淫羊藿苷通过Canonical Wnt信号通路调控骨髓间充质干细胞的双向分化

摘要

在一些绝经后的妇女中很容易观察到骨髓内的脂肪浸润。这些脂肪主要来源于骨髓间充质干细胞(BMMSCs)。骨髓间充质干细胞脂肪细胞的增加导致骨髓间充质干细胞成骨细胞的减少，骨髓间充质干细胞的双向分化显著促进了骨质疏松症的发生。淫羊藿苷是淫羊藿的主要提取物，广泛应用于中药中。本实验通过实时荧光定量PCR、免疫荧光、western blot、体外和体内组织切片等方法研究淫羊藿苷对BMMSCs双向分化的影响。我们通过检测淫羊藿苷的染色和基因表达，发现淫羊藿苷能明显促进骨形成，抑制脂肪形成。Micro-CT分析显示淫羊藿苷治疗减轻了去卵巢小鼠股骨远端松质骨的丢失。H&E染色分析显示淫羊藿苷处理的OVX小鼠比OVX小鼠获得更高的骨量和更少的骨髓脂滴。Western blot和免疫荧光表明淫羊藿苷通过规范的Wnt信号通路调控BMMSCs的双向分化。本研究表明淫淫素通过规范的Wnt信号通路调控BMMSCs的双向分化发挥抗骨质疏松作用。

1.介绍

骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种普遍存在的全身代谢性骨病，其特点是骨丢失与骨形成失衡，导致骨微结构恶化、骨量降低、骨折风险增加。骨髓腔内的脂肪浸润是衰老的标志和骨质疏松症的后果，特别是在更年期妇女[1］.骨髓内脂质形成的一个可能来源是骨髓间充质干细胞的成骨和脂肪形成之间的平衡被破坏，后者占主导地位[2那3.］.BMMSCS是骨头明天最重要的MSCs，是自我可再生的，多能干细胞，具有区分软骨，骨骼和脂肪组织的能力[4.-6.］.成骨细胞形成的促进因子被认为是脂肪细胞成熟的抑制因子，反之亦然[7.-9.］.最近的研究表明，各种化学化合物具有调节干细胞的存活率和分化，例如生物脂醛，维生素E，维生素C和类胡萝卜素[10-15]. 骨髓中脂肪细胞比例的增加导致成骨细胞凋亡和破骨细胞增殖，抑制成骨细胞的功能，从而导致骨质疏松症的进展[16那17］.因此，对BMMSCs的骨发生和脂肪发生的调节似乎是骨质疏松症的潜在治疗策略。

Icariin (ICA, C_33.H₄₀O.₁₅从淫羊藿中分离得到的黄酮类苷类化合物是其生物学效应的主要活性成分。在传统中医(TCM)中，它的滋补、壮阳和抗骨质疏松的功效在亚洲国家(主要是中国、日本和韩国)被认可了数千年。在一项临床研究中，经淫羊藿苷治疗24个月后，绝经后妇女的骨密度(BMD)和骨强度显著改善[18]. 多项研究表明，在骨形成过程中，淫羊藿苷可以改善和增强成骨细胞的成熟和矿化以及骨髓间充质干细胞的成骨分化[19］.在骨吸收过程中，由炎症介质和细胞因子介导的破骨细胞成熟和形成可被淫羊藿苷抑制[19］.一些骨代谢相关的信号分子如Notch、细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun n端激酶(JNK)、缺氧诱导转录因子1α.（HIF1.α.），并且RhoA可以通过icariin调节[20.-24.］.其他研究还报告说，伊加里宁对骨骼系统产生有益影响。icariin可以通过促进内皮细胞迁移，增殖和小管发生来增加血管生成，然后新生儿血管支持骨形成的血液供应[25.］.在旋转器袖带撕裂模型中，icariin组可以刺激胶原蛋白I和胶原蛋白II的表达与对照组在2周和4周时与对照组相比，并且在伊加里宁组中检测到比对照组更高的VEGF阳性细胞[26.］.

在其他生物方法中，icariin被据报道为过氧化物体增殖物激活受体的激动剂α.（PPARα.），与脂质代谢和脂肪酸氧化的调节，这是有利的在防止与II型糖尿病和肥胖症有关[代谢紊乱起关键作用27.］.在另一项研究中，淫羊藿苷可以通过靶向固醇调节元素结合蛋白(SREBPs)并抑制其激活来改善饮食诱导的肥胖和高脂血症，减轻胰岛素抵抗[28.］.此外，淫羊藿苷可抑制Graves眼病模型的脂质积聚[29.］.

Wnt信号传导途径是一种古老而进化的伴随保守的途径，其在胚胎发育期间在细胞迁移，细胞极性，细胞命运测定和器官发生中起着基本作用和组织稳态[30.那31.]. 十年前，四组骨密度不同、骨量高或低的患者被确定与典型WNT信号突变相关。导致骨量和密度完全改变的四个突变中有两个被发现是LRP5，负责Wnt辅受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5。在骨质疏松症假胶质瘤综合征（OPPG）中，该基因的功能缺失突变与骨量降低有关，在一些健康患者中，高骨量与同一基因的功能获得突变有关[32.]. 其他两个突变影响一个共同基因SOST的表达，SOST编码主要由骨细胞分泌的硬化蛋白，该蛋白结合LRP5和相关的LRP4和LRP6受体，在Wnt信号传导中起拮抗作用[33.]. 骨中硬化蛋白表达的缺乏被发现是硬化症和以高骨量为症状的Van-Buchem病的原因[34.]. 有研究表明，BMMSCs的脂肪生成受Wnt信号通路的调控和细胞因子的激活β-连环蛋白导致抑制脂肪生成[35.］.

基于以上证据，我们假设淫羊藿苷在BMMSCs分化过程中可以引导分化向成骨细胞谱系，而远离脂肪细胞谱系。在本研究中，我们旨在检测淫羊藿苷是否在体外和体内调节骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化，并确定Wnt信号通路是否在骨髓间充质干细胞成骨成脂分化中发挥基础性作用。

2.材料和方法

2．1.试剂

icariin是从Cayman（Ann Arbor，Mi，USA）购买的。胎儿牛血清（FBS）购自Gibco Life Technologies（纽约州大岛，美国）。Dulbecco的改良Eagle的培养基（DMEM），青霉素和链霉素购自Hyclone（Hyclone，Waltham，Ma，USA）。Cell Counting Kit-8（CCK-8）购自Dojindo（日本Kumamoto）。大鼠骨髓间充质干细胞的脂肪发生和成骨分化培养基购自Cyagen Biosciences Inc.（Santa Clara，CA 95050，USA）。总RNA提取试剂盒购自欧米茄。Revertra Ace Kit和Sybr Green Master Mix是从Toyobo（日本东京）购买的。DKK-1，规范WNT信号通路抑制剂购自R＆D Systems（Minneapolis，Mn，USA）。在实验中使用的以下抗体购自电池信号技术（Beverly，MA，USA）：磷酸盐-GSK-3β(# 8213)β-catenin(#9562)，非磷酸(活性)β-Catenin(#8814)和GAPDH(#2118)。其他试剂均为最高商业级，购自Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA)

2.2. 骨髓间充质干细胞培养

简而言之，实验中使用的大鼠BMMSCs与来自武汉科技大学同济医学院实验动物中心购买的4周龄雄性Sprague-Dawley大鼠中分离出来，并按照已发表的发布扩展技术[36.］.动物程序与华中科技大学同济医学院动物实验的伦理委员会的规定一致（中国）。将分离的细胞保持在由10％FBS，2mM谷氨酰胺，100u / mL青霉素和100mg / ml链霉素组成的DMEM中，然后在37℃下在95％空气和5％CO的加湿气氛下温育。₂. 当细胞汇合时，用0.5%胰蛋白酶乙二胺四乙酸对细胞进行胰蛋白酶化，并以1的比例传代 : 3.第2-3代骨髓间充质干细胞用于以下实验。在骨髓间充质干细胞分化实验中，按照手术指导，每2天更换一次培养基，在成脂和成骨分化培养基中培养21天。淫羊藿苷（1） μ.M）和DKK-1（50ng / mL）用于检测icariin在骨开发中的功能和BMMSCs的脂肪发生分化。

２.３.CCK-8扩散分析

骨髓间充质干细胞以1×10的密度接种于96孔培养板中^3.细胞/孔。每个小组有五个亚孔。12小时的温育后，将细胞用在淫羊藿苷0.001,0.01，0.1，1和10处理的 μ.M,分别。用CCK-8试剂盒(日本Dojindo)分别培养1天、3天、5天、7天，在培养液中进行细胞增殖。总之,10μ.将CCK-8溶液添加到每个孔中，并在37°C和5%CO的黑暗中培养₂for 1.5 h, and then the absorbance was measured at 450 nm by an ELX800 absorbance microplate reader (BioTek, Vermont, USA).

2.4。总RNA提取和定量实时RT-PCR

总RNA的总RNA提取试剂盒提取，OMEGA。RNA样品的纯度和浓度通过分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司，USA）测定。的ReverTra王牌试剂盒用于第一链cDNA的3合成 μ.克RNA和定量实时PCR用CFX96（Bio-Rad公司，CA，USA）和SYBR Green主混合物中进行。Runx2的，PPAR的相对表达γ.，ALP，I型胶原，adipsin和Fabp4在该系统中定量。引物购自Sangon Biotech（中国上海），其序列如表所示1。反应系统在95℃下使30℃的变性组成，其次为40个循环为94℃，5s和60℃，35秒。使用比较CT进行分析基因特异性产物的相对表达（)方法并标准化为参考基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。每个样品检测一式三份。

2．5．茜素红S染色和油红O染色

在成骨细胞分化，在的BMMSCs 2×10培养^4.细胞/厘米²在由SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化基础培养基(175 mL)、胎牛血清(20 mL)、青霉素/链霉素(2 mL)、谷氨酰胺(2 mL)、抗坏血酸(400μ.l），β-甘油磷酸（2 和地塞米松（20毫升） μ.l）。

在成脂分化过程中，以2 × 10的浓度培养bmscs^4.细胞/厘米²成脂诱导培养基由SD大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化基础培养基A (175 mL)、胎牛血清(20 mL)、胰岛素(400μ.l），谷氨酰胺（2mL），Rosiglitazone（200 μ.l），地塞米松（200 μ.五十） ，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（200 μ.l）和青霉素/链霉素（2mL）3天，随后用SD大鼠BMMSCs adipogensic分化基础B（175mL），胎儿牛血清（20mL），胰岛素（400 μ.五十） ，谷氨酰胺（2 mL）和青霉素/链霉素（2 mL）。当这两个步骤重复五个周期时，细胞准备好进行油红O染色。

icariin（1 μ.M）和DKK-1（50ng / ml）分别每2天接受一次诱导培养基。当细胞准备茜素红S染色和油红O染色时，用PBS洗涤样品两次，并在室温下用4％多聚甲醛固定30分钟。在茜素红S染色中，用1ml茜素红S染色溶液处理固定样品3-5分钟。在油红色O染色中，用1ml油红色O染色溶液处理固定样品30分钟。通过微储水轻轻冲洗两种样品，然后在光学显微镜和图像捕获下进行研究。

2.6。碱性磷酸酶(ALP)染色

骨髓间充质干细胞以2×10培养^5.细胞/厘米²在六孔板上，然后用icariin治疗（1 μ.M) and DKK-1 (50 ng/ml), respectively and jointly, in an osteogenic medium. After 7 days of induction, leukocyte alkaline phosphatase (ALP) kits (Sigma, USA) were used for Al staining. Samples were washed with PBS twice, fixed in 4% paraformaldehyde for 10 min, and stained with a BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit (Beyotime, Shanghai, China) under protection from direct light at 37°C. A light microscope was used for observing and taking photos.

2.7。Western Blot测定

样品通过添加1mm PMSF和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(BOSTER，中国武汉)的蛋白提取试剂RIPA (BOSTER，中国武汉)进行裂解。通过BCA蛋白检测试剂盒(BOSTER，中国武汉)测定样品浓度。在上样前，在所有蛋白样品中加入5倍还原样品加载缓冲液(BOSTER，中国武汉)，并在95°C下变性5分钟。相当于20毫克的蛋白质μ.每种样品的G都被10％SDS-PAGE凝胶分解并转移到PVDF膜（Millipore，Billerica，MA，USA）。膜被封闭并与个体初抗体孵育，然后用与辣根过氧化物酶（武汉呼吸道缀合的二抗孵育并培养并温育，并孵育，武汉;稀释：1：5000）。通过增强的化学发光（Boster，Wuhan，China）检测免疫反应蛋白，通过ChemIdoc TM XRS +系统捕获蛋白质的蛋白质（Bio-rad，Ca，USA）。

2.8。免疫荧光

骨髓间充质干细胞接种于无菌培养基1上 24孔板中直径为cm的圆盘，密度为2×10^4.细胞/光盘4天。用PBS洗涤样品并在室温下在4％多聚甲醛中固定15分钟。用PBS洗涤细胞三次，并用含有5％BSA的PBS封闭1小时。在用BSA封闭后，将样品与一抗抗体一起温育β-catenin (1 : 200) (CST, MA, USA) overnight at 4°C. On the following day, samples were washed with PBS three times and incubated with the goat anti-rabbit Cy3-labeled secondary antibody (1 : 500) (BOSTER, Wuhan, China) which was diluted in a blocking solution for 1 h at room temperature. Samples were further counterstained with DAPI (1 : 500) (BOSTER, Wuhan, China) and phalloidin (1 : 100) (Beyotime, Shanghai, China). Inverted fluorescent microscope (Eclipse Ti, Nikon, Tokyo, Japan) was used to capture fluorescent images.

2.9。卵巢切除的小鼠模型

三个月大的雌性C57/BL6小鼠(  g) were purchased from the Experimental Animal Center of Tongji Medical College (Wuhan, China) and were randomly divided into three groups ( 每组小鼠）：假手术小鼠（sham）、用载体（OVX）处理的去卵巢（OVX）小鼠和用淫羊藿苷（OVX+ICA）处理的OVX小鼠。所有动物实验方法均符合华中科技大学同济医学院动物实验伦理委员会（中国武汉）。通过背侧入路切除双侧卵巢完成卵巢切除模型，通过检测双侧卵巢完成假手术。术后第二天，给小鼠口服淫羊藿苷（25 mg/kg）或每日一次。干预6周后，用过量的戊巴比妥对三组动物实施安乐死，并收集股骨。

2.9.1。组织学分析

股骨标本在10%四钠edta水溶液中4℃脱钙1周。从每个股骨标本中制备石蜡包埋切片(5mm)进行苏木精和伊红(H&E)染色。镜下观察干骺端下方的松质骨和脂滴。测量并比较h&e染色切片中感兴趣的骨小梁骨密度和脂滴面积。

2.9.2。Microcomputed断层扫描（μ.-CT扫描与分析

三组的骨骼样本通过Scanco VivaCT 40仪器(Scanco, Brüttisellen，瑞士)进行扫描。骨骼样本在100千伏和98千伏的环境下进行扫描μ.连续断层图像的厚度为10.5 μ.M随后，如前所述，对获得的骨结构结果进行分析[37.］.对骨小梁的常数阈值是220，用于从骨髓分割骨。从10片被选定的骨小梁的兴趣（ROI）的区域（105 μ.m）来自远端股骨的结性，长度范围为150片（1575 μ.m）。四个形态学参数，即骨体积/组织体积（BV / TV），小梁数（TB.N），小梁厚度（TB.TH）和小梁分离（TB.SP），使用兼容的软件定量测量这μ.-CT系统。3D的命名和缩写-μ.CT参数与骨矿研究的美国社会[建议一致38.］.

2.9.3。统计分析

定量数据表达为三个独立实验的平均值±SD。学生们t- 选择评估两组之间差异的重要性。单向ANOVA（SPSS，V.19.0;芝加哥，IL，USA）被选中，用于评估三个或更多群体之间差异的重要性。差异在统计上表示统计学意义 。

3.结果

3.1。淫羊藿苷对OVX小鼠骨质流失的影响

微机层析成像(μ.-CT）是用来分析的骨小梁在经由来自小鼠的不同组的不同观察角度股骨远端（图1（a））.与假手术组比较，OVX组股骨远端骨小梁数据显示BV/TV、Tb。N,结核病。Th显著降低;相反，肺结核。Sp显著增加(图1（b）). 在一组用淫羊藿苷（OVX+ICA）治疗的OVX小鼠中，测量参数显示淫羊藿苷的干预显著减轻了卵巢切除引起的骨丢失。这些结果与组织切片结果一致（图1）2(一个)）.OVX小鼠标本切片显示松质骨缺乏(图)2(一个)）.淫羊藿苷治疗OVX小鼠导致骨密度增加。在不同组的股骨远端选择性区域，与假手术对照组相比，OVX小鼠的脂肪细胞(N.Adi/Ma.Ar)数量明显增加，而淫羊子苷处理显著降低了脂肪细胞的形成(图)2（b））.

3.2. 淫羊藿苷刺激骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化，抑制脂肪分化

通过CCK-8套件，我们发现在0.001和0.01的浓度下观察到细胞数的差异 μ.M.其他浓度淫羊藿苷对BMMSCs均有增殖作用，但其增殖作用开始于不同时间点。1的浓度μ.淫羊藿苷的增殖作用最强，且开始增殖的时间较早(图)3（a））.1μ.在后续实验中筛选出淫羊藿苷。淫羊藿苷干预可上调相关成骨基因runx2、ALP、Collagen i的相对表达，下调相关成脂基因ppar的相对表达γ.，Fabp4和己二酸蛋白酶（图3（c））.这些选择基因- runx2, ALP, Collagen I, PPARγ.在以前的研究中已经证明，Fabp4和adipsin具有调节骨髓间充质干细胞分化的功能[5.］.在成骨形态学观察中，淫羊藿苷处理培养液中茜素红S染色结节形成数量和ALP表达量均高于对照组。在脂肪形成方面，与对照组相比，淫羊藿苷处理的培养基中脂滴的形成减少(图)3（b））.

３．３．淫羊藿苷干预的典型Wnt信号通路参与BMMSCs分化

Wnt信号通路是决定细胞命运和器官发生的重要途径。因此，我们检测淫羊藿苷处理的BMMSCs是否能够激活典型的Wnt信号通路。1μ.M淫羊藿苷在不同时间点的作用。Western blot显示淫羊藿苷的干预可促进GSK-3的磷酸化β增加了非磷(活性)β连环蛋白。GSK-3磷酸化峰值水平β在4点出现 Hβ-连环蛋白激活发生在1 h，并在2时达到最大值 h（图4（a）). 骨髓间充质干细胞经淫羊藿苷治疗8周后 h、 免疫荧光显示淫羊藿苷促进细胞的转运β-连环蛋白进入细胞核等等β-连环蛋白出现在细胞核而不是细胞质与对照(图4 (c)）.

3.4. 淫羊藿苷治疗过程中典型Wnt信号通路在成骨和成脂分化中的作用

DKK-1，WNT信号通路的特异性抑制剂，可以下调GSK-3的磷酸化β并促进退化β-连环蛋白的量β- 在免疫荧光中减少到核中的-Catenin（图4（b）和4 (c)）.DKK-1下调相关成骨基因的相对表达，上调相关成脂基因的相对表达(图)5 (b)）.在成骨诱导期间，通过治疗DKK-1，茜素红S染色结节和ALP表达的数量显着降低;另一方面，DKK-1在脂肪发生诱导中的治疗具有促进脂液滴形成的功能（图5(一个)）.当用赤素蛋白和DKK-1的组合处理细胞时，GSK-3的下调磷酸化β通过治疗DKK-1，仅衰减和表达β-catenin显示上调（图4（b））.检测免疫荧光，核进口β-catenin显示联合干预增加(图4 (c)). 在联合干预组中，与对照组和DDK-1干预组相比，相关脂肪生成基因的相对表达表现出显著差异。然而，与对照组和DKK-1干预组相比，并非所有相关成骨基因的相对表达都显示出显著差异。I型胶原与对照组和DDK-1干预组相比显示出差异，但ALP和Runx2仅与DKK-1组相比显示出差异（图5 (b)）.在诱导培养过程中，淫羊藿苷和DKK-1联合干预减少了脂滴的形成，提高了茜素红S染色结节的形成和ALP活性(图)5(一个)）.

4。讨论

骨质疏松症已经成为医疗保健、个人和社会成本的主要负担，影响着全世界大量人口。骨髓在维持骨内环境稳定方面起着重要作用[39.］.骨髓中不同的细胞可以通过局部产生的可溶性因子、细胞外基质成分和全身因子建立功能关系，这种关系形成了独特的微环境[40那41.］.

正常情况下，骨髓内脂肪细胞主要来源于BMMSCs的成脂分化，而其他研究表明，在骨质疏松等骨骼疾病的一些病理过程中，BMMSCs来源的成骨细胞和软骨细胞具有转分化为脂肪细胞的能力[42.那43.］.在骨髓中增加的脂肪细胞形成了与增加的骨折风险和降低的骨密度，并且这种效应被认为是即使在骨质疏松症的更可发音[44.-46.]. 对BMMSC分化的进一步研究表明PPAR的上调γ.正刺激脂肪细胞分化，同时作为主要负刺激成骨分化[47.那48.］.rosiglitazone施用（PPARγ.在小鼠中的激动剂显示骨质损失和减少的骨形成，脂肪细胞累积增加[49.那50］.相反，在杂合子缺陷动物中，PPARγ.缺陷小鼠模型显示骨密度和成骨细胞生成增加[51］.此外,Runx2^−/−颅骨细胞自发显示脂肪细胞分化，这表明骨髓间充质干细胞中Runx2的表达可能抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的分化[52］.

在骨髓中，有两种干细胞——血液干细胞和非造血干细胞，而间充质干细胞则属于后者。骨髓间充质干细胞由血液干细胞分化成成骨细胞和破骨细胞。成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收参与了一个不断的骨重建过程，决定了骨量和骨质量。最初，关于骨质疏松发生的细胞研究主要集中在破骨细胞活动及其骨吸收过程，或者仅仅是BMMSCs的成骨细胞分化，淫羊藿苷在上述方面的作用已被证实[53-56］.BMMSCS自己在骨髓内进行成骨分化和脂肪分子分化和脂肪组织的能力已经证明与骨稳态有关系。当12周龄小鼠接受卵巢切除术时，远端股骨的图像呈急剧减少的松质骨，这与先前的研究一致[57那58］.此外，我们关注的是脂肪组织在骨髓中的积累，因此我们发现切除卵巢的小鼠骨髓中有脂肪细胞浸润，这与临床研究一致[59那60］.淫羊藿苷治疗OVX小鼠不仅能减轻骨丢失，还能减轻脂肪细胞聚集。显微ct和组织切片的详细定量参数也显示了一致的结果。

在体外研究中，我们首先探讨了ICARIIN的适当浓度，以介入其对BMMSCs增殖和分化的影响。在以前的研究中，icariin的浓度为0.1 μ.M可促进bmmsc的增殖[61］.实验证明淫羊藿苷的浓度小于1μ.M在促进骨髓间充质干细胞增殖和调节分化方面效果最佳。在我们目前的研究中，1 μ.淫羊藿苷的干预可在形态上调控bmmsc向成骨细胞分化，远离脂肪细胞分化。在基因水平上，淫羊藿苷在不同水平上上调成骨相关基因，下调成脂相关基因。Hasan等报道dismin可通过激活Wnt信号通路减轻肝星状细胞纤维化[62］.实验证明橙皮苷具有诱发作用β- 高血糖条件下牙周韧带干细胞的依赖依赖性骨细胞分化[63］.另一项研究也报道了Wnt通路对于柚皮苷平衡氧化应激对脂肪源间充质干细胞成骨的负面影响至关重要[64］.Diosmin、橙皮苷、柚皮苷和淫羊藿苷是生物类黄酮的组成部分，因此我们检测淫羊藿苷对Wnt通路的影响。在接下来的研究中，淫羊藿苷可以上调GSK-3的磷酸化β在n端Ser9位点。磷酸化GSK-3的活性β是处于抑制状态，胞内解聚复合物不能与β-细胞质中的连环蛋白[65]. 因此，蛋白质的非磷酸化状态β-catenin上调且未磷酸化β-catenin进入核心。然后我们利用DKK-1，一种抑制性分泌糖蛋白用于WNT信号通路，研究ICARIIN是否通过WNT /通过WNT /来调节BMMSC的双向分化。β连环蛋白信号通路。我们意识到，与对照组相比，DKK-1明显阻断了上调的ALP表达，减少了细胞外钙化结节的沉积。经DKK-1处理后，成骨相关基因表达减少。在成脂分化方面，DKK-1显著增加脂滴的积累和成脂相关基因的表达。与预期一致，淫羊子素在形态和基因水平上中和了DKK-1对BMMSCs双向分化的影响。GSK-3的磷酸化减少β和非磷酸化的表达βDKK-1诱导的-catenin被淫羊藿苷平衡，且相对较少β-锚定在细胞膜上的连环蛋白等β联蛋白转移到核中。

总之，本研究证明了icariin调节BMMSCs的双向分化的能力;通过使用DDK-1，WNT信号传导途径抑制剂，我们证实了icariin的这种调节作用是通过规范Wnt信号通路实现的。

利益冲突

作者声明在发表本文时没有利益冲突。

致谢

本研究是由中国国家自然科学基金（编号81371915）的支持。

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