文摘

没有观察到天然多酚具有抗增殖特性。的影响,包括凋亡潜在生物活性的酚类化合物,咖啡酸(CA)和它的导数咖啡酸苯乙基酯(角),细胞增殖和细胞凋亡在人类头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)线(562年底特律)进行调查和比较。肿瘤细胞凋亡率和细胞周期逮捕被流式细胞术分析。CA和角被发现导致剂量依赖性降低各级底特律562个细胞的可行性。CA /角治疗并显著影响底特律562个细胞的生存能力(MTT结果)。CAPE-mediated丧失生存能力发生在低剂量更明显,与抑制细胞的生长的浓度50%估计为201.43μM (CA)和83.25μ米(角)。死细胞测定膜联蛋白V标签显示CA底特律和角治疗562个细胞的诱导细胞凋亡导致50μ米和100μM剂量。主要观察晚期凋亡的崛起为100μM剂量和CA /角治疗影响G0 / G1期细胞的分布。结合不同的酚类化合物,可能与化学疗法,可以被视为一种抗癌药物。

1。介绍

多酚,蜜蜂蜂巢蜂胶产品的主要成分,是众所周知的抑制细胞增殖和诱导细胞死亡在人类癌症细胞1- - - - - -3]。蜂胶的生物活性主要归功于咖啡酸、肉桂酸、苯乙基酯、p-coumaric酸,artepillin C, galangin, cardanol baccarin,白杨素等成分,具有精子属性(2- - - - - -4]。最近的证据表明,茶多酚和黄酮类物质负责诱导的细胞凋亡和细胞周期抑制、抗血管,抑制基质金属蛋白酶,预防转移,增强化疗造成的影响(3- - - - - -7]。这些化合物是通过多种途径针对不同的分子和细胞代谢表现出广泛的在不同的癌症细胞的细胞毒性。更具体地说,蜂胶成分,包括酚酸影响肿瘤细胞通过细胞凋亡、细胞周期阻滞,抑制细胞生长的活性,诱导内质网应激,半胱天冬酶活性也降低线粒体膜电位(8- - - - - -11]。然而,蜂胶成分的精确机制,咖啡酸和咖啡酸苯乙基酯,激活细胞凋亡在人类癌症细胞仍不确定的和不一致的。

有机酚类化合物包括咖啡酸(CA)和它的导数咖啡酸苯乙基酯(角)是已知的高生物活性成分从蜜蜂蜂巢中提取蜂胶(12,13]。最近的研究表明,它们具有细胞毒性,抗增殖(14,15),抗炎、免疫调节16,17,抗氧化17- - - - - -20.),和抗菌特性17,21]。CA,特别是治疗抑制扩散角、生存和入侵人类恶性组织转化的细胞,包括口腔癌细胞(14,15,22- - - - - -25]。我们最近的研究表明,咖啡酸能够减弱口腔癌SCC-25细胞的生存能力和迁移率(26]。我们所知,此前的研究比较有限的增长抑制人体头颈部鳞状细胞癌细胞不同的多酚和类黄酮。根据现有资料,茶儿茶素是唯一的类黄酮用于临床研究口腔癌(27]。

90%以上的口语和头颈部恶性肿瘤分类组织学检查为鳞状细胞癌(SCC) [28,29日]。鳞状细胞癌是最致命的头部和颈部癌症,根据流行病学数据,它属于全世界第六最常见的上皮的恶性肿瘤。低存活率与区域淋巴结转移的患者,可怜的应对目前的治疗药物,局部复发(30.]。虽然在口头和癌症治疗研究发展近几十年来无疑是重要的,治疗结果HNSCC可能不是成功的重要组患者,导致癌症的复发和进展,整体存活率下降。蜂胶和植物植物化学物质成分的生物活性,包括CA和斗篷的化合物,是直接归因于chemopreventive潜力在口腔鳞状细胞癌和一般在人类口腔致癌作用[31日- - - - - -33]。常见的协同和/或添加剂影响组件,可识别的蜂胶,植物和蔬菜/水果,负责chemoprotective行动的“健康有机食品”,可能在口腔和咽癌症预防扮演重要的角色34,35]。

目前的体外研究已经安排调查的细胞毒性效应两种生物活性酚类成分的蜂胶:咖啡酸和咖啡酸苯乙基酯的可行性、细胞凋亡和细胞周期阻滞的头部和颈部(HNSCC)鳞状细胞癌底特律562线。

2。材料和方法

2.1。细胞系的文化条件和试剂

底特律562年人类鳞状细胞癌细胞系来自咽主要位置是用于目前的研究和从欧洲购买的验证细胞培养(英国索尔兹伯里ECACC)。562年底特律HNSCC细胞被播种6-well微型板块,在标准培养基培养(EMEM;鹰的最低必要的媒介)含10%胎牛血清(的边后卫;派斯克、奥地利)和1% penicillin-streptomycin (PAA实验室GmbH,派斯克,奥地利)37°C公司的5%₂在空气中(有限公司₂孵化器、贺利氏仪器,Hanau,德国)。此外,细胞培养与100年μ青霉素g / mL链霉素,100国际单位/毫升,和0.25μ在37°C L /毫升两性霉素B有限公司5%₂的气氛。试剂从PAA实验室购买GmbH(奥地利派斯克);咖啡酸和咖啡酸苯乙基酯买来σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。缪斯™膜联蛋白V和死细胞包被购买的微孔(美国Billerica的)。

2.2。细胞生存能力/扩散试验

562年底特律HNSCC细胞增殖测定(4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、5 diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定。细胞被播种在96孔酶标5×10³细胞/好,留给48 h,使它们附着在培养基。培养基提供了和每一个文化medium-containing CA或浓度从100年到5角μ米了,留给24或48 h。接下来,提供细胞培养基和10μL (MTT的解决方案(5毫克/毫升MTT磷酸盐(PBS))添加了3 h。形成甲瓒晶体溶解在DMSO溶液。

活细胞肝癌和紫色的颜色出现在回应。研究物质CA和角都应用于单层文化562年底特律人的头部和颈部癌症细胞在最后的浓度从5到100μ米,除了控制细胞,应用营养培养基。一百毫升的上层清液被转移到一个96孔板和细胞生存能力是决定使用Elx800标仪(美国Winooski Bio-Tek仪器公司,VT),通过测量光谱吸光度在570海里。一半,季度最大抑制浓度(IC₅₀,集成电路₂₅CA)值和角确定为单层细胞。CA的化学结构,提出了角的数字1(一)和1 (b),分别。

2.3。细胞凋亡检测:使用流式细胞术分析可行性和细胞死亡

底特律562细胞凋亡和坏死细胞,包括凋亡细胞的比例,化验使用多功能缪斯膜联蛋白V和死细胞工具包(美国Billerica的微孔,MA)根据用户的指导和制造商的指示。简单地说,治疗后与CA和斗篷,底特律562年癌症细胞在PBS和trypsin-EDTA收获,洗两次。新鲜medium-containing血清添加到每个所以最终浓度是1×10⁵细胞/毫升。染色协议包括气候变暖缪斯膜联蛋白V和死细胞试剂到室温,增加100人μ每个管L细胞悬浮,增加100人μL缪斯的膜联蛋白V和死细胞试剂管和混合彻底涡流在中速5秒。细胞在PBS resuspended 1%的边后卫,混合着缪斯膜联蛋白V和死细胞试剂。样品在室温下孵化20分钟在黑暗中。凋亡细胞的比例进行了分析通过流式细胞术使用缪斯细胞分析仪(美国微孔,Billerica的)系统,并表示为凋亡细胞的比例和标准偏差酒吧代表SD。作为一个消极的控制我们使用纯介质的边后卫和积极控制血清培养基与紫杉醇浓度100海里之外。

2.4。流式细胞术分析细胞周期底特律562年被捕

底特律562年4细胞被播种盘和孵化中含有10%的边后卫在37°C。治疗后与CA和角细胞样本转移到15毫升锥形管的最小数量的细胞固定在管1×10⁶细胞。样品收集24小时和48 h后轻轻在1500转离心5分钟,洗在PBS。获得颗粒固定在冷冻70%乙醇。底特律562细胞被保存在−20°C为7天,直到细胞周期化验。后乙醇去除细胞悬浮在每5×10 0.25毫升PBS⁵细胞和预热至37°C。细胞颗粒resuspended于200年μL缪斯细胞周期的试剂,孵化30分钟在室温下,受光照和细胞悬液被转移到1.5毫升微型离心机管之前分析缪斯细胞分析仪。细胞周期是由fluorescence-activated化验细胞排序分析使用一个缪斯细胞分析仪(默克密理博,Billerica,妈,美国)的配置532海里绿激光线,三个检测通道,微细管100μL圆孔。

2.5。统计分析

数据提出了意味着±标准差(SD)和分析非参数方法使用Statistica 9.0 v(美国StatSoft,塔尔萨)计算机统计项目。统计差异意味着弗里德曼方差分析方差分析进行评估之后,事后邓恩的测试和Wilcoxon测试。的价值被认为是重要的(),和是非常重要的(和、职责)。三个独立实验的结果表现在一式四份(细胞毒性。实验手段比较的方法治疗细胞收获以类似的方式。集成电路₂₅和集成电路₅₀值计算从相应的抑制浓度曲线绘制数据显示演示基于代表图。

3所示。结果

这项研究旨在比较两个常见的酚类化合物的影响,蜂胶的成分:咖啡酸和咖啡酸苯乙基酯的抑制增殖,鳞状细胞癌的细胞生存和增长,最近的报告已经证实的有益作用propolis-induced细胞压力选择肿瘤细胞(23- - - - - -26]。HNSCC细胞系细胞影响底特律562年调查体外使用MTT测定微量细胞培养系统中使用各种孵化浓度。细胞毒性功效CA和角表示为可行的百分比HNSCC底特律562癌细胞在不同浓度的CA /角对未暴露的细胞。半最大抑制浓度(IC₅₀)被定义为CA /角值浓度抑制的可行性底特律562 HNSCC细胞在文化相比50%未经处理的细胞(控制)。本季度最大抑制浓度(IC₂₅)被定义为CA /角值浓度抑制的可行性底特律562 HNSCC细胞在文化相比25%未经处理的细胞(控制)。IC值从细胞外推viability-CA /角浓度曲线。建立所需的浓度50%的增长造成的影响在底特律抑制562细胞24小时和48小时后,一个日志viability-log剂量曲线绘制。

3.1。高浓度的CA和角减少头部和颈部底特律562细胞株生存能力和线粒体功能

我们的实验显示,调查结果多达25 propolis-derived物质浓度μ具有活性相对较低的细胞毒性对底特律562细胞。如图2底特律,24 h / 48 h后暴露10 562个细胞μM CA /斗篷,对细胞生存能力有所下降,除了CA / 24小时。然而,吸光度值显著增加和细胞毒性显著增加CA /角浓度高于25μ米(,,,这取决于时间和物质)。底特律的整体可行性CA 562个细胞显著减少,角50浓度μ米和100μ米(,),细胞生存能力减少16% (CA 24小时50之间μ米)和60% (48 h 100角μ浓度的25米)。μ米和50μ米的CA和角细胞生存能力降低(图48小时后相类似2)。这些发现被验证所需的剂量增强HNSCC细胞的抑制增长50% (IC₅₀201.43),表现出一个值范围μm - 83.25μM 48 h后的孵化时间。所需的最小CA和角浓度导致细胞生长抑制25%和50%后48 h是31.30μ(集成电路₂₅201.43、CA)μ(集成电路₅₀,CA)和18.84μ(集成电路₂₅、角)和83.25 (IC₅₀角),分别,而集成电路₂₅和集成电路₅₀值24小时的孵化时间更高:93.01μ(集成电路₂₅1061.61、CA)μ(集成电路₅₀,CA)和45.03μ(集成电路₂₅、角)和340.95 (IC₅₀角)。

3.2。暴露在CA /角562年底特律刺激细胞凋亡细胞

探讨CA的凋亡效应和斗篷,底特律562个细胞治疗与物质为24小时和48小时,和凋亡细胞被染色评估与确定CA膜联蛋白V /角治疗结果在底特律562 HNSCC细胞凋亡,我们使用一个缪斯膜联蛋白V和死细胞工具测量24小时和48小时后细胞凋亡的变化。我们观察到,研究物质通过细胞凋亡诱导细胞死亡在562年底特律HNSCC细胞(数字3和4)。比较和类似的结果24小时和48小时。如图4总凋亡底特律562细胞暴露于100年μM角24小时和48小时显著增加(%,%,resp)。相比之下,参与控制(%,)。特别是,底特律562个细胞的区别接触50和100角在早期凋亡细胞的比例是最小的(1.47%,3.49%,1.12%和1.71%,),而两组细胞之间的差异在晚期凋亡细胞的比例更加明显不同浓度和时间圈CA和斗篷。这些数据表明,酚类化合物如CA /角抑制细胞生存能力通过凋亡途径在底特律562个细胞。

100年钙浓度最高μ米,总底特律562个细胞凋亡增加:%(24小时)%(48小时)相比%,%,分别控制。角浓度最高的100μ米,总底特律562个细胞凋亡增加:%(24小时)%(48小时)相比,分别%,%在控制(图4)。CA-induced CAPE-induced总底特律562个细胞的凋亡50浓度μM决心在22%(24小时)和30%(48小时)和16%(24小时)和21%(48小时),分别对CA和角(图4)。结果表明相对细胞凋亡效果(晚,总细胞凋亡)100μ在底特律角562细胞48小时后比100年更高μM CA。底特律562细胞的凋亡谱后24 h (100μM CA治疗似乎是大约相当于100μ接触角。两个时间之间的差异圈,24小时和48小时50浓度μ米和100μ米,后期的百分比和总凋亡细胞,是重要的物质CA和角(),而这两个时间之间的差异圈在早期凋亡细胞的比例微乎其微。一般来说,诱导细胞凋亡在底特律562多角细胞比CA后48小时,相反,CA诱导细胞凋亡在底特律562细胞比24小时后角。最弱的效应细胞治疗中可观察到50μCA的米24小时。

3.3。影响两个CA的浓度和角在562年底特律细胞周期阶段分布:CA /角逮捕HNSCC在G0 / G1期细胞

由于以前的研究证明HNSCC细胞周期的调制蜂胶化合物(14,22),CA和角效应在562年底特律细胞周期状态检查。CA和角的影响细胞周期分布使用流仪量化分析和细胞周期进展检查治疗后50和100μ米的CA和相同浓度的角24小时和48小时。如图5底特律、治疗与CA剂量50 562个细胞μ米和100μ48 h M h导致更高的百分比(%,%)的细胞G0 / G1期比对照组(%,和),相应减少的百分比在S期细胞(%,%,分别地。和)。观察更明显逮捕G0 / G1期为100μ角(%)在细胞治疗48 h与控制(%,)(图5)。这些数据表明,抑制细胞增殖和诱导细胞死亡在562年底特律癌细胞通过CA /角有关主要的感应G0 / G1逮捕考虑48小时的时间圈。底特律的不同的扩散率562个细胞暴露于CA /角与控制,未经处理的细胞由于细胞周期调控的差异部分。

如图5未经处理的细胞和细胞之间,没有显著差异暴露于50/100μM CA 24小时后观察。然而,底特律的百分比562细胞G0 / G1期稍微增加了74% (CA 50μ米),而控制(%,)和S期细胞减少(21/24% CA 50/100μ米和%控制,)。未经处理的细胞的百分比差异在S期和G2 / M期细胞治疗100例μ米48小时也是重要的角%与%,%与%;)。数据表明,CA和角逮捕底特律562个细胞周期后48小时在G0 / G1期的剂量和时间的方式通过影响G0 / G1检查站,这也导致了562年底特律生长抑制癌细胞。这一发现表明antiviability活动相对较低浓度的恶性上皮细胞和角与先前的报道是一致的关于体外鳞状细胞癌的细胞研究。

4所示。讨论

头部和颈部癌症主要发生在喉咽;然而,他们也可以在口腔局部,与腹侧上的主要位置/侧舌网站或在地板上的嘴。考虑复发的风险相对较高(20% - -30%)和低五年存活率(50 - 60%),这些癌症的肿瘤管理必须是有效的和可预测的36,37]。蜂胶及其成分被发现具有细胞毒性效应在不同肿瘤细胞(38),但研究人类底特律562年头部和颈部癌症细胞治疗与CA /角尚未报道。

我们的研究的目的是调查底特律562细胞的细胞反应两个选择蜂胶组件。在这里,我们表明,酚类成分的生物效应相比蜂胶:咖啡酸及其衍生品咖啡酸苯乙基酯在头部和颈部癌症底特律首次562个细胞。一些天然物质在补充医学流行似乎适合作为一个潜在的新代理的辅助治疗某些形式的上皮头颈部恶性肿瘤,以支持临床试验(39]。流仪测定的结果清楚地显示,CA,特别是角HNSCC诱导生长抑制和凋亡存在剂量依赖的相关性,底特律562细胞周期的明显改变。这种方法还发现了只死细胞,CA /角治疗导致分崩离析HNSCC细胞的生活。该研究是第一个,最好的我们的知识,比较CA的细胞毒性作用和角在562年底特律HNSCC细胞系,结论CA和适度抑制扩散角和HNSCC细胞的生存能力的降低。这些结果表明,酚类化合物可能视为特定条件支持的化学治疗剂的头部和颈部(前)恶性肿瘤40]。酚类化合物也可以减轻化疗的效果在癌细胞和序贯治疗咖啡酸和紫杉醇诱导有效的协同效应,抗,和肺癌细胞凋亡的细胞,包括nf -κB通路(41]。

CA /角HNSCC细胞的抑制作用是由于其诱导细胞周期阻滞的能力。这是第一步演示细胞周期摄动的可能性由CA和角细胞系。而G0 / G1被捕引起CA和角治疗后48小时内孵化,轻微的逮捕在S期诱导底特律562个细胞接受CA时24 h。有趣的是,只有100的浓度μ角逮捕了温和的底特律562年代和G2 / M期细胞周期。总的来说,我们的研究结果表明,CA /角抑制头部和颈部癌症细胞增殖诱导G0 / G1期细胞周期阻滞,协议与其他研究包含治疗其他癌症细胞系。G0 / G1期可以允许细胞触发修复机制或凋亡通路。因此,CA和角的影响在562年底特律凋亡诱导HNSCC细胞测定,结果表明,治疗的头颈部癌症细胞与这两个酚酸有效地诱导细胞凋亡。化疗药物,包括蜂胶成分,将抑制某些癌细胞的增长。凋亡、抗增殖和细胞毒性的影响蜂胶成分已报告之前在骨髓白血病细胞(42,43),恶性黑色素瘤细胞系(44- - - - - -46),人类乳腺癌细胞(46- - - - - -48],宫颈癌[49),和结肠癌细胞(46]。最近的一项研究报道,有效抑制乳腺癌干细胞角mda - 231细胞,人类三阴性乳腺癌的模型(50]。此外,CAPE诱导TRAIL-mediated Hep3B癌细胞中细胞死亡(51)和刺激的表达死亡受体5 (DR5)和角/小道通过绑定的小道DR5促进细胞凋亡。据报道,抑制扩散角(14,15,23,24],cox - 2活动[52,53),磷酸肌醇3-kinase-protein激酶B (PI3K-Akt)信号的差别和Skp2-F-box蛋白质家族,负责对这些蛋白质(14在人类口腔癌细胞。角也诱导细胞凋亡和抑制细胞生长,导致细胞周期G1和G2 / M期在不同类型的癌细胞(被捕14]。此外,CAPE-treated人类癌细胞抑制癌细胞运动和迁移14,54]。

特别是,当前的结果表明,角有一个更大的凋亡效应在562年底特律细胞比咖啡酸,这被认为是常见的蜂胶成分。我们的研究结果表明,一定剂量的CA和角(25μ米)代表24小时可能不会影响底特律562年癌症细胞的生存能力和细胞周期。低剂量的生物活性天然物质可以归因于所谓“激效效应”,甚至促进细胞增殖/细胞生存能力,这种现象被认为是一种适应性反应的细胞癌(55]。我们证明了底特律562 HNSCC细胞显示变量对CA和角在不同子任务和细胞毒性的情况下,考虑到培养时间。郭等人认为,选择性地抑制人类口腔癌症细胞角因为正常的人类口腔成纤维细胞和颊粘膜纤维母细胞(BF)细胞抗角治疗,与更高的集成电路₅₀值(14,56,57]。在我们的研究集成电路₅₀CA和角治疗201.43底特律48小时后562个细胞μM和83.25μM,分别与其他研究结果一致。的集成电路₅₀斗篷在人类口腔肿瘤细胞株的抑制增殖的口咽鳞状细胞癌细胞系TW2.6 72.1,齿龈癌颈部转移,舌鳞状细胞癌,口腔鳞状细胞癌,口腔表皮样carcinoma-Meng 1 (OEC-M1)是72.1μ101.0米,μ120.9米,μ129.7米,μ159.2米,μ米,分别14]。

抗癌活性的天然多酚类物质,也存在于许多植物,水果,和蔬菜,已经广泛报道中描述的临床前研究和关于口腔癌,许多酚类化合物进行体外和体内。Ciftci-Yilmaz等人表明一定浓度范围的角减少的可行性ut - scc - 74 -头颈部鳞状细胞癌干细胞(58]。根据最近的研究由Czyżewska et al。22]咖啡酸诱导细胞凋亡在24%的人舌鳞状细胞癌细胞系(CAL-27)、蜂胶乙醇提取茶多酚,多酚类化合物的混合物CAL-27细胞的细胞毒性剂量依赖性的方式。燃灯抑制细胞生存能力和诱导细胞凋亡由caspase-3 upregulation caspase-8, caspase-9人类舌鳞状细胞癌细胞系(22]。槲皮素(黄酮醇,蜂胶成分)抑制口腔鳞状细胞增殖通过mitochondria-mediated逮捕细胞周期G1期细胞凋亡和抑制细胞迁移40]。一个抑制SCC-25 OSCC细胞迁移引起的咖啡酸也证明口腔癌细胞(26]。一些多酚可能扭转epithelial-to-mesenchymal过渡和抑制癌症入侵和人类口腔癌SCC-4细胞系(59]。综上所述,这些研究结果表明咖啡酸和咖啡酸苯乙基酯可以发挥潜在的辅助作用的治疗管理口头和/或头部和颈部癌症。

多酚组成的活动机制诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,清除自由基,调节基因表达,和刺激免疫系统的6- - - - - -10,60,61年]。细胞凋亡在恶性肿瘤治疗中扮演着关键角色。凋亡范围在细胞培养细胞健康/生存能力的一个重要参数,它可以指具体的形态变化。缪斯的细胞凋亡细胞分析仪用于量化使多维细胞评估使用一个简化的方法,不需要复杂的协议。在这项研究中,我们使用了缪斯细胞分析仪使用缪斯膜联蛋白V和死细胞凋亡检测试验。可用性研究的结果(62年]表明,缪斯膜联蛋白V和死细胞试验允许高度精确测定细胞凋亡对悬架和附着细胞系使用多个治疗条件。

咖啡酸、斗篷,和广泛的propolis-originated化合物目前在科研和临床调查作为一种新型抗肿瘤药物,治疗结果的某些类型的恶性肿瘤(63年]。可能的协同效应在蜂胶负责他们潜在的抗癌活性多酚(22]。总之,蜂胶成分的组合可以视为chemopreventive测量在人类鳞状细胞癌起源于口腔或头部和颈部区域。由于高度个人饮食习惯、人口暴露于巨大的变异生物活性的天然物质存在于食物。此外,协同或添加剂的影响成分和天然化合物负责propolis-based产品的促进健康的属性(30.]。更有前景的是,新技术可以提高治疗和chemopreventive propolis-originated成分的潜力,如功能化纳米粒子,提高生物活性天然物质的功效[30.]。研究解释和澄清的机制参与抗癌功效可以给这个区域化疗带来宝贵的数据。

5。结论

局限性的体外研究中,我们总结,目前的证据人类头部和颈部和口腔癌症辅助治疗和/或化学预防使用咖啡酸和/或角为正,但仍不确定。取得了可喜的成果,选择生物活性物质隔绝蜜蜂产品和蜂胶,虽然确切的结论仍然是不连贯的。需要进一步进修,以证据为基础的方法,特别是临床试验,确认临床多酚在口腔癌治疗和预防的有效性。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

拨款支持的研究是科学和高等教育/西里西亚:医科大学的认识- 1 - 206 / N / 5/0和认识- 2 - 005 / N / 6 / K,卡托维兹,波兰。