文摘

Limonium tetragonum是著名的盐土植物抗氧化性能。本研究调查了antimetastasis solvent-partitioned的效果l . tetragonum提取(lte)和孤立的化合物HT1080小鼠黑色素瘤细胞模型专注于基质金属蛋白酶(MMP)活动和TIMP和MAPK通路。Upregulation和基质金属蛋白酶的刺激导致升高的细胞外基质的降解是一些并发症如转移的一部分,肝硬化,和关节炎。lte的anti-MMP能力证实了他们MMP-inhibitory效应,调节MMP与TIMP表达式,和MAPK通路的抑制。在所有测试lte, aq 85%。被发现是最活跃的甲醇和正丁醇层分数后产生两个已知的类黄酮苷,杨梅酮3-galactoside和槲皮素3-o-beta-galactopyranoside。Anti-MMP潜力的化合物被证实通过调节MMP的表达能力抑制MAPK途径激活。这些结果表明,l . tetragonum可能作为一种潜在的生物活性物质来源与有效anti-MMP属性。

1。介绍

传播和发展的恶性肿瘤的细胞通过侵袭性和转移性肿瘤细胞的活动。进化的主要异常从肿瘤组织生长侵袭性肿瘤细胞包括几步生物过程。降解细胞外基质的蛋白水解酶的主要途径之一是调节上述演化[1]。基质金属蛋白酶(MMPs), zinc-containing calcium-dependent肽链内切酶,负责细胞外基质的蛋白水解降解,因此与肿瘤浸润密切相关,血管生成和转移的癌症。在浸润性肿瘤细胞,两种基质金属蛋白酶,MMP-2 MMP-9,主要是调节和入侵和转移性肿瘤扩散的关键角色2,3]。调节MMP的活动是由细胞内抑制剂叫做的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs) TIMP-1和TIMP-2研究强烈的癌症研究。在这种背景下,基质金属蛋白酶和TIMPs之间的平衡被认为是在癌症扩散恶化,经济增长促进对恶性肿瘤治疗的新目标行动。基质金属蛋白酶抑制TIMP活动加上增加也被认为是一个有前途的道路对肿瘤细胞生长(4]。此外,治疗干预肿瘤细胞的转移和发展的目的是要实现由自然特工最近来自药用植物和传统民间医学(5- - - - - -7]。小说的科学世界目睹了发现和发展和潜在的抗癌生物活性物质从自然资源,尤其是陆地和海洋植物(8- - - - - -10]。最近的事态发展在天然产物的研究表明,植物是重要的资源,具有抗癌特性通过MMP / TIMP调控肿瘤细胞。

盐沼和泥泞的韩国海岸包含一个常见食用盐土植物物种,Limonium tetragonum生长在地方,接触到高盐度的水11]。然而,除了已知的抗氧化剂存在丰富的植物中严酷的环境下,当前研究不含任何详细的报告对健康有益的效果l . tetragonum(12]。考虑潜在的盐生植物,作为一个著名的研究趋势的一部分开发的新物质从植物营养的目的,solvent-partitionedl . tetragonum提取测试。l . tetragonum是化验MMP-linked通路的影响在体外使用人工纤维肉瘤细胞模型。孤立的生物活性物质,对基质金属蛋白酶的特点,筛选潜在用途。

2。材料和方法

2.1。植物材料

l . tetragonum是由韩国海洋和海洋大学(Yeongdo、釜山、韩国)。原油提取准备描述由Bae et al。13]。从有机溶剂得到了分数和水层。首先,CH₂Cl₂层含水甲醇分离与正己烷和85%。水层的进一步分离提取和H₂O,导致l . tetragonumsolvent-partitioned分数(lte)的正己烷(2.64 g),水(aq)甲醇85% (1.42 g),提取(1.53 g),和H₂O (26.47 g)。分数是溶解在10% DMSO为了用于实验。进行了进一步的孤立的活性化合物如前所述[14]。

2.2。细胞培养和细胞毒性的决心

HT1080人类纤维肉瘤细胞系是用于在体外化验。细胞生长在烧瓶(t - 75, Nunc Roskilde音乐节、丹麦)在37°C调湿大气的5%股份₂和美联储与杜尔贝科修改鹰介质(美国DMEM Gibco-BRL,马里兰州)含10%胎牛血清的边后卫,2毫米谷氨酰胺,100μg / mL penicillin-streptomycin(美国马里兰州盖瑟斯堡Gibco-BRL,,)。培养基被新的取代每3天,除非另有说明。

细胞生存能力评估、细胞培养在96孔板5×10³细胞密度/好。24小时孵化后,细胞培养基被和新鲜培养基的细胞被洗治疗前样品(5、10、20、50和100μg / mL)。细胞再洗用新鲜培养基24和48 h后的孵化和100年μL MTT的解决方案(1毫克/毫升)介绍了井,紧随其后的是一个4 h孵化。最后,100年μL (DMSO溶液用于每个为了溶解甲瓒晶体测定吸光度值在540 nm使用GENios®标(Tecan奥地利GmbH, Grodig,奥地利)。细胞生存能力定义的吸光度值来表示的MTT转化成甲瓒晶体。细胞的生存能力决定通过比较样品和未经处理的控制,处理井和剂量反应曲线建立了比例。

2.3。明胶Zymography测定MMP的活动

酶活动的MMP-2和MMP-9 HT1080细胞治疗有或没有明胶zymography标本进行检测。Bae的方法等。13]又用小修改。简单地说,佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA、10 ng / mL)被用来增强细胞MMP的表达和细胞条件培养基被用来确定基质金属蛋白酶的活性治疗后与lte或孤立的化合物浓度。substrate-gel电泳后的细胞培养基,凝胶是保存在一个包含10毫米CaCl缓冲溶液₂、Tris-HCl 50毫米和150毫米氯化钠在37°C 48 h为了促进凝胶基质金属蛋白酶的消化。观察MMP消化明确活动区域后隶属Coomassie蓝染色在ca - 400 sm Davinch-Chemi成像仪™(Davinch-K,首尔,韩国)。

2.4。RNA隔离和逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)分析

样品对mRNA的表达基质金属蛋白酶的影响和TIMPs被rt - pcr分析。常见的协议后使用感觉和反义前所述的引物(13]。简单地说,2μ克总RNA治疗或未经处理的细胞转化为单链cDNA使用逆转录系统(WI Promega,麦迪逊,美国),后来放大使用特定引物根据制造商的协议。最终产品是可视化紫外线照射下使用CA - 400 sm Davinch-Chemi成像仪™(Davinch-K,首尔,韩国)和AlphaEase®凝胶图像分析软件(αInnotech,圣莱安德罗、钙、美国)是用于量化。

2.5。免疫印迹分析

免疫印迹按照通用标准程序执行所述[13]。简要地解释,HT1080细胞激动里帕裂解缓冲(美国圣路易斯Sigma-Aldrich Corp .)在4°C 30分钟。细胞溶解产物(35μg)受到使用12% SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离,随后转移到聚偏二氟乙烯膜(Amersham淀粉微球的生物科学,英格兰,英国)。检测的免疫反应性的蛋白质进行了电化学发光工具包(Amersham淀粉微球的生物科学,英格兰,英国)。膜上蛋白质带观察使用ca - 400 sm Davinch-Chemi成像仪™(Davinch-K,首尔,韩国)。

2.6。统计分析

所有绘制数据提出了±SD的意思是三个不同的实验。区别每个组的计算方式由单向方差分析加上邓肯的多个范围测试使用统计软件SAS v9.1 (SAS研究所有限公司、卡里、数控、美国)。任何差异被认为是具有统计学意义 。

3所示。结果与讨论

基质金属蛋白酶是已知的影响和干预与几个特定的转移的重要途径,氧化应激和纤维化15]。因此,成功抑制MMP活动稳步收益高利息的开发有效的药物对metastasis-linked并发症和肿瘤的生长。MMP抑制剂的自然起源现在正在集中研究和海洋生物大量潜在的在这种情况下由于他们独特的和具有挑战性的环境中生存的能力。各种生物,特别是海洋植物,晋升为含有生物活性代谢物其中一些被认为是强有力的MMP抑制剂行动的建议机制(16- - - - - -18]。为了提供有价值的见解,l . tetragonum研究评价其MMP-inhibition效率以及MMP的抑制成分。在这方面,提取的l . tetragonum部分有机溶剂和solvent-partitioned提取物分别进行了测试。作为一个正在进行的研究的一部分,之前报道MMP-inhibitory粗提物的活动l . tetragonum(13]进一步详细提供背后的作用机制和原理的发现,活性组分的表征。

首先,LTE样本测试人类纤维肉瘤细胞株的细胞毒性存在HT1080 48 h在五个不同浓度(5、10、20、50和100μg / mL)(图1(一))。细胞毒性测试显示,这些浓度cytocompatible 50μg / mL,任何观察到抑制MMP-2和MMP-9活动并非由于浓度低于任何细胞毒性影响。

分析了lte的可能活动抑制MMP-2和MMP-9酶PMA刺激。Gelatinolytic MMP-2和MMP-9分泌活性纤维肉瘤细胞系HT1080是评估明胶zymography使用LTE治疗细胞条件培养基后PMA刺激(图1 (b))。引入PMA (10 ng / mL)细胞导致增强激活MMP-2 MMP-9;因此gelatinolytic活动明胶zymography升高。在测试样本中,85%的aq。甲醇LTE MMP-2和MMP-9活动的减少剂量依赖性地贴切地高于其他样本。剩余的lte观察抑制MMP的活动在n-Hex订单,提取,H₂O分数对他们的效率。抑制MMP酶活动表明,积极的样本具有生物活性物质,能抑制MMP-2 MMP-9活动依赖于细胞外基质或独立于其细胞内的分泌途径。然而,随着细胞生存能力分析结果(图1(一)aq), 85%。甲醇和n-Hex分数增加细胞毒性随着浓度的增加。尽管lte的酶活性抑制进行了使用50微克/毫升浓度,任何可能的抑制作用可能是由于少量的细胞毒性物质样本。然而,在低浓度等10和20 ug /毫升lte没有表现出任何细胞毒性,抑制MMP-2和MMP-9活动仍然可以观察到。在这种背景下,进一步进行细胞实验结果正常化对管家基因,以消除任何可能干扰细胞毒性的存在。

MMP-2此外,蛋白质含量和MMP-9测定免疫印迹连同TIMP-1和TIMP-2的水平。TIMPs已知的基质金属蛋白酶抑制剂,也报道提升MMP-2的活动在某些情况下作为监管的一部分19]。免疫印迹结果建议治疗20μg / ml lte能够抑制MMP-2的蛋白质含量和MMP-9(图2(一个))。存在TIMPs意味着抑制MMP的活动被认为是作为细胞反应的一部分细胞外刺激(4]。因此,PMA刺激引起TIMP水平降低和MMP的表达增加。然而,观察肝移植治疗产生混合的结果对于影响TIMP PMA刺激后的水平。预期结果是抑制MMP和增强TIMP表达式以调节细胞外基质降解。结果显示,只有提取和n-Hex LTE能够调节MMP-2, MMP-9 TIMP-1, TIMP-2水平以预期的方式抑制MMP的表达在哪里加上TIMP水平升高。另一方面,蛋白质含量MMP-2和H后MMP-9略高₂LTE O和正丁醇层治疗TIMP-1和TIMP-2水平升高。高浓度的TIMP-2观察,除了增加MMP-2 n-Hex LTE治疗后蛋白质含量。尽管如此,lte被证明影响活动和MMP的表达途径,但建议不同的行动机制。在H的情况下₂lte O和正丁醇层,一个可能的干预提出MMP-2和MMP-9酶的激活蛋白水平升高后基质金属蛋白酶这将解释抑制酶活性,尽管蛋白水平升高。剩余的lte,那里isTIMP-linked机制调节MMP的活动建议。

为了掌握提出干预MMP-related细胞内途径,MAPK-related蛋白质的水平,即p38, p-ERK, p-JNK,同时进行(图2 (b))。最少、PMA刺激导致了ERK表达升高,物,以及p - 38的磷酸化方面提高了细胞活性。报告表明,抑制MMP的差别MAPK通路密切相关,对这些基因的分泌(20.,21]。PMA刺激诱导激活MAPK通路如图2。然而,治疗与lte 20的浓度μg / mL没有任何一致提到的增量的蛋白质表达的变化。在测试样本中,85%能够调节aq。甲醇和正丁醇层MAPK途径除了MMP与TIMP的水平。另外,n-Hex和H₂O LTE无法显示任何显著影响MAPK通路。这些结果暗示lte的建议行动机制。另一方面,85%的lte aq。甲醇和正丁醇层能够提供一个监管效果通过抑制MMP激活MAPK通路显示为降低p-ERK, p-JNK, p - 38的水平。然而,在所有测试MAPK蛋白质磷酸化p38的lte水平被治疗。金等。22)报道,upregulation MMP-2和MMP-9被TGF -诱导β有关p38表达但不是ERK和物信号在人类乳腺上皮细胞。同样,当前数据表明lte MMP-2 MMP-9活动和差别treatment-induced对这些基因的信使rna表达并不与ERK的磷酸化和主要只有p38物。因此,这也暗示可能抑制MMP-2和MMP-9的主要组成部分l . tetragonum对通过TGF -β通路以及酶的抑制。lte能够表达下调MAPK途径和建议具有潜在的化合物可以抑制MMP酶活性。所有的数据都是按照以前的结果(13),声明的建议anti-MMP影响原油l . tetragonum从可能的生物活性物质提取扎根最活跃的分数,aq提取和85%。甲醇。

aq比较提取的能力和85%。甲醇lte抑制MMP活性和细胞内的规定,两个已知化合物杨梅酮3-galactoside (A)和槲皮素3-o-beta-galactopyranoside (B)是通过activity-guided孤立隔离(图3)如前所述14]。这两个化合物是已知的几种抗氧化剂和anti-MMP化合物衍生品以前报道(23,24]。可能这些化合物由于其类黄酮的抗氧化性能骨干被认为会影响他们的抑制对基质金属蛋白酶的影响。不同大小和化学结构的化合物被认为是主要原因的选择性抑制MMP的活动。

为了验证化合物作为lte的有效成分,对MMP的抑制性影响活动进行了明胶zymography试验(图4)。而化合物能够抑制MMP-2活动和影响MMP-9失败,相反结果从复合B复合B治疗后,MMP-9活动降低到63%剂量依赖性的方式而MMP-2活动进一步增加。此外,这两个化合物进行可能影响MMP-2的表达,MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 mrna(图5(一个)(图)和蛋白质5 (b))。结果证实了他们的参与通过TIMP-linked通路调节MMP的活动。与它们对酶活性的影响不同,两种化合物能够降低PMA-stimulated过度MMP-2和MMP-9 non-dose-dependent的方式。A和B的化合物还可以提升TIMP-1和TIMP-2差别PMA-linked对这些基因的信使rna和蛋白质的水平。为了阐明其作用机理,化合物检测影响MAPK通路蛋白的水平在他们preactivation和磷酸化状态。图上所见6、复合B是能够降低ERK的磷酸化和p - 38,化合物显示出类似的结果,但不如复合B显著MAPK通路的干预可能是因此建议复合B的步骤对它施加anti-MMP活动,证实了降低MMP的表达与TIMP水平略有影响。物的参与途径提出有提升作用通过TIMP-2 MMP-2活动的监管。增强MMP-2活动复合B治疗后可以联想到与TIMP-2和物通路的干预。

4所示。结论

总之,l . tetragonum建议包含anti-MMP物质,包括但不限于杨梅酮3-galactoside和槲皮素3-o-beta-galactopyranoside能够抑制MMP活性和抑制MAPK-linked MMP upregulation。详细的分离化合物的作用机理及其效率在活的有机体内尚不清楚。然而,潜在的l . tetragonumanti-MMP化合物的来源为进一步利用营养食品和化妆品领域被研究验证,为详细分析铺平了道路,以促进潜在的类黄酮苷anti-MMP化合物。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是在经济上支持由国家渔业科学研究所(R2017061)和基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部、科学技术(NRF - 2014 r1a1a2059310)。