文摘

甲状腺癌是最常见的一种类型的癌症在内分泌系统。在最新的研究中,骆驼蓬碱已被证明抑制几种癌症的生长在体外和体内。在目前的研究中,我们评估的体外和体内抗癌效率对甲状腺癌细胞系TPC-1骆驼蓬碱。骆驼蓬碱的体外细胞毒性评价XTT试验表明,骆驼蓬碱抑制TPC-1细胞增殖的剂量和时间的方式。此外,骆驼蓬碱剂量依赖性TPC-1诱导细胞凋亡的细胞通过调节bcl - 2、Bax的比率。TPC-1细胞的集落形成能力也是时间被骆驼蓬碱。骆驼蓬碱的抑制效应对迁移和入侵TPC-1细胞研究了伤口抓和Transwell化验。体内评价表明,骆驼蓬碱有效地抑制了甲状腺癌的生长在裸体小鼠的剂量依赖性的方式。因此,骆驼蓬碱可能是一个有前途的草药在甲状腺癌的治疗,还需要进一步的努力来探索这种治疗策略。

1。介绍

甲状腺癌是最常见的一种类型的癌症在内分泌系统包括四个主要类型与乳头状甲状腺癌(PTC)是最常见的一个1]。尽管大多数的ptc反应良好,手术和化疗,迅速对化疗产生抗药性的一部分,产生迫切需求的新策略来提高化疗的疗效[2]。

最近越来越多的证据证明了有前景的抗肿瘤中药的效率(3- - - - - -5]。白藜芦醇,一些草药,如骆驼蓬碱和小檗胺,显示大量的肿瘤抑制作用对一系列癌症(6- - - - - -8]。在所有这些草药,骆驼蓬碱,原本孤立的种子Peganum harmala三环化合物属于β咔啉生物碱(9]。据报道,骆驼蓬碱具有多种药理活性(10]。在最新的研究中,骆驼蓬碱已被证明抑制几种癌症的生长在体外和体内11,12]。例如,骆驼蓬碱诱导肿瘤细胞的凋亡导致DNA断裂在DNA碎片和隧道研究黑色素瘤细胞(13]。可能的机制包括同源重组的块,一个主要的双链断裂(双边带)修复途径的抑制端粒酶活性(9,12]。然而,没有发现相关报道在甲状腺癌骆驼蓬碱的抗肿瘤作用。

在目前的研究中,我们评估了骆驼蓬碱的体外和体内抗癌效率对甲状腺癌。骆驼蓬碱的细胞抑制作用被XTT试验测量。细胞凋亡的甲状腺癌细胞系TPC-1被DAPI染色法测量。凋亡相关蛋白表达被西方墨点法评估。骆驼蓬碱的影响在TPC-1细胞的迁移和入侵也抓和Transwell化验检查伤口。体内抗肿瘤效应是检查在甲状腺癌异种移植模型。

2。材料和方法

2.1。材料

骆驼蓬碱是从σ购买有限公司。(圣路易斯,美国)。骆驼蓬碱溶解在DMSO对原液的浓度为10毫克/毫升。解决方案是由储备溶液稀释成工作中最后的DMSO溶液的浓度低于0.1%。人类乳头状甲状腺癌细胞系TPC-1购买从生物化学和细胞生物学研究所,中国科学院(中国上海)。TPC-1细胞培养在RPMI 1640 (w L-glutamate)完成胎牛血清(10%)和青霉素和链霉素(1%)在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。

男性和女性的裸体小鼠(ν/ν;6 - 8周大,体重在18到22岁的g)是购自南京医科大学动物中心(中国南京)。动物协议是审查和批准的机构动物保健和使用委员会南京医科大学。

2.2。体外细胞毒性

TPC-1细胞被播种在96 -孔板每口井的10000个细胞的密度和允许种植治疗前24小时。细胞培养与升级骆驼蓬碱的剂量(2、4、8、16、32和64年μ36岁的g / mL) 24和48 h。媒介是50所取代μL XTT工作方案和孵化了18 h。每个的光密度测量在560 nm标(美国大力神Bio-Rad)。

2.3。DAPI染色

细胞被播种在封面的过失24-well板和允许24小时生长。细胞被暴露在三种骆驼蓬碱的浓度(4、8、16μ为36 h g / mL)。被PBS洗后,细胞被冷甲醇和丙酮的混合固定为5分钟(1:1)。4μg / mL 4′, 6-diamidine-2′-phenylindole盐酸盐(DAPI)添加到好,允许在室温下孵化了10分钟。荧光显微镜下细胞成像。

2.4。免疫印迹

与骆驼蓬碱TPC-1细胞孵化(4、8、16μg / mL) 6小时。细胞总蛋白提取和量化的教学设备。50μ克的蛋白质在电泳是加载到每个。蛋白表达是通过免疫印迹先前报道来衡量的。主要抗体(anti-Bax、anti-Bcl-2和反β肌动蛋白)从σ购买有限公司。(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.5。单独分析

第一个执行单独试验研究骆驼蓬碱的抑制TPC-1细胞的集落形成能力。细胞治疗与骆驼蓬碱(4、8、16μ36岁的g / mL) 24和48 h。另一个单独测定进行评价机体骆驼蓬碱的影响。TPC-1细胞处理2μg / mL骆驼蓬碱和升级的辐射剂量单独或结合。每次治疗后,细胞使胰蛋白酶化,收集,并设置计算浓度。10 - 14天的孵化后6-well盘子,6-well板块被0.5%结晶紫染色,算作报道之前(14]。

2.6。DNA碎片分析

TPC-1细胞被播种在24-well板并允许增长24 h。细胞被暴露在三种骆驼蓬碱的浓度(4、8、16μ为36 h g / mL)。总DNA提取和先前报道得由凝胶电泳(15]。

2.7。伤口抓化验和Transwell试验

细胞被播种在6-well板和允许24 h形成单层生长。小费是用来抓中间产生一个明确的空间(伤口)。立即被相机和被指定为0 h。然后用无血清培养基中取代了含不同浓度的骆驼蓬碱(4、8、16μg / mL)。36小时之后,另一个图像被测量伤口的宽度。伤口愈合率是由以下公式计算:伤口的平均宽度为0 h−伤口的平均宽度在36 h /伤口的平均宽度为0 h。

Transwell化验进行在24-well Transwell钱伯斯(美国康宁,阿克顿,MA)报道。短暂,TPC-1细胞无血清培养系统在参议院被播种,而室底部充满了完全培养基作为引诱剂。36小时后,成功地入侵细胞室底部被结晶紫染色,计算和绘制。

2.8。体内抗肿瘤功效

短暂,150万年TPC-1细胞被注入皮下注射左腋窝空间的老鼠。10天后,老鼠的肿瘤结节体积达到70 - 80毫米³被随机分为四组每组6小鼠。升级剂量的骆驼蓬碱是由尾静脉注射。

然后老鼠升级处理剂量的骆驼蓬碱与盐的控制。肿瘤体积是由一个卡尺测量每隔一天在整个实验。肿瘤体积(电视)是用以下公式来计算:电视= (,在那里肿瘤结节的宽度吗的长度是肿瘤结节。

2.9。统计分析

结果提出了的意思SD。统计分析是由学生的以及和方差分析。的值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。骆驼蓬碱的细胞毒性和诱导凋亡TPC-1细胞

如图1,升级剂量的骆驼蓬碱有效地降低了细胞的生存能力在不同的孵化时间(图1)。骆驼蓬碱的IC50值对TPC-1细胞在24日,36岁,和48 h,,μ分别g / mL。有人指出IC50值显著降低随着培养时间延长。因此,骆驼蓬碱抑制TPC-1细胞的扩散时间和剂量依赖性的方式。

如图2很明显,定位骆驼蓬碱治疗组凋亡细胞的形态学特征与光明的DAPI染色法与凝聚染色质形成新月形的概要文件的外围细胞核或单独的球状结构(凋亡的身体)。定量分析表明三组之间的显著差异处理剂量的骆驼蓬碱升高,这是按照(图中的结果细胞毒性测试3)。图4表明,骆驼蓬碱有效诱导的DNA碎片TPC-1细胞剂量依赖性的方式,展示了细胞凋亡诱导效应。

3.2。骆驼蓬碱对凋亡的影响蛋白质和Caspase-3的活动

研究骆驼蓬碱诱导凋亡的可能机制,细胞凋亡相关蛋白的表达受到免疫印迹评估。如图5的骆驼蓬碱、治疗剂量依赖性诱导表达的伯灵顿和退化的现有bcl - 2,导致的比例明显降低bcl - 2 /伯灵顿,这证明了细胞凋亡的进展。

在TPC-1 Caspase-3细胞的活动处理一系列的骆驼蓬碱的剂量评估的半胱天冬酶比色蛋白酶试验装备。作为细胞凋亡的重要介质之一,Caspase-3被认为是一种凋亡标记由于其重要的角色在催化特定乳沟的关键蛋白质和一代的凋亡。图6表明,骆驼蓬碱有效提升Caspase-3的活动,这是按照细胞凋亡检测的结果数据2和3。

3.3。骆驼蓬碱对TPC-1细胞的集落形成能力有或没有辐射的结合

图7(一)显示单独测定TPC-1骆驼蓬碱的细胞。TPC-1细胞的集落形成能力被骆驼蓬碱时间和剂量依赖性抑制。TPC-1细胞存活率下降百分比骆驼蓬碱浓度的增加,孵化时间延长,证明骆驼蓬碱的抗增殖作用与细胞毒性试验的结果是相一致的。

图7 (b)表明,2μg / mL骆驼蓬碱有效增强辐射的抑制作用TPC-1细胞的集落形成能力。百分比有显著区别独自生存的辐射和辐射+骆驼蓬碱,这展示了潜在的机体骆驼蓬碱的影响。

3.4。骆驼蓬碱对TPC-1细胞的迁移和入侵

图8表示的骆驼蓬碱对伤口愈合的影响率TPC-1细胞。骆驼蓬碱剂量依赖性降低TPC-1细胞的伤口愈合率,这表明骆驼蓬碱的抑制作用在甲状腺肿瘤细胞的迁移。同样,骆驼蓬碱抑制入侵TPC-1细胞存在剂量依赖的相关性如图9。统计分析显示治疗组之间的显著差异与不同剂量的骆驼蓬碱。同样,入侵细胞的数量明显减少,骆驼蓬碱的浓度增加。结果伤口,Transwell化验证明骆驼蓬碱是有效地抑制TPC-1细胞的流动方式存在剂量依赖的相关性,这使得它的潜在的药物逆转肿瘤的转移。

3.5。体内抗肿瘤评估骆驼蓬碱对TPC-1异种移植

骆驼蓬碱的体内抗肿瘤作用研究在TPC-1细胞裸鼠异种移植模型(图10)。很明显,骆驼蓬碱延迟甲状腺癌的生长方式存在剂量依赖的相关性。然而,尽管肿瘤的老鼠接受的最低剂量的骆驼蓬碱增长更慢比老鼠在对照组,两组之间没有显著差异。相反,其他两个相对高剂量的骆驼蓬碱显著抑制肿瘤的生长与对照组相比。在所有三个组,最高剂量的骆驼蓬碱生成最大的抗肿瘤效应。此外,40毫克/公斤骆驼蓬碱抑制肿瘤生长明显超过20毫克/公斤骆驼蓬碱。此外,没有明显的毒性(如减肥或行为)在所有的老鼠在整个实验。

4所示。讨论

这里我们展示骆驼蓬碱的细胞毒性和抗增殖作用在体外和体内的甲状腺癌模型。在以前的研究报道,骆驼蓬碱对多种癌症显示细胞毒性和抗增殖作用(11,16]。等细胞内目标已确定细胞周期蛋白蛋白质和干扰DNA (17]。但是,没有报告是甲状腺癌的骆驼蓬碱的抗肿瘤作用。

在当前的研究中,我们演示了一个时间和剂量依赖性的细胞毒性对甲状腺癌细胞系TPC-1骆驼蓬碱。XTT和单独使用试验表明,骆驼蓬碱的抗增殖作用主要是依靠骆驼蓬碱的浓度和培养时间。几项研究已经报道骆驼蓬碱的剂量依赖性细胞毒性与其他类型的癌症。例如,张等人报道的时间和剂量依赖性抗增殖效果骆驼蓬碱对两种类型的胃癌细胞(11]。最近的一项研究从中国南方也证明了骆驼蓬碱衍生物的抑制作用在胃癌细胞的增殖7]。

虽然大部分的研究集中于骆驼蓬碱的抗增殖作用,一些研究者评估了骆驼蓬碱对肿瘤细胞的集落形成能力以及机体的效果。正如前面介绍的,失去生殖完整性和不能无限增殖是细胞死亡的关键特性(14,18]。细胞完整性,但无法分裂,产生大量的殖民地被认为是死(19]。因此,细胞的完整性和增殖的能力被称为“单独”,这是关键的癌细胞的增殖和视为恶性肿瘤(癌症的标志20.]。在这里,我们表明,骆驼蓬碱产生了单独使用时间和剂量依赖性抑制TPC-1细胞的能力,这意味着骆驼蓬碱能有效地破坏生殖完整性,导致甲状腺癌细胞扩散的能力。此外,当前的研究首次报道,骆驼蓬碱显示可能成为一个有前途的辐射敏化剂。

以下癌细胞DAPI染色显示,骆驼蓬碱是TPC-1细胞的有效诱导细胞凋亡。众所周知,细胞凋亡,也称为程序性细胞死亡,特点是特定的形态,如染色质缩合、膜起泡,internucleosome退化的DNA,凋亡的身体形成(21]。很明显,细胞治疗骆驼蓬碱进行了一些特征的细胞凋亡现象。据报道在早期研究bcl - 2家族,包括proapoptotic蛋白质和抗凋亡蛋白,在细胞凋亡中起着重要作用[22,23]。在所有这些蛋白质,bcl - 2、Bax的比例是细胞凋亡的关键指标(24]。图4表明,骆驼蓬碱的治疗剂量依赖性降低bcl - 2的表达,同时伯灵顿的表达增加,导致一个明显的下降bcl - 2、Bax的比率。尽管凋亡的影响归纳骆驼蓬碱也报道了其他组织,不同机制骆驼蓬碱的抗肿瘤作用已确定,如细胞周期阻滞和抑制端粒酶活性(9]。骆驼蓬碱的抗癌效果确认在TPC-1异种移植模型,这与其他研究专注于骆驼蓬碱,证明了骆驼蓬碱治疗癌症的功效。

迁移和入侵的能力是恶性肿瘤的特点,这常常会导致癌症治疗的失败(25]。有效抑制肿瘤的迁移和入侵是一种有效的控制肿瘤转移的方式。因为一些研究调查了antimetastatic骆驼蓬碱的影响,我们评估能力的骆驼蓬碱细胞迁移和入侵通过伤口抓和Transwell化验。两个实验的结果证明了骆驼蓬碱体外的剂量依赖性抑制作用。此外,在转移性异种移植动物实验模型在作者的实验室正在进行进一步评价体内antimetastasis骆驼蓬碱的效果。

正如上面提到的,证据从我们的报告不仅展示了潜在的骆驼蓬碱抗肿瘤效应,而且还提供一种可行的方式来抵消甲状腺癌的转移。此外,进一步的研究专注于目前正在对骆驼蓬碱chemosensitization效应在作者的实验室探索更多潜在的应用这类生物碱。然而,这无疑是中药的发展,特别是生物碱,权证更密集的研究,以评估临床应用的可行性和优点。

总之,目前的研究表明骆驼蓬碱的抗肿瘤作用在甲状腺癌的治疗。体外细胞毒性试验表明,骆驼蓬碱具有剂量-时间细胞的抑制和对TPC-1细胞凋亡诱导作用。此外,骆驼蓬碱有效抑制TPC-1细胞的迁移和入侵方式存在剂量依赖的相关性。此外,体内评价表明,骆驼蓬碱显著延迟甲状腺癌的生长在裸体小鼠的剂量依赖性的方式。因此,骆驼蓬碱可能是一个有前途的中药在肿瘤治疗中,还需要进一步的努力来探索这治疗的策略。

相互竞争的利益

作者报道在这项工作没有利益冲突。