化物歧化酶含量没有明显影响。这些数据证实氧化状态的大脑和脊髓MSU痛风动物。AEPP和MEPP显著降低都没有和MDA含量,增加SOD活性的组织,进一步确认的体内抗氧化作用p . pinnata提取先前建议(16]。
5。结论
目前的研究表明,水和甲醇提取物的叶子p . pinnata拥有antihyperalgesic和抗炎作用MSU-induced痛风性关节炎。镇痛效果至少是部分相关的抗炎活性。抗炎效应似乎是由于抑制炎症细胞浸润和/或渗入细胞失活。这些提取物的抗氧化作用也非常有助于他们antigouty活动。这些结果支持使用的叶子p . pinnata提取物在喀麦隆民间医药治疗痛风性关节炎的管理。
缩写
| 密西根州立大学: | 谷氨酸钠尿酸盐 |
| AEPP: | 水提物Paullinia pinnata |
| MEPP: | 甲醇提取Paullinia pinnata |
| 氢氧化钠: | 氢氧化钠 |
| 盐酸: | 氯化氢 |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| MDA: | 丙二醛 |
| 没有: | 亚硝酸盐氧化 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| MPO: | 髓过氧物酶 |
| ROS: | 活性氧 |
| CFA: | 完整的弗洛伊德的佐剂。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
本研究中使用的所有手续被批准的当地伦理委员会(FS, Dschang大学)和符合痛清醒动物的研究指导原则建立的国际研究协会(协议号PP00032)疼痛。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
TBN计划工作。PPT、巴黎银行和SMN收集数据。TBN和PPT进行统计分析。PPT和TBN起草了手稿。所有作者修正和批准最终的手稿的副本。
确认
感激地欣赏作者的支持亚历山大•冯•洪堡基金会(德国)通过设备补贴。