文摘

肥胖会导致代谢紊乱的发展,特别是2型糖尿病(T2DM)病人体内。Obesity-induced胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病发病的诱发因素在肥胖的人。一般由临床医生,红外光谱是由adiposity-related炎症介导的复合离子在肠道微生物组的变化。本实验研究的目的是调查的影响Cucumis梅洛l . (Cucumis)在基因obesity-induced红外leptin-deficient地蜡/老鼠。具体地说,我们研究了Cucumis的抗炎作用和Cucumis在肠道微生物群的影响。我们评估血糖控制通过测量的边后卫,执行OGTT、量化血清IR,计算HOMA-IR,测定血脂水平。是否减少炎症,我们分析了脂肪组织巨噬细胞以及血液中单核细胞。我们还描述了肠道微生物群来确定微生物类群的比例发生了变化。我们发现Cucumis改善IR在肥胖小鼠脂肪组织和血液和缓解炎症。同时,微生物群组成比例发生了变化。总之,管理Cucumis改善IR通过减少炎症,从而改变肠道微生物群组成。Cucumis因此有前途的治疗obesity-induced胰岛素抵抗和炎症状态。

1。介绍

肥胖与代谢疾病的发病率增加包括2型糖尿病(T2DM)病人体内,心血管疾病,和各种癌症1,2]。此外,肥胖的发病率正在增加。肥胖也会导致2型糖尿病的恶化的发展obesity-induced胰岛素抵抗(IR),这是一个无法正常细胞对胰岛素。肥胖阻碍胰岛素调节血糖控制的令人不安的信号转导,这已被证明是影响肠道微生物组(3]。广泛认为,某些类型的肠道微生物群的代谢毒素分泌增加,尤其是脂多糖(LPS)。这类毒素导致慢性炎症,导致肥胖和红外(3,4]。几项研究已经表明,慢性炎症是胰岛素抵抗的潜在致病介质(5- - - - - -7]。微生物群组成受到几个因素的影响,如饮食和药物使用的变化。最近,全球努力专注于开发新药物靶向治疗肥胖和前驱糖尿病肠道微生物群。

的茎端Cucumis梅洛l .(以下称为Cucumis)俗称甜瓜,是一种草药,用来缓解拥堵的气在身体和消除不必要的体液。尽管Cucumis广泛应用在临床情况下,Cucumis的影响只有在一些研究解决情绪障碍(8和面部疼痛9]。自Cucumis用于能力影响胃肠道和诱发腹泻,Cucumis预计将影响肠道微生物群的成分,导致血糖控制的改善。Cucumis被用于患者的代谢疾病,尤其是肥胖和胰岛素抵抗。一个临床试验报道,Cucumis施加治疗对糖尿病患者的空腹血糖水平的影响(10]。另一项研究表明,Cucumis改善胰岛素抵抗和肠道微生物在一个小鼠模型(11]。然而,Cucumis产生这些影响的确切机制尚未建立。本研究的主要目的是确定的有效性Cucumis克服obesity-induced受损的血糖控制。第二个目的是确定的机制Cucumis施加其影响通过评估的水平炎症和小鼠的肠道微生物群组成。

2。材料和方法

2.1。的制备Cucumis梅洛l

Cucumis梅洛l .购买药品的准备工作在医院的韩医学、庆熙大学(韩国首尔)。拔牙后准备100克干Cucumis加入1500毫升80%的乙醇和煮2小时加热地幔。sieve-filtered的解决方案是使用一个过滤器和一个500毫升瓶,用旋转蒸发器后集中(模型NE-1 EYELA有限公司日本)。解决方案是冻干和提取是储存在室温下。最终的收益率为19.28%。

2.2。动物和实验设计

五个正常(正常、 19 - 21)6 C57BL / 7小鼠称重g(韩国中央实验室动物Inc .)和10个肥胖流行C57BL / 6地蜡/地蜡小鼠体重28-32 g(中央实验室动物Inc .、韩国)。肥胖老鼠leptin-deficient转基因。10 ob / ob老鼠被随机分配到两组:ob / ob(控制, )和ob /产科医师处理Cucumis梅洛l . (Cucumis )。只有雄性动物使用。动物的房间被保持在40 - 70%湿度在标准的光周期(12 h光明/黑暗)。老鼠随意访问给食物和水。在观察一个星期,Cucumis提取(20 - 40毫克/公斤)管理订单。每周两次老鼠Cucumis组,而在正常小鼠和对照组收到生理盐水。所有动物工作授权的庆熙医学动物实验伦理委员会(KHMC-IACUC 14 - 025)。

2.3。代谢表型的测量

2.3.1。测量体重(体重、食物摄取和附睾的脂肪)

体重记录的实验,在实验的最后,在每周的间隔。体重记录使用电子秤(CAS 2.5 d,首尔,韩国)。动物体重在同一时间在早上为了减少错误。每组小鼠摄入的食物量测量每周使用相同的规模。8周后小鼠牺牲后,所有附睾脂肪垫被立即删除,重。

2.3.2。口服葡萄糖耐量试验

空腹血糖(FBG)测试进行基线和8周。老鼠在每个测试之前禁食6小时。禁食后,从尾静脉血糖水平是衡量一个ACCU-CHECK执行血糖仪。后进行OGTT 14 h(隔夜空腹。身体的重量测量在测试前确定每个鼠标的口服葡萄糖负荷(2.0克/公斤体重)。前从尾静脉血样采集管理和30岁,60岁,90年,120分钟后管理。

2.3.3。空腹胰岛素和血脂浓度分析

小鼠禁食过夜,然后牺牲后,血液样本被心脏穿刺立即获得。血液样本在3000转离心20分钟获得血清。空腹胰岛素水平是评估使用酶联免疫试剂盒(晶体化学)。胰岛素的标准和样本整除antibody-coated微型板块,之后,他们与一个anti-insulin混合酶共轭在室温下30分钟。7洗后,40分钟的反应是孵化酶底物的解决方案。将停止解决方案添加到反应和孵化后10分钟,450海里的吸光度测定使用ELISA读者。HOMA-IR值计算基于光纤光栅和胰岛素水平(12]。总血清、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、NEFA和TG水平测量从血液样本。

2.3.4。肝脏和肾脏功能安全测试

血清是通过离心后,上清液冻结在−40°C到分析。天冬氨酸aminotransaminase (AST)、丙氨酸aminotransaminase (ALT)和肌酸酐水平测定。

2.4。脂肪组织巨噬细胞(ATM)闸门和单核细胞浇注

2.4.1。间质血管细胞(SVC)隔离

从样品基质血管细胞(svc)使用的collagenase-based方法(13,14]。总之,收获附睾的脂肪垫被浸泡在PBS (Gibco)和2% BSA (Gibco),之后他们粉碎成碎片1 - 2毫米直径。接下来,胶原酶(σ)和DNase我(罗氏)被添加到样品,之后的反应是动摇了20分钟37°C的2% BSA / PBS和5毫米EDTA。后过滤到100年μM尼龙网(BD科学)、混合物离心机在1000转3分钟去上层清液。底部的颗粒混合PBS和2%的边后卫(σ)。样本使用100年再次过滤μ米尼龙网删除不必要的组织。在200转离心后10分钟,从底部的svc得到样品。

2.4.2。荧光激活细胞分类(流式细胞仪)自动取款机和单核细胞的分析

svc在脂肪组织和血液样本的数量在5毫米EDTA测定使用cellometer (Nexcelom生物科学有限公司)。样本孵化与BD Fc块10分钟(BC Pharmingen)比1:100。Fluorophore-conjugated抗体增加,混合物在黑暗中孵化了20分钟。FACSCalibur (BD)生物科学仪器被用来分析样本。以下抗体被用于染色:CD45-APC Cy7 (BioLegend) CD68-APC (BioLegend) CD11c-phycoerythrin (BioLegend) CD206-FITC (BioLegend) CD45-APC Cy5.5 (BioLegend)和CD11b-PE (BioLegend)。细胞染色的百分比与每个进一步分析使用FlowJo恒星(树)。

2.5。16 s rrna的测序分析肠道微生物群

整个16 s rrna测序过程是由使用Illumina公司技术Macrogen inc .)。Illumina公司门店的工作流程包括四个步骤:样品制备、图书馆建设,测序,和原始数据。样品制备与提取DNA / RNA和质量控制分析。准备后,图书馆是由随机分裂DNA、cDNA样本,其次是5′和3′适配器结扎。Adapter-ligated片段扩增和gel-purified菌进行基因。PCR用于放大的模板DNA样本使用template-specific底漆和附加反手适配器。反应包括2.5 ul微生物DNA, 12.5 ul 2 x KAPA HiFi HotStart ReadyMix,每个引物和5 ul(1)嗯,正向和反向)。样品是密封的,PCR在热循环执行。放大后,PCR进行清理。PCR板块离心机,享年1000岁g在20°C 1分钟收集冷凝和消除密封。

集群生成的库加载到一个流细胞捕获碎片在草坪表面束缚寡核苷酸互补图书馆适配器。每个片段然后被放大成不同的克隆集群通过桥放大。当集群生成完成,测序的模板已经准备好了。Illumina公司SBS技术利用专有可逆terminator-based方法检测单基地纳入DNA模板链。因为所有4可逆,terminator-bound核苷酸存在在每个序列周期,自然竞争最小化公司的偏见。然后测序数据被转换成原始数据的分析。

2.6。统计分析

结果统计分析GraphPad棱镜7 (GraphPad软件,Inc .)。组相比,使用单向方差分析和图基的事后考验。数据提出了均值±扫描电镜;双尾如果< 0.05值被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。的影响Cucumis梅洛l对体重、附睾的脂肪重量,和食品消费

控制小鼠平均空腹体重高于正常小鼠,实验开始时和在第八周( 与 克, , 与 克, 、职责)。然而,控制小鼠没有明显高于体重增加这两个时间点之间。没有显著差异在肥胖小鼠的体重或体重增加之间的基线和第八周。控制老鼠明显重比正常小鼠附睾脂肪垫( 克和 克, )。然而,脂肪重量控制和Cucumis组之间没有显著差异。食品消费每天高于对照组相比正常组( 与 克, )。然而,老鼠Cucumis组没有消耗更多的食物比对照组小鼠(数字1(一)- - - - - -1 (c))。

3.2。的影响Cucumis梅洛l在血糖控制

基线,控制小鼠有显著提高光纤光栅水平比正常小鼠( 与 mg / dl, )。虽然没有区别控制和Cucumis组基线,Cucumis组比对照组显著降低光纤光栅水平在第八周( 与 mg / dl, )。所有组的血糖水平最高(图在30分钟的时间点1 (g))。此外,对照组所有点血糖水平高于正常组;这些差异都显著(所有 )。Cucumis组的血糖水平显著低于对照组的所有时间点,除了0到30分钟的时间点。曲线下的面积(AUC)对照组明显高于正常组( 与 mg·min / dL, ),Cucumis集团AUC比对照组明显降低( 与 mg·min / dL, )。这些数据所示的数据1 (d),1 (g),1 (h)。

3.3。的影响Cucumis梅洛l在胰岛素抵抗

胰岛素抵抗是由计算评估HOMA-IR值。而对照组HOMA-IR值高于正常组( 与 , Cucumis集团)HOMA-IR值明显低于对照组( 与 , )。空腹胰岛素浓度(FI)在对照组相比显著增加正常组( 与 ng / ml, )。虽然FI Cucumis组低于对照组,差异不显著( 与 ng / ml)。这些数据所示的数据1 (e)和1 (f)。

3.4。的影响Cucumis梅洛l对血脂水平

的任何组之间没有明显差异对总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度。然而,对照组TG含量严重超标,NEFA相比正常组。TG和NEFA Cucumis组明显减少( 与 , , 与 , 、职责)。这些数据所示的数据2(一个)- - - - - -2 (f)。

3.5。的影响Cucumis梅洛l在肝和肾脏安全性

确认Cucumis的安全,血清AST、ALT和肌酐水平进行了分析。AST显著升高的对照组相比正常组( 与 国际单位/ L, )。另一方面,ALT水平正常,控制组之间没有显著差异。关于肾功能,对照组明显升高肌酐水平相比正常组( 与 毫克/分升 )。Cucumis组有较低的AST水平( 与 国际单位/ L, )与对照组相比。之间没有明显差异,肌酐或ALT的任何组。这些数据显示在数字2 (g)- - - - - -2(我)。

3.6。的影响Cucumis梅洛l在炎症

3.6.1。脂肪组织巨噬细胞

CD45 +巨噬细胞在脂肪组织的总百分比明显高于正常组(对照组相比, 与 %, )。Cucumis组与对照组相比,显示一个小得多的比例的巨噬细胞( 与 %, )。此外,CD11 +巨噬细胞的比例明显高于正常组(对照组相比, 与 %, )。Cucumis集团,另一方面,较低的百分比CD11 +巨噬细胞与对照组相比,但这种差异没有统计学意义。关于CD206 +巨噬细胞,对照组百分比明显低于正常组( 与 %, )。Cucumis集团也有一个低水平的CD206 +巨噬细胞;然而,这种差异不显著。这些数据给出数据3(一个)- - - - - -3 (d)。

操作。血液单核细胞

Ly6c的百分比单核细胞对照组明显高于正常组( 与 %, ),而Ly6c的百分比单核细胞显著低于对照组比正常组( 与 %, )。与对照组相比,较低比例的Ly6c Cucumis组单核细胞( 与 %, )和Ly6c的比例更高单核细胞( 与 %, );这些差异都显著。Ly6c的百分比单核细胞的任何组之间没有显著差异。这些数据给出数据3 (e)- - - - - -3 (h)。

3.7。的影响Cucumis梅洛l .肠道微生物群

明显不同比例的肠道微生物群的成分是观察之间的控制和正常组织;具体来说,放线菌和Verrucomicrobia更丰富的对照组( 与 %, , 与 %, )。对照组也表现出了更高比例的变形菌门( 与 %, )和拟杆菌比例显著降低( 与 %, )。Cucumis组与对照组相比,显示出显著下降百分比的放线菌和Verrucomicrobia ( 与 %, , 与 %, )。此外,Cucumis集团展出的比例明显高于拟杆菌和变形菌门的比例明显降低( %与 %, , 与 %, )。的比例厚壁菌门的任何组之间没有显著差异。的比例Deferribacteres Cucumis组显著增加。表中列出的比例1和数字4(一)和4 (b);微生物群的可视化和层次聚类图中显示数据4 (c)和4 (d)。

4所示。讨论

肥胖已经成为普遍的全球许多慢性病的危险因素,特别是2型糖尿病(T2DM)病人体内(15]。肥胖的2型糖尿病,最常见的并发症,是一种复杂的疾病需要连续护理除了血糖控制(16]。Obesity-induced胰岛素抵抗(IR)是一个主要组件的病理2型糖尿病,这意味着改善IR对预防糖尿病是一种很有前途的战略。肠道微生物群最近报道干扰胰岛素信号、干扰调节葡萄糖的肥胖。这一发现表明,改变肠道微生物群在肥胖导致慢性炎症,最终导致红外和糖尿病(4]。的茎端Cucumis梅洛l .(也称为Cucumis)据报道,对糖尿病患者的血糖控制治疗效果(10,11]。以前的植物化学的研究揭示了Cucumis梅洛是一个丰富的挥发性化合物,常用药用,甾醇类,类黄酮(17),其中cucurbitacins药理作用,如王亚南,心血管,泻药,抗菌,抗炎活动18]。

在本实验研究中,两组leptin-deficient肥胖老鼠也有类似的基线空腹血糖(FBG)水平。然而,Cucumis集团在一定程度上降低光纤光栅在8周的时间点与对照组相比。OGTT可以用来识别那些尚未被诊断出患有糖尿病,但前驱糖尿病。Cucumis组在各个时间点上均表现出较低的血糖水平的OGTT与对照组相比,导致一个更小的AUC。这个发现暗示了改善糖代谢。

最被广泛接受的提议机制如何肠道微生物组恶化肥胖和红外涉及代谢内毒素的影响,具体从microorganism-derived脂多糖(LPS)。有限合伙人内毒素分泌的某些细菌和已被证明有助于潜在慢性炎症,因此驾驶肥胖的发展和红外(19]。我们的研究结果是一致的这种机制,因为Cucumis组显示改善炎症状态。微生物群组成,分析了水平的炎症Cucumis测试的假设机制的影响。数以百计的微生物在肠道中,与肥胖有关的主要门拟杆菌(16),肠道内最丰富的门。具体来说,拟杆菌门的比例已被证明是减少肥胖个体相对于精益个人(20.]。这一比例趋势也出现在我们的结果;拟杆菌门的比例是控制减少小鼠与正常小鼠相比。然而,Cucumis政府显著增加的比例相对于对照组的拟杆菌门。另一个门的上下文中讨论肥胖是厚壁菌门,第二个最丰富的门。拟杆菌门相比,厚壁菌门的比例已被证明是增加肥胖者在几项研究[2,20.]。但是,与拟杆菌门,显然已被证明是减少肥胖者在大多数研究中,它仍然是辩论是否肥胖人士体内壁厚菌门的微生物的比例上升。例如,一些研究没有发现显著差异之间精益和肥胖人士体内壁厚菌门的微生物的比例(21]。我们的实验研究信息有助于这个争论厚壁菌门在肥胖的作用。我们发现体内壁厚菌门的微生物的比例并不是在对照组升高并不是由Cucumis改变治疗。除了这两个类群,放线菌的比例已经证明在超重个体被改变。在微生物研究中,放线菌的比例在肠道被证明增加肥胖基因和high-fat-diet-induced肥胖老鼠(21]。同样,据报道,比例会更高肥胖成年人比苗条人(20.]。我们发现放线菌的比例高于对照组相比正常组和Cucumis治疗这一比例下降;这些差异都显著。这一发现同意先前的发现门放线菌是最丰富的类群之一在肥胖个体的肠道环境。

慢性炎症主要来源于脂肪组织(22]。脂肪组织巨噬细胞(atm)与增加产量的炎症分子和炎症(因此一个至关重要的因素7]。巨噬细胞具有促炎或抗炎表型,分为经典激活M1和M2或者激活巨噬细胞。M1巨噬细胞分泌高水平的促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、白细胞介素- 6 (il - 6)和il - 1β和活性氧,引发炎症反应。另一方面,M2巨噬细胞分泌抗炎细胞因子il - 10、转化生长因子-β(TGF -β)和il - 4,从而阻塞过程由M1巨噬细胞(23]。我们发现订单。Cucumis导致提高管理水平的炎症显著降低总比例的atm和较低比例的CD11C + M1巨噬细胞,也显示增加的百分比CD206 M2巨噬细胞。虽然细胞因子水平没有评估在这项研究中,M1的比例降低巨噬细胞显然认为降低TNF -炎性细胞因子水平α、il - 6和il - 1β和增加的百分比CD206 + M2巨噬细胞也建议抗炎细胞因子il - 10的水平的增加,TGF -β和il - 4。下降的趋势和CD11 +和CD206自动取款机的比例升高,分别可能反映了细胞因子表达的趋势推动从M1, M2巨噬细胞,从而改善脂肪组织的炎症状态。

单核细胞吞噬细胞在骨髓中生成和释放到血液中去。他们出现在至少两个不同的种群在老鼠身上:古典“促炎细胞表达高水平的Ly6C和模“巡逻”替代单核细胞Ly6C水平较低或没有Ly6C [24]。Ly6C血液循环中的单核细胞对炎症病变,招募了它们,它们分化成巨噬细胞炎症。另一方面,在没有炎症的情况下,Ly6C单核细胞进入正常组织和补充tissue-resident巨噬细胞(25]。控制老鼠相比,Cucumis-administrated老鼠表现出Ly6C的比例小得多单核细胞。在这项研究中,每组的血清细胞因子水平没有分析;然而,随着Ly6C单核细胞分泌炎性细胞因子TNF -α和il - 1β(26),它可以发现炎性细胞因子在水平降低。另一方面,Ly6C的百分比产生抗炎细胞因子il - 10 (27]Cucumis-treated组显著增加,表明il - 10的高水平。这一发现表明,Cucumis治疗降低血液中的单核细胞比例与炎症的倾向,但增加血液中的单核细胞比例与抗炎倾向。这结果是有趣的,因为它表明Cucumis影响血液中的单核细胞,表明系统性影响,以及其在当地影响脂肪tissue-resident巨噬细胞如前所述。

Cucumis组表现出降低胰岛素水平和HOMA-IR分数,这两个是在很大程度上减少;然而,这种差异只是HOMA-IR显著。在脂类分解,NEFAs从TG释放。这一过程已被证明是对抑制胰岛素敏感(15]。此外,NEFAs影响葡萄糖运输,几项研究已经揭示了关系(“葡萄糖脂肪酸周期”)在NEFA水平升高,糖尿病胰岛素抵抗(IR)和开发(28,29日]。因此,NEFA水平升高在对照组显示,控制动物缺乏利用胰岛素的能力,表明红外的存在。相比之下,显著降低水平NEFAs Cucumis组意味着这些动物胰岛素比对照组更有效地使用。由于胰岛素是必要的从血液中清除TG,高TGs的第一个红外在前驱糖尿病的症状。值得注意的是,Cucumis政府相比显著降低TG水平在对照组水平。降低TG和NEFA水平Cucumis-treated组建议改善IR。TG与高密度脂蛋白胆固醇的比值是一个红外的临床指标,具有更高的价值意味着加重红外(30.]。Cucumis组中我们发现TG-to-HDL比率远远低于其他两组的比例,尽管这些差异并不显著。

Cucumis用于故意引起腹泻治疗一些疾病;因此,我们评估肝脏和肾脏功能通过测量转氨酶和肌酐水平。AST、ALT和肌酐水平没有增加Cucumis组,表明Cucumis是安全的和没有肝或肾毒性。这一结果是一致的回顾性研究[31日]调查Cucumis在人类身上的安全性。AST水平甚至大大降低Cucumis组与对照组相比。然而,由于Cucumis被认为是最强大的治疗在韩医学,它应该只用于后仔细考虑处方医生专门从事韩国医学。

我们发现Cucumis管理改善葡萄糖控制通过减少炎症在肥胖的老鼠。这是通过积极改变肠道微生物群释放更少的有限合伙人内毒素。这个结果表明Cucumis可能是一种很有前途的选择预防肥胖和糖尿病,两个炎症相关的代谢疾病。

5。结论

口服的Cucumis梅洛l . leptin-deficient肥胖老鼠导致改善炎症状态与变更相关的肠道微生物群,导致更好的血糖控制。这一发现表明,Cucumis梅洛l .优点进一步调查作为一个潜在的治疗obesity-induced胰岛素抵抗。

信息披露

作者负责写作和论文的内容。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突有关出版的手稿。

确认

这项研究得到了韩国传统医学研发项目资助的卫生和福利部通过韩国健康产业发展研究所(KHIDI) (H15C0133)。