文摘

客观的。这项研究的目的是评估的黄烷酮类治疗效果景天属植物sarmentosumCCl Bunge (FSSB)₄全身的大鼠肝纤维化和行动的潜在机制。方法。肝纤维化的实验模型建立了CCl皮下注射的老鼠₄(40% v / v, 3毫升/公斤)每周两次了六个星期。FSSB(100、200和400毫克/公斤)是intragastrically每天服用一次连续五周。结果。我们的结果表明,CCl FSSB明显较低₄全身的肝纤维化可以通过减少高浓度血清生化指标和提高组织学变化,包括减少海拔血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)水平,减少炎症细胞的浸润,肝组织胶原纤维。此外,与模型组相比,FSSB明显下调的蛋白质和mRNA表达TGF -β1、TGF -β1受体I和II (Tβ国际扶轮和TβRII)、Smad2 Smad3,波形蛋白在肝组织,同时上调Smad7和钙粘蛋白的表达。结论。结果表明,CCl FSSB缓解₄全身的肝纤维化可能通过抑制TGF -β/ TβR / Smad通路反过来抑制上皮间充质转变。

1。介绍

肝纤维化是一种病理过程引起的各种风险因素,如病毒感染、酗酒、胆道阻塞、非酒精性脂肪肝和炎症。其实质是增加合成和细胞外基质(ECM)过度沉积。相信肝星状细胞(HSC)的原始细胞肝脏细胞外基质的形成。肝星状细胞的激活和增殖导致肝纤维化,从而产生大量的ECM各种signal-transducing蛋白的表达。在肝纤维化的发病机制,转化生长因子-β1 (TGF -β1)被认为是一个主要profibrogenic细胞因子激活肝星状细胞(1]。此外,TGF -β1防止新的ECM的合成和分解增加ECM沉积,导致加速肝纤维化的发展。发挥其生理和病理活动与其受体结合(Tβ国际扶轮和TβRII)和Smads激活下游信号通路。的传导激活Smads TGF -β1转移它的信号直接从细胞表面受体(Tβ国际扶轮和TβRII)进入细胞核。此外,一些研究已经表明,TGF -β1 / TβTGF - R / Smad信号通路介导的β1是肝纤维化的主要信息转导通路(2,3]。因此,阻断TGF -β1 / TβR / Smad信号通路可以作为一个有效的策略来预防或治疗肝纤维化(4]。

上皮间充质转变(EMT)是一个动态的过程,在上皮细胞失去表型属性并逐渐获得间充质属性(5]。这被认为是一个至关重要的过程在肝脏长期发展,和最近的研究表明,EMT与肝纤维化的进展(6,7]。许多细胞因子和生长因子已被证明参与EMT的刺激和肝纤维化的形成。例如,TGF -β1,一个关键的profibrogenic中介,被确定为一个upregulator EMT (8]。TGF -β1诱发EMT主要由下游Smads信号通路,这需要两种类型的受体Tβ国际扶轮和TβRII。因此,增加表达的TGF -β1、激活信号转导由TGF -β1可能导致EMT的形成,导致肝脏纤维化。如果我们想抑制EMT治疗肝纤维化,它是一个紧迫的任务为扰乱TGF -发现一些有效的药物β1生产和阻断其下游Smads信号通路。

景天属植物sarmentosumBunge(单边带),称为chuipencao中药里,是一种最常用的原油草药在亚洲,显示王亚南活动,常用于治疗急性和慢性肝炎(9]。在先前的研究中,单边带保护作用在抗炎、抗衰老、保护肝脏、降低转氨酶,抗肿瘤,antihepatic纤维化,促进肝细胞的再生10- - - - - -13]。黄烷酮类的景天属植物sarmentosumBunge (FSSB)是源自于草药单边带的主要生物活性成分,含有槲皮素、山柰酚和异鼠李亭木樨草素。时至今日,据报道,FSSB可以治疗慢性炎症,防止细菌繁殖,预防肝癌,治疗急性肝损伤。此外,FSSB HSC的增殖抑制细菌的能力,引入HSC的凋亡,并阻止纤维化(14,15]。然而,FSSB在纤维化的药理作用仍有争议。

因此,这项研究的目的是评估CCl FSSB反对的治疗效果₄全身的肝纤维化,进一步探索行动的可能机制。我们的研究结果表明,FSSB CCl发挥了治疗作用₄全身的肝纤维化可能通过抑制TGF -β1 / TβR / Smad通路和上皮间充质转变。

2。材料和方法

2.1。FSSB的制备及其质量控制

景天属植物sarmentosumBunge(单边带)购买从华东医药有限公司有限公司(浙江,中国)和被熊Yaokang教授生药学、浙江中国医科大学。FSSB的提取和纯化进行了根据我们先前的研究。简单,草浸泡在80°C和80%乙醇提取两次为1.5 h。过滤后,提取的解决方案是适当浓缩,然后采用石油醚3次。然后,treated-extract减压蒸馏回收乙醇和纯化,D101大孔型树脂和聚酰胺柱层析。提取的解决方案是首先添加到D101大孔型树脂柱吸附24 h和筛选了翻床体积的乙醇(10%,30%,50%,和70%)2毫升/分钟。每个洗脱馏分收集,然后进行聚酰胺柱层析法,以进一步净化。该方法类似于D101大孔型树脂。最后,收集洗脱溶液,蒸发干燥黄酮类提取物、FSSB命名。

总类黄酮含量测定的紫外分光光度法(如前所述16]。短暂,用芦丁对照品和硝酸铝显色剂、类黄酮提取测定比色法在506 nm和计算芦丁等价物的毫克每克固体。

日本岛津公司(日本)高效液相色谱系统,包括四个泵,自动取样器、柱温箱、紫外检测器,用于确定四类黄酮化合物的内容,槲皮素、山柰酚和异鼠李亭木樨草素。高效液相色谱柱是Kromasil KR-5C18(Ф250毫米×4.6毫米,5μ米)。(a)的混合流动相是甲醇和甲酸(B) 0.1% (48: 52, v / v);流率保持在1.0毫升/分钟;检测波长为360 nm;色谱柱的温度是30°C;注射体积是10μl。根据样品峰的保留时间与真实的参考标准相比,四个化合物被确定。每个化合物的内容在FSSB决心利用外标法。

2.2。动物和治疗

雄性SD大鼠( ,6到8周的年龄,230 - 250克)从上海Sipur-Bikai购买实验动物有限公司(质量证书号码:SCXK(胡),2013 - 0016年)。老鼠们被安置在浙江中医药大学实验动物中心。

大鼠随机分为6组(总 在每组):正常对照组、模型组、FSSB 100毫克/公斤集团FSSB 200毫克/公斤集团FSSB 400毫克/公斤,和水飞蓟素组200毫克/公斤。FSSB的为我们的实验中,药物剂量的选择基于以前的研究关于antihepatic纤维化FSSB [14]。CCl引起的肝纤维化大鼠模型₄如前所述(17,18]。简单地说,老鼠(除正常对照组)皮下注射3毫升/公斤CCl 40%₄溶解在橄榄油(v / v)每周两次连续六周。与此同时,正常控制动物注射同等体积的橄榄油。CCl的最后六周₄治疗,FSSB(100、200和400毫克/公斤)溶解在生理盐水是intragastrically每天服用一次连续五周。水飞蓟素组intragastrically水飞蓟素处理作为一个积极的团体。老鼠在正常对照组和模型组接受相同体积的生理盐水每天在同一时间。eleven-week实验期后,老鼠与戊巴比妥钠麻醉,然后牺牲。生化指标样本收集和肝脏标本解剖从所有的动物。部分肝组织组织病理学分析缓冲福尔马林固定在4.5%,和另一个肝脏组织的其他部分是储存在−测量80°C的信使rna和蛋白质。

2.3。生化测量血液中

血浆丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平用自动生化分析仪测定。和水平的透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)测定根据制造商”年代指令。所有血清生化指标检测生物化学实验室的浙江中医药大学第一附属医院。

2.4。组织学分析

每个动物的肝组织切除被固定在缓冲福尔马林溶液(4.5%)至少24小时。在石蜡包埋后,固定组织切成5毫米厚的部分然后用苏木精和伊红染色(他)和马森的三色的评估肝纤维化的程度。

2.5。定量聚合酶链反应(PCR)

TGF -的mRNA的表达β1、TGF -β1受体(Tβ国际扶轮),TGF -β1受体2 (TβRII) Smad2 3、7、钙和波形蛋白是由实时PCR检查,如前所述执行(19,20.]。总RNA分离使用RNA isoPlus肝组织样本,然后mRNA相对地转录成cDNA根据试剂的指令。引物序列(表1)是由上海Jierui公司合成。使用GAPDH作为内部参考,相对的信使rna表达水平确定方法(21]。

2.6。免疫印迹分析

实验性大鼠肝组织(100毫克)被放置在EP管它包含1毫升里帕充分溶解产物和均质在冰上。组织的碎片被离心10分钟在12000 rpm在4°C。蛋白质提取剩余的上层清液进行了分析通过使用一个布拉德福德化验设备。总蛋白质是解决钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚乙二烯薄膜(PVDF)。阻止5%脱脂乳60分钟后,细胞膜随后被孵化一夜之间适当的初级抗体和辣根peroxidase-conjugated二级抗体。主要抗体TGF -β1、Tβ国际扶轮TβRII Smad2 3、7、钙和波形蛋白是来自Abcam,主要抗体β肌动蛋白是来自圣克鲁斯。洗膜后,免疫反应性的乐队的密度进一步分析了微使用增强化学发光检测系统。

2.7。统计分析

所有与SPSS统计分析软件(版本17.0),和所有的数据被显示为±SD方法。两组之间的差异进行评估,用单向方差分析统计显著性。 或 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。质量评价FSSB

FSSB总类黄酮的含量,计算为芦丁,701.21毫克/克。通过高效液相色谱分析,如图1槲皮素的内容,木樨草素、山柰酚和异鼠李亭FSSB 128.32毫克/克,86.23毫克/克,38.75毫克/克,分别和45.67毫克/克。

3.2。CCl FSSB减轻₄全身的功能和组织学损伤

CCl后₄六周注射每周两次,老鼠经历了严重的肝损伤,增加血清生化指标显示,包括ALT, AST, HA、LN(表2)。然而,随之而来的FSSB治疗对创新领导力的治疗效果₄全身的伤,通过减少这些高浓度的ALT, AST, HA、LN相对于模型控制剂量依赖性的方式(表2)。

肝脏部分沾他和马森的三色的组织学评估肝纤维化。如数据所示2和3,正常对照组肝小叶的安排,中央静脉周围径向不等。没有变性,坏死,肝组织胶原增生。CCl后₄管理六个星期,严重肝损伤和病变观察相对于正常的控制,包括肝小叶结构破坏,肝细胞坏死,肝索排列紊乱、炎症细胞的浸润,大量的胶原蛋白增生,pseudolobular形成和广泛分布的纤维(数字2和3)。然而,与模型组相比,明显FSSB治疗预防病变组织学损伤和改善,如图2和3,这表明FSSB CCl起到治疗作用₄全身的肝纤维化。

3.3。CCl FSSB预防₄针对TGF -全身的肝纤维化β1 / TβR / Smad通路

自TGF -β1 / TβR / Smad通路在肝纤维化的进展中扮演一个重要部分,我们首先分析了TGF -蛋白表达水平β1 / TβR / Smad在实验大鼠肝脏组织。根据免疫印迹结果,三地₄有力地提高了蛋白质的表达TGF -β1及其受体(Tβ国际扶轮和TβRII)从模型组大鼠肝组织,并显著降低肝Smad7(图4)。此外,观察到Smad2和Smad3蛋白表达在老鼠的肝脏模型组相对于正常对照组显著增加(图4)。FSSB治疗5周后,结果表明,FSSB可以增加TGF -β1、Tβ国际扶轮TβRII、Smad2 Smad3蛋白表达,同时上调的蛋白表达Smad7(图4)。另外,上面的mRNA水平的细胞因子通过rt - pcr检测。信使rna表达水平的变化TGF -β1 / TβR / Smad相似(图的蛋白表达水平5)。上面的结果清楚地表明,FSSB CCl与保护₄针对TGF -全身的肝纤维化β1 / TβR / Smad途径。

3.4。FSSB抑制上皮间充质转变CCl导致慢性肝纤维化₄

调查FSSB antifibrotic效应是否通过抑制介导上皮间充质转变(EMT)在肝细胞中,我们测量了水平的钙粘蛋白和波形蛋白在肝组织免疫印迹和rt - pcr检测。如数据所示6和7CCl,与正常对照组相比,₄政府导致波形蛋白的表达显著增加,减少钙粘蛋白的表达。FSSB治疗后,它清楚地表明,FSSB明显减弱这两种细胞因子的蛋白表达较模型组。从图明显6FSSB有能力,抑制蛋白质表达波形蛋白在肝组织内,同时上调粘附蛋白表达的剂量依赖性的方式。此外,FSSB的影响钙粘蛋白和波形蛋白mRNA表达相似(图的蛋白表达水平7)。因此,据透露,FSSB有很强的抑制房地产的EMT肝纤维化的进展。

4所示。讨论

作为一种常见的疾病,肝纤维化是慢性肝损伤的结果在很长一段时期,这将导致晚期肝硬化和肝功能衰竭(22]。我们已经知道,肝纤维化已成为世界性的疾病,严重威胁着人们的健康,但它是可逆的。然而,缺乏理想的药物作为治疗肝纤维化的antifibrotic代理目前(23]。因此,它是一个紧迫的任务发现一些有效的药物预防或治疗肝纤维化和调查对疾病的作用机制。显然最近,几项研究表明,一些植物的药物如姜黄素,水飞蓟素,甘草甜素,notoginsenoside有益的通过不同的机制对预防或治疗肝纤维化的影响(24- - - - - -27]。虽然据报道,黄烷酮类来自单边带可以防止肝纤维化在某种程度上由于其抗炎性质,肝纤维化的治疗还不是很清楚。直到今天,对T的关系βR和EMT在研究中对肝纤维化的机制。在目前的研究中,我们报告说,CCl FSSB有治疗效果₄全身的肝纤维化及其潜在的作用机制。结果表明,FSSB调制TGF -β1 / TβR / Smad反过来抑制信号通路对肝纤维化EMT在疾病的发展。

CCl引起的肝纤维化₄经典化学肝损伤模型,被广泛用于研究肝纤维化和肝硬化的肝脏功能和组织学的变化(28]。在这项研究中,动物被CCl皮下注射₄建立肝纤维化模型,根据DomitrovićJakovac [29日]。组织病理学分析显示,三地₄造成明显的肝脂肪变性,坏死,炎症细胞的浸润,胶原蛋白增生,pseudolobular形成和广泛分布的纤维。我们的研究结果表明,intragastrical管理FSSB每天一次连续5周可以显著减轻肝脏病大鼠的症状包括改善肝脂肪变性,减轻小叶炎症细胞浸润,减少大量的胶原增生。人们普遍认为ALT和AST被认为是肝细胞损伤的最敏感指标,和HA、LN与活化的HSC和肝纤维化的形成。在这种背景下,血清ALT, AST, HA、LN病理升高是由于三地的肝毒性₄。然而,随之而来的FSSB治疗降低的水平升高血清生化指标相对于模型控制剂量依赖性的方式。这些结果证实CCl FSSB起到了保护作用₄全身的肝纤维化大鼠模型。

在肝纤维化过程中,TGF -β1被认为是一个关键profibrotic细胞因子(2]。这是最有效的纤维发生的因素对促进ECM通过激活HSC与某些影响。正如我们所知道到目前为止,TGF -β1必须结合其受体(Tβ国际扶轮和TβRII)和依赖于下游Smads信号通路发挥其生理和病理活动。在经典的TGF -βTGF - 1信号通路激活βTGF - 1绑定βII型受体(TβTGF - RII)新兵βI型受体(TβRI),从而导致复合TGF -的形成β1 / TβRII / TβRI。另一方面,这种化合物和激活Smad2 Smad3随后新兵。激活Smad2和Smad4 Smad3绑定在一起他们允许易位的复杂到核调节目标基因的表达。此外,作为抑制剂TGF -β1 / Smad信号,Smad7抑制Smad2磷酸化,并破坏TGF -β1反应[30.]。此外,TGF -β1信号直接从细胞表面受体(T迁移βR)的原子核与指导激活Smads在肝纤维化的发展。

越来越多的证据表明,TGF -β1 / TβR / Smad信号通路被认为是一个潜在的antifibrosis目标对CCl引起的肝纤维化₄:TGF -β1、Tβ国际扶轮TβRII、Smad2 Smad3高度差异的形式记录或蛋白纤维组织的动物模型或人类样本,而smad7的表达却降低了。人们普遍认为TGF -β1 / TβR / Smad信号通路在肝纤维化的发展中扮演至关重要的角色。我们目前的结果表明,FSSB明显下调T的水平β国际扶轮TβRII TGF -β1、Smad2和Smad3以及差异smad7表达式。所有这些发现证实FSSB CCl防止肝纤维化引起的₄可能通过抑制TGF -β1 / TβR / Smad途径。

我们已经知道,EMT一直被视为一个关键机制在肝纤维化的进展。最近的研究表明,ECM不是唯一因素导致肝纤维化;上皮细胞可以转移能力和表达典型的成纤维细胞的标记EMT然后参与肝纤维化的形成(31日]。据报道,某些成人肝细胞类型有能力接受EMT体内和过度EMT在肝脏修复会导致肝纤维化(32]。EMT可以进一步确定通过验证上皮形态钙粘蛋白的细胞蛋白表达,并通过检查的变化波形蛋白(间质表型标记)33]。因此,抑制钙粘蛋白表达和波形蛋白水平增加已确定EMT的标志(34]。

到目前为止,几个信号通路诱导EMT: TGF -β1 / TβR / Smad通路,Wnt通路,Notch通路和PI3K / Akt通路。在这些途径中,TGF -β1 / TβR / Smad途径尤其是相关EMT增加波形蛋白的表达,抑制钙粘蛋白通过其能力水平。它是公认的TGF -β1是最重要的upregulator EMT因为它能带来许多上皮细胞(EMT35]。此外,EMT在肿瘤细胞如结肠癌细胞,皮肤癌症细胞,以及乳腺癌细胞可以通过降低逆转T的表达βr .靶向治疗,抑制T的表达β国际扶轮会有能力阻止EMT通过促进上皮表型的形成和减少间质分化。之前报道,Smads也与EMT (36]。因此高水平的Smads有趣,如Smad2 Smad3,和Smad4,能促进EMT在乳腺上皮细胞的形成,虽然Smad7视为EMT TGF -引起的负面调节器β1。在这项研究中,我们的研究结果表明,CCl FSSB抑制肝细胞EMT的₄全身的纤维化体内。管理FSSB上皮标记钙粘蛋白的表达明显增加和减少间叶细胞波形蛋白标志。

5。结论

总之,本研究表明CCl FSSB明显较低₄全身的肝纤维化。行动的详细分子机制可能是其强大的抑制属性激活TGF -β1 / TβR / Smad信号,从而抑制了EMT在肝纤维化的进展。我们的调查结果表明,FSSB可能是一个潜在的新型治疗药物治疗肝纤维化。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这个项目是由中国国家自然科学基金(批准号81703833),浙江省自然科学基金(批准号LQ15H290001),浙江中医药大学研究基金会(批准号2016 zg02)。