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基于证据的互补和替代医学
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基于证据的互补和替代医学/2019年/文章

研究文章|开放获取

体积 2019年 |文章ID. 3949824 | https://doi.org/10.1155/2019/3949824

李丽，姜华波，魏学聪，耿丹丹，何明，杜慧兰那 “补肾助运汤通过vegfr -2介导的血管生成改善子宫内膜容受性“，基于证据的互补和替代医学那 卷。2019年那 文章ID.3949824那 14. 页面那 2019年。 https://doi.org/10.1155/2019/3949824

补肾助运汤通过vegfr -2介导的血管生成改善子宫内膜容受性

丽丽那1 华博江那2 Xuecong Wei.那1 丹丹耿那1 明荷那1 和 慧兰杜1

1河北中医药大学中西医结合学院，河北省肝肾型中西医结合重点实验室，石家庄

2上海同济大学医学院附属第一妇婴医院妇产科，上海

学术编辑：Jamal A. Mahajna.
已收到 04年7月2019年
修改后的 2019年9月21日
公认 2019年9月23日
发表 2019年12月31日

摘要

血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）调节丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路，并在血管生成中起重要作用。Bu Shen Zhu Yun煎汤（BSZYD）可以提高体外受精患者的子宫内膜接受和胚胎植入率。然而，BSZYD是否通过血管生成改善子宫内膜受性仍然不清楚。在这里，我们研究了BSZYD对人子宫内膜微血管内皮细胞（HEMEC）的增殖，迁移和血管生成的影响，发现BSZYD上调了细胞周期蛋白D1，基质金属蛋白酶9（MMP9）和增殖细胞核抗原的表达（PCNA）在hemecs。细胞计数试剂盒8测定，刮伤伤口测定和管形成测定结果表明，BSZYD促进了血管的增殖，迁移和血管生成。Western印迹分析结果显示通过VEGF和VEGFR-2表达的上调来激活MAPK信号通路。这些发现在一起突出了通过MAPK信号通路通过MAPK信号通路突出了BSZYD介导的内膜接收性的改善的新机制。

1.介绍

着床是妊娠的关键步骤，良好的子宫内膜容受性是着床的重要因素。胚胎着床是一个连续的动态过程，在此过程中子宫环境发生了一系列的变化。特别是子宫内膜根尖表面经历了一些形态、分子和生化变化，为胚胎着床提供了有利的环境[1那2］．

血管生成是重要的生物事件之一，可能与子宫和成年妇女卵巢子宫内膜容受性生殖周期和怀孕[中有关3.］．考虑到胚胎着床和发育过程中子宫内膜血管系统的周期性增殖[4.子宫内膜血管生成由几种血管活性物质和血管生成因子调节。血管内皮生长因子（VEGF）是最重要的血管生成调节因子之一，在预溶解胚泡中迅速激活，以及响应子宫内膜接触并导致血管生成，以确保胚胎的存活[5.］．一般地，血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2 / KDR）被认为是在血管生成的过程中最重要的VEGF受体和已知调节子宫内膜的血管生成[6.］．位于VEGFR-2下游的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路可通过一系列级联反应调控血管内皮细胞的增殖和迁移[7.］．

虽然辅助生殖技术（ART）在近几年取得了长足的进步，植入失败是影响艺术成果的共同问题。目前，还没有有效的策略是已知的解决这个问题[8.那9.］．在中国，中国传统医药（TCM），通常都作为患者补充药物方法体外受精（IVF）进行。中医药具有独特的优势和平衡的生理环境。然而，在子宫内膜容受性改善TCM的作用机制和增加的胚胎植入率是不完全的了解[10.那11.］．

本研究采用补肾助孕汤(BSZYD)提高子宫内膜接受度。在这里，我们发现BSZYD通过激活MAPK信号通路促进增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、VEGF和VEGFR-2在人子宫内膜微血管内皮细胞(HEMECs)中的表达。我们的结果可能为BSZYD对ART子宫内膜接受性的有益影响提供证据。

2。材料和方法

2.1。血统文化

HEMECs（ScienCell，USA）中在37℃和5％CO下孵育2在10％胎牛血清ECM培养基中，每隔一天替换培养基，直到细胞达到约90％的汇合。

２.２.含血清药物的制备

选取身体健康、月经规律的女性志愿者4名(20 ~ 30岁)作为实验组。受试者签署知情同意书，按指示口服BSZYD 4天。第4天，末次给药后1 h于早晨采集静脉血，室温静置2 h。3000 rpm离心10 min后收集上清，滤液用0.22消毒μm无菌过滤器，保存在−20°C。另外，选取4名女性志愿者(年龄20 ~ 30岁)作为对照组，她们身体健康，月经规律。按上述方法采集静脉血。补肾助运汤的成分如下:Rehmannia glutinosa.)，党贵(Angelica Sinensis.），山瑶（薯蓣属oppositifolia)、单鱼肉(山茱萸officinalis)，狗起字(枸杞子），淫羊藿（淫羊藿），黄芪（黄芪)、子河车(紫河车)和祥符(香附子)(九种草药的资料见附表1)．
中医 家庭 中国药品代码 重量（g） 植物化学的分数 Pharamacological活动
Rehmannia glutinosa. 玄参科 A-J-018 20. 环烯醚萜、糖类、氨基酸、无机离子[12.］ 增强免疫、调节内分泌系统、抗衰老、保护血液系统、抗肿瘤作用[12.］
Angelica Sinensis. 伞形科采用。 A-J-014 10. 类黄酮、氨基酸、微量元素、维生素和挥发油、酞、有机酸、多糖[13.］ 抗血虚、造血活性、抗炎活性、抗纤维化活性、抗痉挛活性、抗氧化活性、神经保护作用、心脑血管作用、抗肿瘤作用[13.］
薯蓣属oppositifolia Dioscoreaceae. a - j - 037 15. 山药多糖，Diosgenin，腺苷，arbutin [14.-17］ 雌激素样作用、降血糖作用、抗氧化和抗肿瘤作用、免疫调节作用、增强认知功能[14.-17］
山茱萸officinalis 山茱萸科 a - g - 075 15. 类黄酮、三萜类、单宁类、糖类、单萜类和倍半萜类、环烯醚萜和精油[18］ 肝脏和肾脏保护、抗糖尿病活性、心脏保护、抗氧化、神经保护、抗肿瘤活性、抗炎症、镇痛作用、抗衰老活性、抗健忘症、抗骨质疏松、免疫调节[18］
Lyeium研究方面 茄科 A-G-001 12. 多糖、甘油半乳糖、苯丙素、香豆素、木脂素、黄酮类化合物和生物碱[19］ 提高免疫功能、抗氧化抗衰老、抗癌作用、抗疲劳作用、抗病毒作用、保肝作用、降血糖作用、降血脂作用[20.］
淫羊藿brevicornu 小檗科 a - q - 043 10. 淫羊藿苷、淫羊藿苷、黄酮类化合物和酚[21那22］ 抗炎活性，调节脑/脊髓/骨轴，抗氧化活性，改善卵巢内分泌功能[21那22］
黄芪 蝶形花 A-J-019 10. 类黄酮、皂苷、多糖和氨基酸[23］ 免疫调节活性，抗氧化活性，抗高血糖活性，抗炎活性，抗病毒活性，血管扩张[23］
紫河车 hominidae. a - w - 043 10. 性腺激素、氨基酸、胎盘球蛋白、纤维蛋白原激活剂、激肽酶、催产素、促红细胞生成素、磷脂和多糖[24］ 抗感染作用，激素样作用，增强免疫功能，促进伤口愈合[24］
香附子 莎草科 A-J-057 10. 精油，酚醛酸，抗坏血酸和黄酮类化合物[25］ 抗雄激素，抗菌，抗癌，抗惊厥，抗糖尿病，止泻，抗基因毒性，抗炎，抗血脂，抗疟疾，抗诱变，抗肥胖，抗氧化，抗尿病，肝保护，心脏保护，神经保护，益智剂[25］
表格1
BSZYD 9草药的信息清单。
２.３.细胞计数试剂盒8 (CCK-8)增殖试验

根据制造商的建议，用CCK-8（Dojindo，Kumamoto，Japan）测定评估细胞增殖。大约100 μL (1 × 104.将细胞悬液接种96孔板2-4 h，用CCK-8试剂(10μl /孔）5小时。用自动微孔板读卡器（Versa Max，Santak，USA）测定450nm波长的吸光度。

2.4。划痕伤口分析

5 × 10接种HEMECs5.细胞/孔在6孔板中。达到80％汇合后，将细胞层用200的前端划伤 μL吸管。在无血清培养基中分别加入药物。图像是用数码相机(BX51T-PHD-J11，奥林巴斯，日本)拍摄的。

2．5．内皮细胞形成实验

24孔板的孔中加入冰冷基质，37℃孵育40 min。约500μL等于5 × 104.细胞悬液播种在这些培养皿中。用数码相机(BX51T-PHD-J11, Olympus, japan)捕捉细胞形态的变化。所有实验均为四次重复，数据以网络长度(平均长度/字段)表示。

2.6。Western印迹分析

HEMECs在含苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀分析(RIPA)裂解缓冲液中裂解，裂解液在4°C下12,000 rpm离心15分钟收获。蛋白浓度用二苯二酚酸(BCA)蛋白测定法(Thermo Fisher Scientific, USA)测定。等量的蛋白质样品在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上进行电泳，然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore, MA)。用5%的奶粉在TTBS中封闭膜，室温下2小时，用一抗在4°C孵育过夜。孵育后，在室温下用二抗检测膜1小时，用Image Quant LAS 4000 (GE Healthcare, USA)显示蛋白条带。所使用的抗体包括抗甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH) (Proteintech Group, USA)、抗β肌动蛋白（Proteintech集团，USA），抗PCNA（Cell Signaling Technology公司，USA），抗细胞周期蛋白D1（Abcam公司，USA），抗MMP9（Proteintech集团，USA），抗VEGF（Epitomics的，USA），抗-VEGFR-2（阿里戈，台湾，CHN），抗细胞外信号调节激酶（ERK; Proteintech组，USA），抗p-ERK（Proteintech集团，USA），抗P38（Proteintech集团，USA），抗p-P38（Cell Signaling Technology公司，USA），抗c-Jun N-末端激酶（JNK）（Cell Signaling Technology公司，USA），和抗-p-JNK（Cell Signaling Technology公司，USA）。

2.7。RNA制备和定量实时PCR

用TRIzol (Invitrogen公司)提取总RNA，用第一链cDNA合成试剂盒(Vazyme公司，美国)按照说明书进行逆转录600 ng RNA。根据制造商的说明，使用ABI 7500 FAST系统，使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix Kit (Vazyme, USA)进行实时PCR分析。靶mRNA水平与GAPDH水平标准化。目的mRNA表达分析采用2-ΔΔct方法(如表所示)2)．
基因 引物序列5 ' 3 ' 扩增子
VEGF F: 5“-GGAGGAGGGCAGAATCATCA-3” 247 BP.
R：5'-cttggtgaggtttgatccgc-3'
VEGFR-2 F：5'-TTACTTGCAGGGGACAGAGG-3' 170 BP.
R: 5“-TTCCCGGTAGAAGCACTTGT-3”
PCNA. F：5'-GCTCTTGTTCCCTGGATG-3' 185个基点
R: 5“-TTTGGCACCCTCACTTTC-3”
CyclinD1 F：5'-CCCTCGGTGTCCTACTTCAA-3' 219个基点
R：5'-CTTAGAGGCCACGAACATGC-3'
MMP9 F：5'-GAGTTCCCGGAGTGAGTTGA-3' 225个基点
R: 5“-AAAGGTGAGAAGAGAGGGCC-3”
GAPDH. F：5'-cacatcgctgagacaccatg-3' 198个基点
R：5'-TGACGGTGCCATGGAATTTG-3'
表2.
定量聚合酶链反应的引物序列。
2.8。统计分析

所有统计分析均采用SPSS21.0软件，数据以均数±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析和最不显著差异检验。 被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。VEGF激活MAPK信号传导途径和推荐血管生成HEMECs通过结合VEGFR-2

为了评价VEGF对HEMECs的影响，我们将VEGF处理不同时间(0、6、12和24 h)，并进行western blot和RT-qPCR分析。结果，我们发现VEGFR-2、PCNA、cyclin D1和MMP9的表达水平呈时间依赖性增加，在12 h达到峰值( )．最高水平保持在24小时（图1（a）和1（b）)．CCK-8检测结果显示VEGF诱导细胞增殖(图)1 (c))．划伤实验的结果显示，vegf刺激的细胞的伤口愈合速度明显快于未处理的细胞(图)1 (d))，提示VEGF促进HEMEC迁移。内皮细胞形成实验结果显示，VEGF可诱导HEMECs的血管生成(图)1 (d))．To evaluate the effects of VEGF on MAPK signaling pathway, we treated HEMECs with VEGF for different time durations (0, 15, 30, and 60 min), and performed western blot analysis to detect the changes in MAPK signaling molecules. As a result, we found that VEGF markedly stimulated ERK phosphorylation within 15 min as compared with the untreated groups ( ），p-JNK和p-P38表达水平在15 min内升高，在30 min达到最大值( 与0 min组相比）（图1 (e))．

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图1
VEGF通过与VEGFR-2结合激活MAPK信号通路，促进HEMEC血管生成。(a) HEMECs在低血清培养基中孵育24 h, VEGF (40 ng/mL)处理指定时间点(0、6、12和24 h)。使用特异性抗体western blotting检测MMP9、PCNA、cyclin D1和VEGFR-2的表达(左图)。密度扫描(右图)。数值表示为三个独立实验的平均值±SD。(b) real-time PCR检测MMP9、PCNA、cyclin D1、VEGFR-2 mRNA水平。数值用三个独立实验的平均值±SD表示。(c) CCK-8法测定的四组OD值分析。数值用三个独立实验的平均值±SD表示。 as compared with 0 h group. (d) Images show HEMEC scratch-wound and tube formation assays. Magnification, ×100. (e) HEMECs were incubated in low-serum medium for 24 h and treated with VEGF (40 ng/mL) for indicated times (0, 15, 30, and 60 min). Phospho-ERK, phospho-JNK, phospho-P38, total ERK, total JNK, and total P38 levels were determined with western blotting using specific antibodies (left panel). Densitometric scanning (right panel). Values are expressed as mean ± SD from three independent experiments.
３．２．BSZYD可促进HEMECs中VEGF和VEGFR-2的表达

BSZYD可改善妊娠率，但其作用机制尚不清楚。观察BSZYD对HEMECs的影响。HEMECs与BSZYD预孵育后，分别给予或不给予VEGF治疗。Western blot分析发现BSZYD处理后VEGF和VEGFR-2的表达较未处理组升高( )．此外，BSZYD组VEGF和VEGFR-2的表达水平高于VEGF组( ）（数字2(一个))．如图所示2 (b)与RT-qPCR分析中观察到类似的结果。

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图2
BSZYD在Hemecs中促进了VEGF和VEGFR-2的表达。（a）在低血清培养基中温育24小时，并用Bszyd处理24小时，然后与VEGF（40ng / ml）孵育12小时，使用特定的蛋白质印迹测定VEGF和VEGFR-2水平抗体（左面板）;密度扫描(右图)。值表示为三个独立实验的平均值±SD。 与对照组相比; 与VEGF组相比。（b）中VEGF和VEGFR-2 mRNA水平分析实时PCR。数值用三个独立实验的平均值±SD表示。 与对照组相比; 与VEGF组比较。
３．３．BSZYD诱导HEMECs血管生成并激活MAPK信号通路

随着细胞的增殖和迁移对血管生成是重要的，我们评估了BSZYD对Hemec增殖和迁移的影响。用BSZYD处理后，用VEGF孵育Hemecs。进行蛋白质印迹分析以检测PCNA，细胞周期蛋白D1和MMP9的表达。与对照组，VEGF，BSZYD和BSZYD + VEGF治疗组相比，PCNA，细胞周期蛋白D1和MMP9的表达水平显着增加（ )．BSZYD和BSZYD +VEGF治疗组PCNA、cyclin D1、MMP9表达水平均高于VEGF治疗组( ）（数字3（a）)．RT-qPCR分析也得到了类似的结果(图)3（b）)．We also performed CCK-8 assay and found that the absorbance value was significantly higher in the groups treated with BSZYD and BSZYD + VEGF than in the group treated with VEGF ( ）（数字3（c）)．进行划痕伤口测定以确定BSZYD对Hemec迁移能力的影响。如图所示3 (d)那wound healing was significantly faster in BSZYD and BSZYD + VEGF treatment groups than in the untreated cells. Endothelial cell tube formation assay results showed that BSZYD promoted the formation of endothelial cell tube (Figure3 (d))．我们研究MAPK信号转导途径分子的以下BSZYD治疗的表达。Western blot analysis showed that the expression levels of p-ERK, p-JNK, and p-P38 proteins in VEGF, BSZYD, and BSZYD + VEGF treatment groups were significantly higher than those in the control group ( )．因此，BSZYD可以激活MAPK信令路径（图3 (e))．

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图3
BSZYD诱导HEMEC血管生成，激活MAPK信号通路。(a) HEMECs在低血清培养基中孵育24 h, BSZYD处理，然后加入或不加入VEGF (40 ng/mL)孵育。western blotting检测MMP9、PCNA和cyclin D1水平(左图);密度扫描(右图)。数值用三个独立实验的平均值±SD表示。 与对照组相比; 与VEGF组相比。(b)的表达水平MMP9那PCNA.， 和细胞周期蛋白D1采用实时荧光定量PCR检测。数值用三个独立实验的平均值±SD表示。 与对照组相比; 与VEGF组相比。(c)四组CCK-8测定的吸光度。数值用三个独立实验的平均值±SD表示。 与对照组相比; 与VEGF组相比。（d）图像显示HEMEC刮擦伤口和管形成测定结果。放大率，×100。（e）中磷酸-ERK，磷酸化JNK，和磷酸化p38水平与使用特异性抗体（左图）蛋白质印迹确定;密度扫描(右图)。Values are expressed as the mean ± SD from three independent experiments. 与对照组相比; 与VEGF组相比。
3．4．BSZYD通过MAPK信号通路诱导HEMEC血管生成

由于BSZYD在HEMEC中负责血管生成和MAPK信号通路的激活，我们研究了BSZYD是否通过MAPK信号通路诱导HEMEC血管生成。在加入或不加入BSZYD孵育后，用MAPK信号通路抑制剂(PD98059, SP600125或SB203580)处理HEMECs，然后与VEGF孵育。Western blot检测MAPK信号通路相关分子的表达。与对照组相比，VEGF、BSZYD、BSZYD + VEGF治疗组p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白表达水平显著升高( ）;但是，在抑制剂+ VEGF组和BSZYD +抑制剂+ VEGF组中，我们没有发现任何显著的变化(图)4(一))．因此，BSZYD可以激活ERK，JNK和P38信令路径。与BSZYD治疗组相比，BSZYD + PD98059 + VEGF治疗组显示出显着减少（ ）在PCNA蛋白表达和细胞周期蛋白D1（图4 (b))．细胞周期蛋白D1和MMP9在BSZYD + SP600125 + VEGF和BSZYD + SB203580 + VEGF处理组中的蛋白质表达水平低于BSZYD组（ ）（数字4（c）和4（d）)．这些结果表明，BSZYD通过ERK、JNK、P38途径促进cyclin D1的表达，通过ERK途径诱导PCNA的表达，通过JNK、P38途径增加MMP9在HEMECs中的表达。

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图4
BSZYD经由MAPK信号传导途径诱导HEMEC血管生成。（一种）After incubation in low-serum medium for 24 h, HEMECs were treated with BSZYD, followed by incubation with or without MAPK signaling pathway inhibitors for 2 h. The cells were treated with or without VEGF (40 ng/mL) for indicated times points. Phospho-ERK, phospho-JNK, and phospho-P38 levels were determined with western blotting using specific antibodies (left panel); densitometric scanning (right panel). Values are expressed as mean ± SD from three independent experiments. 与对照组相比; 与VEGF组比较。(b-d) western blotting检测MMP9、PCNA和cyclin D1水平(左图)。密度扫描(右图)。值表示为三个独立实验的平均值±SD。 与对照组相比; 与VEGF组相比。

4.讨论

在这里，我们通过评价内皮细胞的增殖和迁移来研究BSZYD对子宫内膜容受性的影响。我们发现BSZYD可诱导VEGF和VEGFR-2表达，促进HEMEC增殖和迁移，介导血管生成。这些作用是通过激活MAPK信号通路介导的。

的控制性超排卵（COH）方案，特别是使用的GnRH类似物是已知的以抑制HOXA11，MEIS1，CTNNB1，并在围植入期间小鼠子宫内膜Cdh1的表达，并损害子宫内膜容受[26］．体外受精中使用的COH与每个移植胚胎的着床率较低有关，与卵子捐献中使用的自然周期相比，提示子宫内膜发育欠佳[27］．研究还强调COH方案的修改来构造下的形态和功能方面自然循环类似于一个子宫内膜，作为试图提高妊娠结局[28-30.］．在体外受精周期中，中药可与COH相结合作为一种补充治疗方法，作为提高体外受精疗效的新策略。在前期研究中，我们发现BSZYD可增加多次IVF-ET植入失败的患者和超排卵大鼠的子宫内膜厚度，促进pinopodes的发育和形成，增加子宫内膜的血管生成[31那32］．此外，我们的研究表明，BSZYD可以改善COH小鼠中的E2表达，这导致更高的妊娠率。同时，BSZYD在hemecs中增加了ER表达（数据未显示）。这些结果表明BSZyds具有雌激素状活性，可以增加VEGF表达和促进血管生成。BSZYD含有九种种类的草药，其有效地通过多组霍姆反应改善子宫内膜接受。如表所示1，九种中国药品的植物化学成分主要是黄酮类，多糖类，有机酸，而这些活性成分表现出血液系统，免疫系统，内分泌系统和生殖系统的广泛的药理作用。例如，类黄酮在植物和浆果广泛存在，它们是很强的抗氧化剂，能有效地在体内清除ROS，改善血液循环，稳定血管胶原，和抑制炎性酶的渗出，提高伤口愈合和缓解疼痛[33那34］．和黄酮类化合物具有雌激素样活动。雌激素是类固醇激素，具有广泛的生理活动，这对于改善子宫状态并增加概念率是重要的[35］．研究发现，中药多糖具有多种生物活性，可通过影响细胞因子的分泌来调节免疫功能，具有抗氧化能力。中药多糖还具有保肝、造血、促生长、抗动脉粥样硬化等作用[36］．皂苷及其生物合成中间体和衍生物具有多种药理活性，最显著的是细胞膜渗透、抗血小板聚集、免疫调节潜能和降低血清胆固醇[37］．所述化学组分可以直接或间接地促进血管生成，导致改善子宫状态，并增加受孕率哪个。

以前的研究表明，血管生成是对允许植入灵长类动物和人类的接受子宫内膜的基础38］．在子宫内膜中表达的VEGF可以调节血管发育，因此，VEGF抑制剂用于实现避孕措施[38］．子宫内膜血管生成贯穿整个月经周期。血管生成开始于增殖期，内膜螺旋状动脉在增殖早期经历了延长和缓慢的增殖[39那40］．这些血管在增殖晚期和分泌早期形成复杂的上皮下毛细血管。从凝块到分泌中后期血管生成增殖加速，使血管网血流最大化。广泛的血管生成是接受性子宫内膜发育的一个组成部分[41］．HEMECs位于子宫内膜内。HEMECs参与月经周期子宫内膜血管生成，随着子宫内膜的快速生长和脱落。培养的HEMECs是一个有用的模型，以阐明正常血管生成的机制和发展治疗女性生殖疾病。为了探索BSZYD促进血管生成、提高子宫内膜容受性的机制，我们选择HEMECs作为比HUVECs更特异的模型系统。

已知PCNA可调节细胞增殖、凋亡、DNA损伤修复和周期进展[42］．PCNA是在围植入过表达，并参与子宫内膜的重建[43］．细胞周期蛋白D1也是细胞增殖的关键调节因子。在子宫内膜增生中，血管新生与细胞周期蛋白D1的表达增加密切相关;因此，它可能被认为是疾病预后的重要标志[44］．MMP9在降解中的胚胎植入窗口和参与期间高度表达和子宫内膜螺旋动脉的形成和入侵期间胞外基质的重塑[45那46］．我们的研究表明，BSZYD诱导PCNA，Cyclin D1和MMP9在Hemecs中的表达（图2和3.），导致Hemec血管生成。

在MAPK家族密切相关的血管内皮细胞的增殖和迁移，并调节的转录因子和基因的表达。的MAPK信号传导途径的阻断可以导致MMP9，PCNA表达的下调，和细胞周期蛋白D1 [47-49］．我们发现，BSZYD可以激活MAPK（ERK，JNK，P38）信号通路（图5.)．

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图5
对于BSZYD对HEMEC作用提出的模型通过MAPK信号传导途径的VEGFR-2介导的调节的血管发生。

MAPK途径通过细胞外和细胞内刺激而激活，包括肽生长因子，细胞因子，激素和各种细胞压力源。据报道，VEGF和VEGFR-2在调节血管内皮细胞血管生成中发挥着关键作用[50.那51.］．VEGF和VEGFR-2形成复合物，激活MAPK信号通路(图)1)．MAPK激酶激酶（MAPKKK）-MAPK激酶（MAPKK）-MAPK（ERK，P38，JNK）通过顺序磷酸化将上游信号传输到下游响应分子，最终调节特定基因的表达（例如编码PCNA，Cyclin D1和Cyclin D1的表达）mmp9）[52.] （数字5.)．BSZYD可以促进VEGF和VEGFR-2的表达来激活MAPK信号通路（图5.)．我们的研究表明，在BSZYD诱导下，VEGFR-2负责PCNA、cyclin D1和MMP9的表达(图)2和3.)．此外，我们还检测了ERK、JNK和P38抑制剂对BSZYD诱导的MAPK信号通路的影响。我们发现ERK、JNK、P38抑制剂可阻断BSZYD诱导的ERK、JNK、P38信号通路，并可抑制BSZYD介导的PCNA、cyclin D1、MMP9表达上调。因此，ERK、JNK和P38信号通路通过促进HEMEC血管生成在BSZYD的作用中发挥了关键作用(图)4.)．BSZYD通过ERK、JNK、P38途径促进cyclin D1的表达，通过ERK途径诱导PCNA的表达，通过JNK、P38途径提高MMP9水平。因此，bszyd诱导的血管生成可能通过多种途径介导。vegf - vegfr -2介导的PCNA、cyclin D1和MMP9表达上调是BSZYD血管生成作用的机制之一。

5.结论

总之，作为一种互补处理，BSZYD可以通过改善通过多种途径的子宫内膜接受来提供独特的治疗优势。促进VEGF-VEGFR-2激活MAPK信号通路是BSZYD血管生成效应的机制之一。因此，有必要进一步研究以完全证实BSZYD的影响。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

李立和江华波对这项工作贡献相当。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（No.81603654,81774359和81473719）的支持，河北自然科学基金会（No.H2015423050）和河北教育厅基金会（ZD2018002）。

补充材料

图1：BSZYD可以在Hemecs中增加ER的表达。用含有Bszyd的低血清培养基中孵育Hemecs 24小时，然后用E2处理（107M)或不持续12小时。从HEMECs中收集总蛋白裂解物，用抗er和GAPDH抗体进行免疫印迹。BSZYD可增加HEMECs中ER的表达(图1)。该结果提示BSZYD具有雌激素样活性，可增加VEGF的表达，促进血管生成。（补充材料）

参考

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