文摘
Bushenkangshuai平板(BSKS)是一种中草药化合物已被用于治疗心血管和脑血管疾病在中国几十年了。本研究拟探讨载脂蛋白e BSKS对动脉粥样硬化的分子机制−−/老鼠。ApoE−−/老鼠与西式饮食6周,然后给出BSKS 6周。结果表明,BSKS减毒的大小动脉粥样硬化病变,减少内脏脂肪含量,降低血脂。我们还发现BSKS促进了脂联素及其受体的表达,抑制toll样受体4和核factor-kappa B的表达,减少的水平interleukin-1β,单核细胞趋化蛋白1,和血管细胞粘附molecule-1,增加白细胞介素- 10”和脂联素的水平。我们的数据提供了证据,BSKS施加一个antiatherosclerotic效应通过降低血脂和抑制炎症反应通过TLR4和NF -κB信号通路。
1。介绍
动脉粥样硬化(AS)是心血管和脑血管疾病的主要病理基础,被认为是一种炎症性疾病1]。众所周知,肥胖对心血管和脑血管疾病的风险增加(2]。内脏脂肪组织分泌几个adipocytokines,如脂联素、瘦素、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),已被证明是减少或增加动脉粥样硬化(3,4]。越来越多的证据表明,脂联素产生的一个重要antiatherogenic效应降低粘附分子的水平,防止TNF -α全身的激活核factor-kappa (NF - BκB),抑制平滑肌细胞的增殖和迁移,减少泡沫细胞的形成和血小板聚集(5- - - - - -7]。更重要的是,一项研究证实,脂联素抑制toll样受体(TLR)介导的NF -κB信号在小鼠巨噬细胞(8]。这些脂联素的影响不仅来自系统分泌,但也可能是由于局部分泌通路,血管周围脂肪组织(9]。
Bushenkangshuai平板(BSKS)是一种中草药化合物已被用来治疗心血管疾病在诊所10,11]。BSKS由丹参Bunge (red-rooted的根源鼠尾草、丹参),Reynoutria野蔷薇(研究)。Moldenke (蓼属植物multiflorumHeshouwu),茯苓(等)。狼。(茯苓涪陵),海藻螺旋体(转)。c Ag)。(海藻Haizao),Ecklonia kuromeOkam。(Kunbu昆布属植物),Taxillus sutchuenensis(Lecomte)在(寄生桑Sangjisheng),杜仲摘要采用。(树皮杜仲杜仲),五角对林。(中国菟丝子的种子,Tusizi), Testudinis认真等Plastrum(龟甲,)电器柜架及菖蒲属菖蒲var。angustatus贝瑟(石菖蒲Soland。,Shichangpu),扁桃体脓肿寻常的l .(修复、Xiakucao),当归纹状体直流。(当归wallichiiChuanxiong),柑橘橙l .(陈皮,Chenpi),肉桂(l)j . Presl(肉桂,Rougui),种植党参(法语)。Nannf。(种植党参、党参)。研究表明,丹参据报道,Bunge加速巨噬细胞胆固醇流出通过瞄准过氧物酶体proliferator-activated受体γ和肝X受体α(12,13]。Reynoutria野蔷薇(研究)。Moldenke和茯苓(等)。狼。在食源性建议有antihyperlipidemic影响高脂血症(14,15]。海藻螺旋体(转)。c Ag)。据报道,减少单核细胞粘附内皮细胞通过抑制肿瘤坏死因子-α全身的NF -κB信号(16]。Taxillus sutchuenensis(Lecomte)在减少没有生产264.7 lipopolysaccharides-induced原始细胞(17]。杜仲摘要采用。和柑橘橙l具有抗炎活性(18,19),而五角对林。和扁桃体脓肿寻常的l .有抗氧化作用[20.,21]。我们之前的研究已经证实BSKS兔子可以降低实验性动脉粥样硬化的抑制NF -κB信号通路和炎症因素(22]。在这项研究中,我们打算进一步研究载脂蛋白e BSKS对动脉粥样硬化的分子机制−−/老鼠。
2。材料和方法
2.1。动物
八周大的雄性C57BL / 6 j小鼠和载脂蛋白e−−/背景与C57BL / 6 j小鼠称重- g从北京获得Huafukang生物科学有限公司有限公司(中国,北京)(证书编号SCXK (Jing) 2014 - 0004) (23]。老鼠被安置在组(4 /笼)21°C和41 - 62%相对湿度下12 h光暗周期和美联储与标准饮食和自由水。本研究的动物协议是根据美国国立卫生研究院的执行指导实验室动物保健和使用的(24动物伦理委员会批准的),天津中医药大学(天津)。
2.2。药物
Bushenkangshuai平板(猫。TJZB-Z2008110052数量,规格:0.5克/平板)提供的第一个教学医院的药剂科天津中医药大学(天津),是基于良好的生产实践和实验室实践的指南。其质量控制符合医疗机构天津食品和药物管理局(fda)的标准。BSKS总共15个组件组成:丹参邦基集团,Reynoutria野蔷薇(研究)。Moldenke,茯苓(等)。狼。,海藻螺旋体(转)。c Ag)。Ecklonia kuromeOkam。Taxillus sutchuenensis(Lecomte)中,杜仲摘要采用。,五角对林。,Testudinis Carapax et Plastrum,菖蒲属菖蒲var。angustatus贝瑟,扁桃体脓肿寻常的l当归纹状体直流。,柑橘橙l肉桂(l)j . Presl,种植党参(法语)。Nannf。每个组件的比例在BSKS是相等的。阿托伐他汀片(猫。H20051407数量,规格:10毫克/片)购买辉瑞制药有限公司有限公司(中国大连)。
2.3。实验设计
ApoE−−/老鼠是世界上最常用的动脉粥样硬化动物模型;主动脉粥样硬化病变可能出现自发或诱发的西式饮食在很短的时间内(25]。它产生在C57BL / 6 j小鼠的基因背景。因此,我们使用的载脂蛋白e−−/小鼠模型和C57BL / 6 j小鼠正常的控制。C57BL / 6 j小鼠与正常饮食喂养和指定为对照组 。ApoE−−/老鼠与西式饮食(21%脂肪和胆固醇0.15%,猫。H10141数量,北京Huafukang生物科学有限公司)为6周,然后被分成一个模型组 BSKS集团 ,阿托伐他汀组 。模型组小鼠有0.3毫升的等密度的无菌蒸馏水填喂法,小鼠BSKS组有1365毫克/公斤BSKS解决方案,填喂法(人类等效剂量:128毫克/公斤·d),和给予阿托伐他汀组小鼠3毫克/公斤阿托伐他汀的解决方案,填喂法(人类等效剂量:0.28毫克/公斤·d)。BSKS和阿托伐他汀的解决方案准备:BSKS平板电脑和阿托伐他汀药片被杵碎和地面然后被转移到一个管和溶解在0.3毫升等密度的无菌蒸馏水为每一个鼠标。
2.4。组织收集和体重记录
6周的治疗后,小鼠麻醉注射10%水合氯醛腹腔内,和身体重量的老鼠都被记录下来,血液,肝脏,白色脂肪组织,和主动脉进行检测。肝脏和白色脂肪组织(附睾脂肪垫)仔细从小鼠解剖和生理盐水。他们干滤纸和重量记录,比老鼠的身体重量。肝脏重量的比值的体重和白色脂肪组织的重量比体重被用来评估身体脂肪沉积后美联储与西式饮食。
2.5。苏木精和伊红染色
从主动脉瓣固定主动脉根部(部分胸降主动脉)是脱水和嵌入在石蜡。Five-micrometer横截面是准备和苏木精和伊红染色。主动脉和斑块测量由两个独立的观察员使用图像分析软件Image-Pro + 6.0(媒体控制论,Inc .,罗克维尔市,医学博士,美国),然后是动脉粥样硬化病变的大小和相对主动脉根的损伤区域进行了计算和测量。
2.6。血脂检测
血液收集从老鼠的眼睛(轨道眼角静脉丛)用毛细玻璃管。0.1毫升的全血可以获得每个时间。血液离心15分钟3000转的速度。血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)(猫。数字A111-1和A110-1、南京建成生物工程研究所、中国南京)检测到的单试剂COD-PAP方法。低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)和高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)(猫。数字A113-1和A112-1、南京建成生物工程研究所、中国南京)双试剂直接检测到的方法。比色分析执行使用标(类型:无限M200 PRO, Tecan Mannedorf,瑞士)。
2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)
血液后蛋白质的水平测量根据制造商的指示:interleukin-1β(il - 1β)、白细胞介素- 10”(il - 10)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1),血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1)和脂联素(使用mouse-specific ELISA试剂盒(猫。数字SEA563Mu SEA056Mu SEA087Mi、SEA547Mu SEA605Mu,武汉USCN商业有限公司,有限公司,武汉,中国)。简而言之,样本孵化为30分钟37°C,然后被暴露于biotin-conjugated检测抗体和streptavidin-HRP,分别为60分钟37°C。稳定的发色体和停止的解决方案是添加到终止反应,然后板块在450 nm (OD值)在2小时内使用分光光度计。
2.8。免疫印迹分析
主动脉是解剖老鼠和放在埃普多夫管中,沉浸在液氮snap-freeze他们。增加了5微克的主动脉l冰冷的裂解缓冲的同质化,然后不断搅拌是维持在4°C 2 h。管离心20分钟在12000 rpm微型离心机在4°C,然后是浮在表面的在一个新的管吸气,蛋白质定量测定。等量的蛋白质(30μg蛋白/ lane)使用8 - 12% SDS-polyacrylamide凝胶电泳在三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液系统中,紧随其后的是电泳转移到PVDF微孔膜,与以下主要抗体:孵化anti-adiponectin抗体(1:1000年,猫。2789年代,细胞信号技术),anti-adiponectin受体1 (AdipoR1)抗体(1:1000年,猫。数量ab126611 Abcam) anti-adiponectin受体2 (AdipoR2)抗体(1:1000年,猫。号码sc - 514045, Santa Cruz), anti-Toll-like受体4 (TLR4)抗体(1:1000年,猫。14358年代,细胞信号技术),anti-NF -κB p65抗体(1:1000年,猫。8242年代,细胞信号技术)。在4°C孵化隔夜后,探讨了膜与二级HRP-labeled免疫球蛋白g h和l抗体和用磷酸盐三次。特定的目标蛋白质被化学发光可视化。所有乐队都是半定量的分析与ImageJ软件(马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院、美国)。
2.9。统计分析
数据被表示为平均数±标准差。执行统计分析使用单向方差分析(方差分析)以及Fisher最小显著差测试多个比较。所有分析使用社会科学统计软件包(SPSS)版本11.5(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。 或0.01(双边)被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。BSKS ApoE降低动脉粥样硬化病变−−/老鼠
探讨BSKS对动脉粥样硬化的发展,载脂蛋白e−−/与西式饮食的老鼠BSKS治疗,疗程6周。BSKS对动脉粥样硬化的影响与积极的药物阿托伐他汀。在实验期间,没有任何不利影响可以观察到。主动脉根用于评价动脉粥样硬化。石蜡的主动脉根被苏木精和伊红染色和定量分析(图1)。ApoE的主动脉根−−/老鼠增厚相比,内膜层WT老鼠。BSKS和阿托伐他汀显示58.62%和51.72%减少动脉粥样硬化病变的大小( μ米2在BSKS, μ米2阿托伐他汀与 μ米2在模型)和还显示显著减少相对病变区域 。这些结果表明,BSKS显示出类似的阿托伐他汀与动脉粥样硬化的影响。
(一)
(b)
3.2。BSKS减少内脏脂肪含量和降低血脂水平
进一步证明antiatherosclerotic BSKS效果,我们下一个评估内脏脂肪堆积和血脂水平(图2)。我们发现BSKS和阿托伐他汀显著降低ApoE的体重−−/与西式饮食的老鼠 。更重要的是,他们还减少了肝脏重量比体重和体重白色脂肪组织的比例 。ApoE−−/与西式饮食的老鼠为6周明显增加血清TC, TG、低密度和高密度脂蛋白胆固醇下降( ,而WT老鼠)。药物治疗6周后,我们发现BSKS显示一个类似与阿托伐他汀降脂效果,降低血清TC、TG、低密度和高密度脂蛋白胆固醇显著增加 。这些结果提供的证据表明,antiatherosclerosis BSKS效应可能是由于改善血脂代谢。
(一)
(b)
3.3。BSKS提升Adiponectin-Dependent抗炎通路
探索BSKS对动脉粥样硬化的分子机制,我们进行免疫印迹分析主动脉粥样硬化(图3)。我们发现BSKS在动脉粥样硬化和阿托伐他汀增加脂联素的表达 。BSKS但不是阿托伐他汀提升AdipoR1和AdipoR2的表达 。Atherosclerosis-mediated炎症反应促进炎症受体TLR4的表达和炎症信号NF -κB显著 。BSKS和阿托伐他汀对显著抑制TLR4和NF -κB 。BSKS的炎症抑制效应可能是由于促进脂联素及其受体。
3.4。BSKS减少促炎介质和增加抗炎介质
随着炎症信号通路被BSKS抑制,我们想找出BSKS是否可能影响下游炎症介质。我们进行ELISA检测血清中水平(图4)。结果表明:载脂蛋白e−−/与西式饮食的老鼠为6周增加了水平的血清促炎介质 ,包括il - 1β、MCP-1 VCAM-1,血清抗炎介质的水平下降 ,如il - 10和脂联素。药物治疗6周后,我们发现BSKS和阿托伐他汀减少促炎介质的水平和增加显著抗炎介质的水平 。上述结果表明,BSKS不仅抑制炎症信号传导蛋白,而且监管下游炎症介质。
4所示。讨论
本研究表明,BSKS ApoE降低动脉粥样硬化病变−−/小鼠模型。BSKS机制参与减少内脏脂肪含量、血脂下降,增加脂联素及其受体的表达,减少TLR4的表达和NF -κB在主动脉粥样硬化,以及促进抗炎介质释放,抑制促炎介质生产血液中。本研究为临床应用提供了潜在的分子机制的BSKS心血管疾病。
缺血性血管疾病大多与动脉粥样硬化病变(23),而肥胖很多股票与动脉粥样硬化的风险因素,提出一些常见的机制在这些疾病中,如proatherogenic血脂(26),增加产量的促炎细胞因子(27),而内皮功能障碍患病率(28]。内脏脂肪组织,但不是皮下脂肪组织,尤其与心血管风险增加有关(29日]。证据表明,内脏adipose-related ApoE炎症促进动脉粥样硬化的发展−−/老鼠(30.]。在我们的研究中,我们发现,西式饮食增加肝脏的重量和白色脂肪组织,和BSKS治疗内脏脂肪重量的比率降低体重。更重要的是,BSKS管理6周的水平显著降低TC、TG、血液中的低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平增加,这些影响是类似于阿托伐他汀。这些结果表明,BSKS降低动脉粥样硬化病变减少内脏adipose-related炎症和降低血脂。
脂联素,由脂肪细胞分泌的一种激素,起着重要的作用在防止动脉粥样硬化的发展31日,32]。脂联素对动脉粥样硬化的基本机制是由于抑制NF -κB信号在单核细胞/巨噬细胞和内皮细胞(33]。此外,脂联素可以降低内皮细胞凋亡,促进一氧化氮通过腺苷生产5′一磷酸- (AMP)激活的蛋白激酶(AMPK)信号通路34]。最后,脂联素抑制平滑肌细胞增殖和迁移,以减少泡沫细胞形成通过激活AMPK信号通路(35]。在这里,在我们的研究中,脂联素及其受体在主动脉粥样硬化和血液中脂联素被BSKS调节治疗,而TLR4的表达和NF -κB p65主动脉被BSKS抑制,其次是抑制促炎介质,包括il - 1β、MCP-1 VCAM-1。这些结果表明antiatherosclerotic BSKS效果可能参与促进抗炎介质和抑制炎症反应通过TLR4和NF -κB p65信号通路。另一方面,在巨噬细胞胆固醇积累促进炎症反应,并激活炎症信号导致泡沫细胞胆固醇积累,进一步放大炎症反应(36),所以之间有一个相声胆固醇积累和炎症反应。减少动脉粥样硬化病变,改善血脂代谢BSKS可能抑制炎症信号通路的原因和促炎介质。
总之,本研究表明,动脉粥样硬化的发展被BSKS体内能够缓解。BSKS的潜在机制,改善血脂代谢,促进动脉粥样硬化病变的脂联素及其受体,抑制炎性信号通路。然而,进一步的研究需要阐明BSKS起主要作用的活性成分在抑制动脉粥样硬化。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Shu-chao彭日成的概念研究。李鹏和张Jun-ping执行数据分析和写的手稿。圆圆Wang Hui-yun贾,李元(Bi,美玲陈做了实验。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金资助(81403334,81403334),中国福建省自然科学基金(没有。2016 j01413),中国广东省自然科学基金(没有。2016 a030313860)。