文摘

糖尿病周围神经性疼痛(DPNP)是一种常见的和棘手的糖尿病并发症。传统疗法总是不理想;开发新型药物仍然需要获得更好的缓解疼痛。最近的证据表明,炎症参与DPNP的发病和维护。的抗炎特性Tanshinone花絮(TIIA)是一种很有前途的候选人阻止或改变感知疼痛。这个研究调查TIIA能否减弱DPNP在链脲霉素(STZ)诱导大鼠模型和其潜在的机制。TIIA STZ-induced提高糖尿病大鼠40毫克/公斤的剂量为3周一天一次。TIIA热痛觉过敏和机械触诱发痛的影响使用行为进行了测试。的mRNA水平和表达白介素- 1 (IL)β白介素- 6 (IL),肿瘤坏死因子(TNF),α,白介素- 10 (IL)在第四到第六段的背根神经节(L4-6 DRG)检测到定量实时PCR (qPCR)和免疫印迹。TIIA治疗显著衰减机械触诱发痛和热痛觉过敏在糖尿病大鼠。此外,促炎细胞因子il - 1的表达β、il - 6和TNF -α被抑制,抗炎细胞因子il - 10的水平被TIIA增加。这项研究表明TIIA具有显著antiallodynic和antihyperalgesic效果的老鼠模型STZ-induced DPNP,和影响可能与其抗炎属性关联。

1。介绍

DPNP的流行范围从20%到24%,糖尿病患者在糖尿病神经病变患者(从40%到50%1,2]。DPNP特点是自发性疼痛、痛觉过敏和异常性疼痛,其中一些甚至发展到痛觉减退在高级阶段,这往往会导致睡眠障碍和抑郁和被动地影响患者的健康相关生活质量(3]。除了对个人的负面影响,这也导致了严重的社会和经济负担4]。强调DPNP机制尚不清楚。现有的治疗DPNP主要关注血糖控制和改变生活方式。目前的药物如抗抑郁剂,钠和钙通道阻滞剂,阿片类药物通常是由不良事件(无效的和复杂的5]。因此,当务之急是寻找痛苦的并发症的糖尿病的有效药物。

丹参Bunge(丹参在中国)是最著名的中国传统草药有超过1000年的临床应用(6]。丹参的生物活性已被广泛研究,以及超过100个纯化合物已经被孤立,被归类为亲水性酚醛树脂(亲脂性的奎宁6]。TIIA是主要来自丹参二萜之一,表现出不同的药理活性,如抗氧化(7,抗炎8),和抗癌6,9]。TIIA已被广泛用于治疗各种疾病,包括动脉粥样硬化(10],脑梗塞[11),和脊髓损伤12]。糖尿病动物模型,不仅TIIA预防糖尿病肾病(13),但也有保护作用在糖尿病神经病变的运动和感觉神经功能受损(14]。先前的研究已经表明,TIIA显著antinociceptive效果完全弗氏佐剂(CFA)诱导炎症疼痛模型以及在骨癌痛模型通过抑制促炎细胞因子基因的转录15,16]。然而,目前尚不清楚是否TIIA施加antinociceptive效应在STZ-induced DPNP模型。因此,本研究旨在探索治疗作用的TIIA DPNP的大鼠模型。

2。材料和方法

2.1。动物

共有40名男性Sprague-Dawley (SD)老鼠从至关重要的河流购买公司(中国,北京),重200至220克,分配分为3组。动物被安置在SPF房间在实验室控制条件下(温度、 °C;相对湿度40 - 60% 12 h光/暗周期),并允许自由获取食物和水。,上午9点至17点之间的所有实验进行了h。由于多尿症,动物每天床上用品了。动物研究机构动物伦理委员会批准的中日友好临床医学研究所的医院。从实验结果有些痛苦可能,国际研究协会的痛苦(IASP)委员会研究和伦理问题的指导方针是(17]。

2.2。药品和试剂

Tanshinone花絮(纯度> 99%)来自成都德斯图尔特生物科技有限公司有限公司(四川,中国)。链脲霉素(STZ)购买的σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。以下主要抗体(Abcam、马、英国)是用于免疫印迹分析:TNF - (ab6671), il - 1 (ab2105)、il - 6 (ab9324)和il - 10 (ab33471);抗体 肌动蛋白(sc - 47778)购买从圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。增强化学发光(ECL)检测试剂获得HuaXingbio生物技术中心(中国,北京);bicinchoninic酸(BCA)蛋白质分析工具和里帕裂解缓冲Beyotime获得生物技术研究所(海门,中国)。

2.3。试验协议

经过一个星期的适应,糖尿病在一夜之间禁食动物诱导一腹腔内注射STZ(60毫克/公斤,刚做好的在0.1 mol / L柠檬酸缓冲,pH值4.5)。年龄和体重匹配控制老鼠注射同等数量的车辆(0.1 mol / L柠檬酸缓冲,pH值4.5)。三天注射STZ后,血糖水平测量尾静脉血液样本。大鼠血糖水平大于16.7更易/ L是包括在这项研究中。每组大鼠治疗如下:对照组( ):正常动物处理车辆(蒸馏水腹腔内);DM组( ):糖尿病动物处理车辆(蒸馏水腹腔内);DM + TIIA集团( ):糖尿病动物对待TIIA 50毫克/公斤。治疗开始后3周注射STZ和持续了3周18]。在此期间,糖尿病动物显示烦渴症状,多尿,多食症,和减肥19]。TIIA粉末溶解在蒸馏水(浓度0.5%)和腹腔内注射的老鼠的日常管理;根据以往的文献(剂量测定14,20.]。

血糖监控间隔期间的实验。行为评估热痛觉过敏和机械触诱发痛上执行第0,3日,4日,5日,6日一周的学习。在第六周,行为评估后,老鼠在所有的组织与戊巴比妥钠麻醉(40毫克/公斤)。在解剖显微镜下,DRG L4-L6水平被移除,并立即在液态氮冷冻和储存在−80°C到生化分析。然后由颈椎脱位老鼠牺牲。

2.4。行为测试
2.4.1。异常性疼痛的评估

决心异常性疼痛评估的爪子提取阈值的意思是·冯·弗雷测试。和之前描述的过程验证了Chaplan et al。21]。总之,老鼠被放置在测试笼网底部;行为适应被允许15 - 20分钟,直到主要梳理和笼勘探停止活动。冯·弗雷毛(1.4,2,4,6,8,10,15日和26 g)是应用于足底表面的中间后爪,最多8年代引出爪子撤军的阈值。突然爪子撤军,舔,握手被认为是积极的反应。相同的过程重复三次相同的爪子,至少5分钟间隔连续两个过程。三个值的均值被认为是为每个老鼠爪子撤军阈值。

2.4.2。评估的痛觉过敏

痛觉过敏评估通过测量爪撤军延迟辐射热使用哈格里夫斯方法(22]。简单地说,老鼠被放置在一个有机玻璃框没有限制;15 - 20分钟后习惯化时期足底爪子被暴露在表面的红外辐射热(IITC生命科学模型390年,林地丘陵、钙、美国)通过玻璃地板。爪子撤军延迟定义为从辐射热的发病的时间大鼠后爪的撤军。热源被调整至平均基线值10 - 12秒,截止时间为20秒,以防止组织损伤。测试了4次在同一爪子以5分钟间隔,最后的意思是三个值被认为是热延迟撤军。

2.5。实时定量PCR (qPCR)

解冻L4-L6 DRG中均质1毫升的试剂盒试剂(Beyotime、海门、中国);总RNA分离根据制造商的指示。核糖核酸的纯度由分光光度计量化(A260/280)。总RNA的互补脱氧核糖核酸合成使用PrimeScript™RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类生物,志贺大津,日本)。逆转录反应在下列条件下进行:(i) 37°C 15分钟和5分钟(2)85°C,紧随其后的是储存在4°C。qPCR反应进行了ABI 7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司)SYBR绿色我PCR混合工具包(应用生物系统公司)。每个反应由一个20的体积 l样本(2 l cDNA、10 0.4 l 2 x SYBR绿色混合物 每个引物l和7.2 l nuclease-free水)。协议由一个初始变性在95°C 2分钟,其次是40周期为30秒95°C的变性,退火30秒60°C,和扩展在72°C,持续30秒。融化曲线生成的每次运行以确保产品的一致性。每个样本进行了一式三份,结果取平均值。GAPDH是作为内部控制记录。相对变化在mRNA水平决定的 方法如前所述。用于实时PCR引物序列表进行了总结1。

表1
摘要PCR引物序列的分析目标基因。
2.6。免疫印迹分析

冷冻L4-L6 DRG解冻,在冰冷的均质里帕裂解缓冲(Beyotime)含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。然后均质组织离心机在12000 rpm 15分钟在4°C,以及由此产生的上层清液收集。提取的蛋白质浓度测定BCA化验。蛋白质样品(50 ug)在95°C变性5分钟,通过sds - page分离,然后转移到PVDF膜(微孔)。膜被封锁的5%脱脂牛奶在室温下1 h,然后孵化与主抗体:TNF - (1:1000;ab6671), il - 1 (1:1000;ab2105)、il - 6 (1: 1000;ab9324)、il - 10 (1: 1000;ab33471), 肌动蛋白(1:10000;sc - 47778)在4°C一夜之间,其次是与TBST洗。最后,膜与HRP-conjugated孵化二级抗体在室温下1 h。信号检测与超级ECL工具包和x射线胶片。特定的乐队由明显的分子大小进行评估。选择带的强度被ImageJ软件标准化和量化 肌动蛋白密度。

2.7。统计分析

结果分析了SPSS (Ver19.0)。分析的显著差异是单向方差分析(方差分析),其次是至少显著差异(LSD)测试。所有结果均值±SEM, a 值< 0.05被认为是统计上的不同。

3所示。结果

3.1。TIIA对体重和血糖水平的影响

到注射STZ后的第三天,85.7%的老鼠发达高血糖( );他们的血糖水平在统计学上高于控制大鼠( ),实验期间没有明显改变。有明显的减肥STZ-induced糖尿病大鼠与控制大鼠( )。TIIA治疗没有改变体重和血糖水平(数据图所示1)。

(一)
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(b)
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图1
的影响Tanshinone花絮在STZ-induced糖尿病大鼠的体重和血糖。(一)体重(BW);(b)血糖(BG)。细胞毒性t淋巴细胞,正常老鼠;DM + Veh DM大鼠治疗的车辆;DM + TIIA, DM大鼠治疗Tanshinone花絮。结果表示为±SEM手段( /每组, 对CTL组)。
3.2。TIIA对热痛觉过敏的影响和机械触诱发痛

第三周结束时,机械爪撤军阈值和热爪子撤军延迟被显著降低DM和DM + TIIA组比对照组( )。TIIA治疗3周增加了爪子撤军阈值和爪子延迟撤军DM + TIIA组相比,DM组( )(图2)。

(一)
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(b)
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图2
的影响Tanshinone花絮”的参与者和TWL STZ-induced糖尿病大鼠。(一)机械爪撤军阈值(MWT);(b)热爪子撤回延迟(TWL)。细胞毒性t淋巴细胞,正常老鼠;DM + Veh DM大鼠治疗的车辆;DM + TIIA, DM大鼠治疗Tanshinone花絮。结果表示为±SEM手段( /每组, 与细胞毒性t淋巴细胞, 而DM + Veh集团)。
3.3。TIIA对mRNA的表达炎性细胞因子(il - 1β、il - 6、TNF -α背根神经节(L4-L6)和il - 10)的

理解背后的分子机制的功能TIIA, qPCR被用来确定il - 1的mRNA水平 ,il - 6、TNF - ,并在DRG il - 10。在研究结束时,在DM组,il - 1的mRNA水平 ,il - 6和TNF - 在DRG显著提高( )和il - 10是低于对照组( )。3周的治疗TIIA减少促炎细胞因子(il - 1的mRNA水平 ,il - 6和TNF - )和提高抗炎细胞因子(il - 10)(图3)。

(一)
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(b)
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(c)
(c)
(d)
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图3
的影响Tanshinone花絮在mRNA水平的il - 1β、il - 6、TNF -α,并从实验大鼠DRG中il - 10。il - 1的mRNA水平β、il - 6、TNF -α,并与qPCR il - 10进行了分析。细胞毒性t淋巴细胞,正常老鼠;DM + Veh DM大鼠治疗的车辆;DM + TIIA, DM大鼠治疗Tanshinone花絮”( 每个组; 与细胞毒性t淋巴细胞, 而DM + Veh集团)。
3.4。影响TIIA炎性细胞因子(il - 1的蛋白表达β、il - 6、TNF -α背根神经节(L4-L6)和il - 10)在

il - 1的蛋白水平 ,il - 6和TNF - 增加,il - 10在DM组相比,减少了控制老鼠。如图43周的治疗TIIA导致显著降低il - 1的表达 ,il - 6和TNF - 和重大upregulation il - 10。


图4
的影响Tanshinone花絮在il - 1的蛋白表达β、il - 6、TNF -α,并从实验大鼠DRG中il - 10。il - 1的蛋白水平β、il - 6、TNF -α,il - 10测定免疫印迹。(一)免疫印迹il - 1的结果β、il - 6、TNF -α,il - 10。(b)归一化后的靶蛋白乐队densitometrically分析β肌动蛋白。每个实验重复三次,类似的结果。细胞毒性t淋巴细胞,正常老鼠;DM + Veh DM大鼠治疗的车辆;DM + TIIA, DM大鼠治疗Tanshinone花絮。( 为每个组; , 与细胞毒性t淋巴细胞群; , 而DM + Veh集团)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现TIIA治疗减毒机械触诱发痛和热痛觉过敏有糖尿病的老鼠。此外,我们的数据证实,痛苦的行为正好与炎性细胞因子的表达变化(TNF - ,il - 1 ,il - 6和il - 10)在大鼠糖尿病STZ诱导。此外,TIIA治疗减少了促炎细胞因子(TNF -水平 ,il - 1 ,和il - 6)和抗炎细胞因子(il - 10)水平升高的DRG STZ-induced糖尿病大鼠。所有的发现表明一个antiallodynic antihyperalgesic TIIA能力对付STZ-induced糖尿病大鼠的炎症反应。

近年来,STZ-induced糖尿病鼠已广泛应用于DPN研究[19,23]。目前的研究表明,3周后注射STZ糖尿病大鼠表现减少爪阈值和爪子撤军延迟撤军,指示的外观机械触诱发痛和热痛觉过敏。这些结果都与观测一致在一些先前的研究[24,25]。然而,一些其他报告显示糖尿病动物的热痛觉减退[19,23,26]。我们推测,这种差异可能与下列因素有关:糖尿病持续时间(早期或晚期);严重的糖尿病状态;行为测试方法和不同种类的动物用于实验研究。

能够很好的接受,大多数的糖尿病并发症,包括DPNP,是由长期高血糖引起的。我们的研究显示,3周的治疗TIIA显著衰减机械触诱发痛和热痛觉过敏但不影响血糖水平。一些先前的研究也报道许多其他化合物对糖尿病并发症产生有益的影响,包括神经病变、肾病没有任何影响STZ-induced高血糖和身体减肥(27,28]。此外,在人类和动物的研究中,传统的DM治疗甚至强化血糖控制未能防止糖尿病神经病变(29日]。这些数据表明,治疗效果的TIIA DPNP与血糖水平没有关系。

糖尿病神经病变的发病机制复杂,涉及多个通路。在过去的十年中,研究表明神经性疼痛的发病机制与神经元之间的相互作用有关,炎性免疫细胞,免疫细胞衍生炎性细胞因子(30.]。代谢变化引起的高血糖导致分泌炎性细胞因子的免疫细胞激活居民和招募了免疫细胞,导致生化改变和神经损伤,最终导致疼痛相关症状(25,29日]。越来越多的证据表明,炎症细胞因子在开发和维护中发挥关键作用的神经性疼痛。先前的研究表明,患者痛苦的神经病变和TNF - - 2 mRNA和蛋白水平增加 和减少水平的il - 4和il - 10 (31日]。在动物模型中,改变疼痛行为与TNF -升高有关 水平(32],intraneural应用促炎细胞因子il - 1 和肿瘤坏死因子- 诱发行为与疼痛相关迹象(33]。在目前的研究中,我们的数据表明,增加促炎细胞因子(il - 1 ,肿瘤坏死因子- ,和il - 6)和降低抗炎细胞因子(il - 10)在DRG可能与触诱发痛和痛觉过敏STZ-induced糖尿病大鼠。

调节细胞因子的生产通过下调促炎细胞因子和/或移植抗炎细胞因子的平衡和恢复支持/抗炎细胞因子在神经系统视为神经性疼痛治疗策略(34]。鞘内il - 1管理 和肿瘤坏死因子 拮抗剂以及il - 6中和抗体减弱神经性疼痛行为模型(35- - - - - -37]。HSV当地表达介导的IL10 DRG抑制痛苦的神经病变在糖尿病大鼠的发展38]。然而,它被认为是il - 1 ,肿瘤坏死因子- ,和il - 6产生彼此通过正反馈的生产,代理协同放大炎症信号(39),这当然会导致一个恶性循环的慢性炎症如果不能充分抑制,所以很难达到令人满意的改善疼痛症状,调节只有一个单一的细胞因子。与细胞因子拮抗剂通过阻断只有一个特定的炎性细胞因子,草本植物提取物影响作品的多种细胞因子,减少过度的炎症反应,导致副作用相对较少。在动物模型中,染料木素缓解神经性疼痛神经损伤后的差别,通过对这些基因的il - 1 和il - 6 (40];香豆素的止痛效果是由减少避免神经损伤——(SNI)诱导upregulation促炎细胞因子TNF - ,il - 1 ,和il - 6在受损DRG [41];生物活性的分数番荔枝属网状树皮减弱痛苦的糖尿病神经病变通过减少炎性细胞因子(il - 1 ,il - 6和TNF - )和增加抗炎细胞因子(il - 10)42]。符合文学,在目前的研究中,与TIIA 3周的治疗后,信使rna和蛋白质水平的il - 1 ,il - 6和TNF - 减少,il - 10表达升高,同时减轻机械触诱发痛和热痛觉过敏。

在目前的研究有一定的局限性。我们只专注于在DRG细胞因子表达在我们的研究中。在其他的实验中,细胞因子也以坐骨神经,DRG,和脊髓40,43- - - - - -45]。然而,信使rna和蛋白质水平的变化的总体趋势是相同的。此外,众所周知,高血糖诱导氧化应激导致神经损伤导致DPNP [46]。的抗氧化性质TIIA也可能导致其antiallodynic和antihyperalgesic效果(7]。还需要进一步的研究来探索替代机制,强调TIIA的治疗效果。

总之,本研究表明,TIIA治疗减轻机械触诱发痛和热痛觉过敏在STZ-induced糖尿病大鼠模型。此外,TIIA显著调节一些炎性细胞因子的表达在这个模型。因此,antinociceptive TIIA活动可以认为,至少在某种程度上,它的抗炎作用。这些发现表明,TIIA可能的候选药物DPNP治疗。进一步的调查在较大的动物,甚至人类仍然是需要的。

的利益冲突

作者没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81173424,81173424,81673793)。