文摘

有效治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)和知识的基本机制是迫切需要的。Xiaoqinglong汤(XQL)被广泛用于治疗慢性阻塞性肺病中医,但机制尚不清楚。在这项研究中,我们测试的假设XQL通过抑制自噬在肺组织改善COPD大鼠模型。老鼠被分为五组,即对照组,COPD组,慢性阻塞性肺病+ XQL集团,慢性阻塞性肺病+雷帕霉素组和慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素组。病理变化在细胞和分子水平,细胞凋亡反映在TdT-mediated dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定,并自噬由LC3II / LC3I比率和p62水平对每个小组进行调查。与对照组相比,COPD大鼠表现出结构变化和激活肺组织炎症的发生,增强细胞凋亡和自噬生物标志物升高。XQL治疗显著改善这些变化,而雷帕霉素增强。这些数据完全证实自噬在COPD的发病机制的参与和建议XQL通过自噬抑制慢性阻塞性肺病变弱。

1。介绍

慢性阻塞性肺病是一种阻碍,长期的肺部疾病,其特征是气道重塑、慢性气道炎症,粘液分泌过多(1]。它排名第五的死亡原因为2002 (2),发生在2015年全球人口的2.4% (3]。然而,没有有效的治疗慢性阻塞性肺病。因此,迫切需要了解其发病机理和发现新疗法(4]。

吸烟是慢性阻塞性肺病的主要原因(5]。长期接触吸烟会导致炎症,因此缩小了小型航空公司和破坏肺组织(6]。炎症与激活的转录因子核因子-κB (NF -κB),肿瘤坏死因子(TNF)α,导致引发在气道细胞分泌4]。肿瘤坏死因子-α在痰和引发浓度与疾病的严重程度密切相关[4]。大鼠暴露于吸烟是慢性阻塞性肺病的广泛应用动物模型(1]。典型的慢性阻塞性肺病指标用于验证模型的成功包括结构性变化,如细支气管和小动脉壁厚和气道变窄,肺功能变化如气道阻力、炎症指标如炎症细胞和介质(TNF -α引发,等等),和细胞凋亡1]。

细胞自噬是一种机制,拆卸不必要的或不正常的胞质材料内源性或外源性起源在溶酶体(7]。这种机制具有深远影响的病理生理过程紧张,心血管,免疫,和肺系统,以及在老化7]。自噬可以由环境因素引起的;因此,在压力中扮演适应性反应的一个重要组成部分(8]。

自噬在肺部疾病的介入是假设在2000年自噬空泡被观察到在病人的肝组织α1 at-deficiency突变与肺气肿的发展(9]。这个假设是由随后的研究表明,LC3B-II的表达,关键autophagy-associated蛋白质,和自噬体的形成是增加COPD的肺与控制。(10,11]

Xiaoqinglong汤(XQL),这是记录在论述发热性疾病在中国的汉朝,用于治疗呼吸系统疾病包括咳嗽,哮喘,慢性阻塞性肺病(12]。从八个草药准备材料,即麻黄,白芍,细辛sieboldii米格。,Rhizoma Zingiberis, honey-fried licorice root, cassia twig,五味子属对,半夏ternata。虽然XQL在慢性阻塞性肺病的有效性已经在动物模型和临床试验验证,机制尚不清楚,这限制了其进一步应用程序(12]。

在这项研究中,我们假设XQL展出其anti-COPD效果通过抑制自噬的肺部组织。来测试假设,我们首先观察到自噬指标与慢性阻塞性肺病症状在烟雾诱发COPD大鼠模型确认如果动物模型成功以及自噬是否参与了慢性阻塞性肺病。其次,我们检查了上述指数的变化,当这些动物有XQL和经典的自噬诱导物雷帕霉素,分别或同时证明的有效性在衰减XQL COPD与自噬及其联系。

2。材料和方法

2.1。XQL准备

XQL是基于传统方法准备的。具体地说,14 g(麻黄,16 g的桂枝,14 g的白芍,18克五味子属对18 g的干姜,54克半夏ternata,36克honey-fried甘草,18克细辛sieboldii米格。第一次在1600毫升的水浸泡30分钟。然后混合物煮直到总量降至500毫升,历时大约30分钟。汤是用纱布过滤,subaliquoted十四50毫升塑料管子,并存储在−20°C。在每一天的实验,一个管是在室温下解冻之前XQL管理。

2.2。动物和治疗

三十岁的SD大鼠6−8周,体重230−250克也同样随机分为5组( 每组:对照组,接受任何治疗;COPD组,COPD大鼠没有进一步治疗;慢性阻塞性肺病+ XQL集团是COPD大鼠XQL对待;慢性阻塞性肺病慢性阻塞性肺病+雷帕霉素组,服用雷帕霉素的老鼠;和慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素组,COPD大鼠接受XQL和雷帕霉素。COPD组比较控制和显示COPD模型是否成功和自噬是否激活在慢性阻塞性肺病。对比COPD组和慢性阻塞性肺病+ XQL集团旨在揭示的有效性XQL和如果这种效应是autophagy-associated;比较慢性阻塞性肺病+雷帕霉素组和慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素组进一步显示是否XQL抵消与雷帕霉素引起的自噬的激活。

所有老鼠都保存在一个温控房间(21°C)在12 h / 12 h光/暗周期和免费的自来水和正常的食物。的处理和治疗动物进行按照实验动物保健的指导方针和制度动物四川大学华西医院伦理委员会。

COPD模型建立了通过组合使用香烟,脂多糖(LPS),和冷刺激。具体地说,200年第一天,一天14日μ克/千克体重的有限合伙人(准备20μg / mL的解决方案在盐水)交付使用塑料管喉咙的老鼠与乙醚麻醉后,紧随其后的是保持直立姿势15秒的老鼠促进有限合伙人在肺部的分布。每天天2−13和15−28天,老鼠被保存在一个覆盖盒(70厘米×60厘米×60厘米)和暴露在烟雾从十五不断燃烧的香烟。3分钟内每个香烟都烧坏了。烟雾浓度计算为100−120毫克/米³一段45分钟。烟雾暴露后,老鼠立即转移到一个房间在16°C和保持1小时。

从43天29天,2毫升XQL口服施用于每一个老鼠在慢性阻塞性肺病+ XQL组和慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素组。老鼠在对照组,COPD组和慢性阻塞性肺病+填喂法雷帕霉素组接受相同体积的水。此外,慢性阻塞性肺病+雷帕霉素组和慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素组雷帕霉素腹腔内注射0.2毫克/公斤,而老鼠在控制、慢性阻塞性肺病,和慢性阻塞性肺病+ XQL组注射0.2毫升的生理盐水。身体重量的老鼠每天记录。44天,收集血液样本在麻醉后大鼠的心脏。收集后,老鼠停止呼吸,肺,灌注冷盐水(4°C),立即转移到液态氮,并存储在−80°C到分析。血清是通过离心法凝固血液样本的3000 g和4°C 5分钟。

2.3。他染色

右下肺组织是由4%的多聚甲醛固定24小时,在酒精脱水12 h,嵌入在石蜡,切成4μ米部分,苏木精和伊红染色,安装在载玻片。光学显微镜下观察和拍摄的部分由一个病理学家没有知识的起源。

均值线性拦截(多层互连)、肺泡大小的指标和平均肺泡数量(人)、肺泡的密度指标,测定肺肺气肿的程度进行评估。衬里的数量(NS)和肺泡总数(Na)计算,和图像的面积(S)是用一张他的照片。多层互连和人是根据公式计算多层互连= L / NS和男人= Na / S。对于每个指标,计算平均值从六个随机选择的字段,每个从一个老鼠的肺13]。

2.4。TdT-Mediated dUTP缺口末端标记(TUNEL)

肺的细胞凋亡是评估使用TUNEL检测和TUNEL细胞凋亡测定装备E607172从Sangon购买生物科技(上海)有限公司,有限公司(上海,中国),制造商的指示。简单,上面描述的石蜡切片deparaffinized二甲苯和酒精,与蛋白酶K permeabilized 37°C,持续15分钟,和孵化连续TDT酶解和抗体。处理部分CKX41SF荧光显微镜下观察和拍摄(奥林巴斯公司(日本东京)。

2.5。ELISA

血清炎症指标水平引发和TNF -α使用ELISA试剂盒测定(NeoBioscience、深圳、中国)后,制造商的指示。一个Multiskan MK-3标(热费希尔科学、芬兰)是用来读取吸光度。

2.6。免疫印迹分析

西方墨点法应用于量化LC3在肺组织和p62蛋白质。左肺重和蛋白质提取。大约5毫克的组织是均质和离心机在12000年并为10分钟4°C。上层清液转移到另一个瓶,蛋白质浓度测定用BCA蛋白质分析工具包(Beyotime®生物技术,上海,中国。蛋白质样本悬浮在5×加载缓冲区,变性5分钟在100°C,由15%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到硝化纤维膜电洗脱(200毫安)。这些墨迹被封锁在Tris-buffered盐水与5%脱脂牛奶含有0.1% Tween-20 (TBST) 37°C 2 h,然后一夜之间孵化与主LC3抗体(1:500;Proteintech), p62 (1: 1000;亲和力),β肌动蛋白(1:2000;Abcam)在4°C。膜与TBST洗和暴露于二次抗体(1:3000)在室温下为1.5 h。与TBST三洗后,免疫反应性的蛋白质是可视化使用ChemiDoc XRS +系统(Bio-Rad实验室,Inc .)、美国)。微密度值被表示为目标蛋白/β肌动蛋白的比例。

2.7。统计分析

所有数据都是基于每组六个动物。数据表示为平均数±标准差最小显著差后,相比使用单向方差分析和测试通过SPSS 16.0 (IBM公司,纽约)。 被认为是显著的。

3所示。结果与讨论

3.1。病理变化

COPD大鼠与对照组大鼠相比,显示支气管的微观结构的变化,即缩小气道炎症和气道壁,后者,增加气道壁炎症细胞的浸润。XQL政府部分逆转这些变化,如慢性阻塞性肺病+ XQL集团所示。雷帕霉素政府在慢性阻塞性肺病+雷帕霉素和慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素组病理改变与慢性阻塞性肺病恶化和慢性阻塞性肺病+ XQL组,分别。之间的比较慢性阻塞性肺病+雷帕霉素和慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素组表明,后者经验不如前者(图结构变化1)。

半定量的测量表明,多层互连在COPD大鼠显著增加。雷帕霉素增强的变化而XQL减毒。同样,人在COPD大鼠显著降低。这一趋势被雷帕霉素,但被放大XQL(图1)。

ELISA结果(图2)表明,COPD大鼠表现出更高的血清水平的引发和TNF -α比控制。XQL治疗慢性阻塞性肺病(+ XQL集团)显著减弱这些变化而雷帕霉素治疗慢性阻塞性肺病(+雷帕霉素组)显著扩大了TNF -α增加。与慢性阻塞性肺病+雷帕霉素组相比,慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素组显示更高水平的引发和TNF -α,这表明雷帕霉素提高了慢性阻塞性肺病发炎,而XQL减毒。

每个老鼠的体重记录整个研究(补充材料,表S1)。一般来说,控制老鼠的平均体重高于其他组,表明慢性阻塞性肺病对动物健康的危害。与慢性阻塞性肺病+雷帕霉素的老鼠相比,慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素的老鼠表现出更高的体重,表明保护XQL对老鼠的总体幸福程度的影响。

3.2。细胞凋亡

TUNEL测试表明,与对照组相比,大鼠COPD组表现出更高水平的细胞凋亡(图3)。与慢性阻塞性肺病组相比,大鼠的细胞凋亡水平在慢性阻塞性肺病+ XQL组低,而慢性阻塞性肺病+雷帕霉素组高。慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素组显示细胞凋亡活动低于COPD +雷帕霉素组活动但高于慢性阻塞性肺病+ XQL组。上述数据显示,雷帕霉素放大在COPD大鼠细胞凋亡,而XQL政府抵消这种效应。

3.3。自噬

图4结果显示免疫印迹LC3II / LC3I比率和p62水平每组中。COPD大鼠,并没有进一步的治疗,显示LC3II / LC3I比率较高。与COPD大鼠相比,慢性阻塞性肺病+ XQL集团LC3II / LC3I比率较低,而慢性阻塞性肺病+雷帕霉素组显示LC3II / LC3I比率较高。慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素组表现出更高的比率LC3II /比慢性阻塞性肺病LC3I + XQL集团,但LC3II / LC3I比率低于COPD +雷帕霉素组。

在p62方面,水平在所有四个COPD组明显低于对照组。慢性阻塞性肺病+ XQL组显示p62水平高于慢性阻塞性肺病组,而慢性阻塞性肺病+雷帕霉素组显示p62水平低于COPD组。此外,慢性阻塞性肺病+ XQL +雷帕霉素组显示p62水平高于慢性阻塞性肺病+雷帕霉素组。

这些结果表明,LC3II / LC3I比率在COPD大鼠和调节和p62水平下调XQL可以减弱或逆转这些变化。XQL诱导的保护作用抵消了雷帕霉素,自噬激活,这表明相反XQL和雷帕霉素的影响。

慢性阻塞性肺病的老鼠在这项研究中表现出典型的症状和疾病的特点。XQL治疗改善这些症状,而雷帕霉素恶化。自噬生物标志物,LC3II / LC3I比率升高而COPD大鼠中p62浓度降低;这些变化被雷帕霉素扩大政府但XQL减毒的治疗。这些数据完全展出XQL的影响,这是相反的自噬激活雷帕霉素。

雷帕霉素激活自噬通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶mTOR [14]。这个过程是伴随着p62的表达降低,增加LC3的表达(15]。自噬体形成时,处理LC3-I LC3-II lipidation;因此LC3-II / LC3-I的比例是自噬的标志(16]。两种现象被观察到在这项研究中(图4)。

自噬参与COPD已经被许多研究证实。例如,陈等人发现microtubule-associated蛋白1轻链3β(LC3B)激活细胞凋亡在香烟烟雾诱发肺气肿的小鼠模型中,表明自噬负责细胞凋亡在肺部疾病(17]。

草药用于治疗肺部疾病已经很长时间了。除了XQL以外,其他草药,如泽泻东方,也规定作为补救肺部水肿等疾病和慢性阻塞性肺病。研究机制的乙醇提取的块茎泽泻东方慢性阻塞性肺病在细胞模型显示,这种效果是由于抑制LC3II,伴随着mTOR的激活18]。也观察到类似现象,在目前的研究中,显示由XQL抑制自噬。

因此,它提出了一个问题的哪个组件XQL负责其影响慢性阻塞性肺病和自噬。XQL是中国传统药物准备从八个草药,其中只有一个工厂,五味子属对,研究它对自噬的影响。然而,成分五味子属对被发现激活,而不是抑制自噬在这些研究。例如,Schisandrin,组件五味子属对通过激活自噬流量,显示肝脏保护作用和抑制细胞凋亡在老鼠身上19]。Schisandrin B,一种抗氧化剂的木酚素五味子属对通过自噬的激活,保护神经元β注入大鼠(20.]。

总结上述的草药和自噬的研究表明,所有的草药表现出保护作用。然而,XQL和泽泻东方保护肺组织对慢性阻塞性肺病通过抑制自噬,五味子属对,一个组件在XQL,表现出其对肝脏的保护作用并通过激活自噬神经元损伤。这些现象看起来矛盾,但实际上可能是一致的,因为尽管激活自噬展品在许多疾病的保护作用,它在慢性阻塞性肺病起有害作用。这可能是由于这一事实长期暴露的烟雾不断激活自噬和超过autophagy-mediated细胞死亡(有益的一面8]。因此,慢性阻塞性肺病草药的保护作用可能是由于抑制自噬,而其他组织损伤的保护作用是由于自噬的激活。

应该注意的是,考虑到XQL是八草本植物的组合,每一个包含各种组件,负责药理作用的成分和化合物在这项研究仍不清楚,这是一个挑战在所有研究草药。

这项研究的另一个局限性是没有之间的样本收集完成建模和XQL开始治疗。因此,目前尚不清楚XQL预防或逆转慢性阻塞性肺病的进步。然而,这项研究清楚地表明,XQL在COPD大鼠具有保护作用,抑制自噬相关。

4所示。结论

总而言之,这项研究支持了假设XQL抑制慢性阻塞性肺病的进步通过衰减自噬过程。还需要进一步的研究来调查的关键组件负责这种效应的汤。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者承认支持四川省科技部门计划(2013 sz0001-5)对金融支持。

补充材料

表S1:每组大鼠的身体重量和星期,这表明总体幸福的老鼠。老鼠的身体重量(克)每组和一周的治疗。(补充材料)