水提取物的Herba Cistanche.通过改善Cajal间质细胞促进洛帕胺便秘大鼠肠道运动

摘要

中药对功能性便秘有较好的治疗效果。这项工作试图证明水提取物的效果Herba Cistanche.（AEHC）在STC处理中，并通过洛哌含胺诱导的慢速转运便秘（STC）模型来确定可能的机制。进行HPLC用于鉴定和确认AEHC中的生物活性组分。发现AEHC基于增加的粪便量，水分含量和肠道转运率以及血清气体，MTL，SS和CGRP衰减STC响应。C-kit的蛋白质和mRNA水平，Cajal（ICC）的间质细胞的标记也增加。同时，只有SCF的蛋白质水平，C-kit的配体增加。对我们的数据的分析表明，AEHC通过涉及PI3K，SCF和C-套件的信号通路可以显然改善ICC的功能，并增强诸如气体，MTL，SS和CGRP的结肠运动指标。值得注意的是，AEHC似乎对便秘有效，因此需要进一步的实验来阐明所涉及的确切机制。

1.介绍

便秘是一种常见的功能性胃肠疾病和公共卫生问题，以持续排便困难、不频繁或不完全为特征[1］．便秘的流行从世界各地的0.7％达到81％，特别是在老年人中2，3.］．慢传输型便秘(STC)是13-37%的慢性难治性便秘患者中常见的胃肠道主诉[4，5］．流行病学数据表明年轻女性中的STC的发病率高于男性[6］．STC引起顽固性便秘，保守治疗无效，有神经退行性疾病倾向。它不像功能性疾病那么简单，它需要侵入性和侵略性的治疗[7］．

许多目前的化学药物，如渗透性或分泌性泻药和膨松剂，普遍用于治疗便秘[8]，尽管由于费用高和腹部副作用，如疼痛、痉挛和腹胀，其应用受到限制[9］．目前，调节胃肠道是便秘治疗的首要重点。西沙必利最初是作为一种促进剂用于治疗胃病，但后来由于存在心律失常的风险而停用[10］．

Tegaserod是一种选择性5-羟色胺受体拮抗剂，可刺激肠道蠕动和分泌[11，12］．Prucalopride是一种新型的二氢苯并呋喃羧酰胺衍生物和5-HT₄高选择性和特异性的受体激动剂，可增强胃、小肠和结肠的运动，在动力学上工作更快[13- - - - - -15］．lubiprostone作为前列腺素E1衍生物，可以选择性激活CIC₋₂促进胃肠分泌及增加肠道传播作用的通道[16］．

运动性便秘是一个广泛存在的问题，但其病因尚不清楚。然而，有令人信服的证据表明卡哈尔间质细胞(ICC)在便秘发病机制中的作用[17］．ICC位于胃肠道神经末梢和平滑肌细胞之间。ICC通常被认为是胃肠道活动的起搏器细胞和神经肌肉传输介质[18］．研究表明，与正常患者的那些相比，慢速过境便秘患者的CONON中的ICC密度显着降低[19］．因此，ICC数量的减少可能导致慢波活性的缺乏，从而影响慢传输型便秘患者的收缩反应，导致转运延迟。因此，使用药物改善ICC可能是治疗慢传输型便秘的关键。

近年来，各种中草药和中药方剂因改善排便而成为治疗慢性便秘的新疗法而受到关注[20.，21］．Herba Cistanche.是一种传统的中草药，用于治疗慢性肾病、女性不孕症、大量月经过多、阳痿等[22，23］．Herba Cistanche.通过在MES23.5细胞中表达凋亡相关因子和神经营养因子来阻止神经元凋亡[24］．Herba Cistanche.在治疗阳气肾阳虚证方面也显示出药物潜力。最近的一项研究表明Herba Cistanche.增强H9c2心肌细胞线粒体呼吸和谷胱甘肽抗氧化状态[25］．

中医认为便秘与肾有密切关系。肾开于外生殖器和肛门，支配排尿和排便。废物的运输依赖于肾气的促进和肾阴的滋补。肾阳亏虚或生命门火灭，大肠寒塞，废滞。便秘也是由肠干引起的，因为肾精不足不能产生足够的液体[26］．

Herba Cistanche.是一种常见的补益药草，味甜咸，温热。属大肠肾经，能补肾阳，润肠通便。该单味中药及其中药制剂已广泛应用于治疗便秘，疗效显著[27］．

在中国，影响Herba Cistanche.便秘的根源已被记录[28，29，在神农的《中草药》中被称为“干的多肉的茎Cistanche物种”(30.];然而，科学证据表明Herba Cistanche.根治便秘迄今未见，《中国药典》临床有效剂量为20 g / d，且临床疗效不随剂量增加而进一步增加。

自从Herba Cistanche.是如此稀少[31]标准化其通过实验研究的治疗STC的临床剂量不仅可以防止由于剂量不足而导致的治疗失败，而且使患者远离经济损失甚至通过过度使用的药物缺陷。我们希望结果能够为新药物进行科学基础。因此，研究水性是很重要的草Cistanche的本研究旨在探讨肠道促进功能及其对ICC的作用。

2.材料和方法

2．1.水提物的制备Herba Cistanche.

全部Herba Cistanche.均购自南京海昌中药集团有限公司(中国南京)，采自中国新疆地区人工林，按照民族植物学规范进行采集、加工。由南京中医药大学陆涂林教授从形态学上确定了该植物的身份。南京中医药大学健康科学学院，南京，中国。

片Herba Cistanche.，重量为500 g，用电动搅拌机粉碎，用5000 ml蒸馏水提取，然后用循环提取设备(Bilon, China)在100°C下纯化水提取物2小时。提取液经0.22过滤μ.M膜孔（Millipore，Billerica，Ma，Ma，USA），并将从提取物中获得的残余物溶于4000ml水中。回流萃取后，收集提取物并蒸发以获得最终样品产物。使用旋转蒸发器（Eyela，Tokyo，Japan）浓缩至干颗粒（1g / ml）并储存在-20℃下进行后续使用。将固体样品重构在蒸馏水中，得到所需剂量为10,20和40mg / kg体重的实验。

２.２.动物

本研究使用的实验方案由中国苏州苏州中医药医院动物护理和使用委员会(SHTCM-IACUC;批准文号:pnu - 2016 - 0003)。所有雄性大鼠(斯普拉格·道利品系)，平均体重为 g按照国家卫生研究院指南购自上海市实验动物研究中心。动物可自由进食标准饲料(AIN-93 M)和自由饮用自来水，单独饲养在不锈钢丝网笼子中，通风良好 °C, %的相对湿度，每天暴露于12小时自然光和12小时黑暗。

２.３.实验设计

根据以往的研究，洛哌丁胺用于诱导大鼠便秘[32，33］．60只大鼠随机分为5组( A:正常组(NG)， B:模型组(Lop + vehicle治疗组)，C:便秘大鼠低水提物治疗组Herba Cistanche.(Lop + laehc治疗组)，D:便秘大鼠中水提物治疗组Herba Cistanche.(罗布泊+ maehc处理组)Herba Cistanche.(Lop + haehc处理组)。A组给予生理盐水(10 ml/kg);B组给予洛哌丁胺(4mg /kg);C组用洛哌丁胺(4 mg/kg)和低水提物处理Herba Cistanche.(1克/公斤);D组给予洛哌丁胺(4 mg/kg)和黄芪中提液Herba Cistanche.(2 g /公斤);E组给予洛哌丁胺(4 mg/kg)和高水提物Herba Cistanche.(4 g /公斤)。正常组大鼠腹腔注射0.9%氯化钠，其余大鼠腹腔注射0.9%氯化钠洛哌丁胺，每天2次，连续3天诱导便秘。水提物Herba Cistanche.C、D、E组于第4天至第18天悬浮于水中，每日1次口服，A、B组灌胃量一致。

２.４.色谱条件

HPLC分析在岛津液相色谱系统(东京，日本)进行，由LC-20AT泵和双紫外-可见分光光度检测器组成。洗脱液在30°C、330 nm处监测。流动相为甲醇- 0.1%甲酸(80:20,v/v)，流速为1.0 ml/min。对Diamonsil C进行了色谱分离₁₈柱(4.6 mm × 250 mm，粒径5μ.m，北京迪克玛科技有限公司，北京，中国)。

2．5．分析运动，食物摄入量，水摄入量，体重和头发

在整个实验期间，每天观察和记录运动、摄食量、饮水量、体重和毛发的变化。我们观察“运动变化”的具体步骤如下:采用自制的高60厘米、长50厘米、宽80厘米、外壁为黑色的盒子进行露天试验;在黑暗安静的房间里，白色的地面被黑线分割成12厘米× 12厘米的菱形;一个100w的灯泡悬挂在盒子中心上方1米处;分别于造模第4、6、12、18天将大鼠置于盒子中央。以大鼠5分钟内通过的方格数为水平移动得分，以大鼠5分钟内直立时间为垂直移动得分。水平运动和垂直运动得分之和表示大鼠的运动量。每只老鼠测量一次[34，35］．

2.6。粪便参数测量

在口服给药的最后一天，在6小时期间，将来自每个SD大鼠的新鲜粪便颗粒收集到圆底塞管管中，并记录每组的总重量。为了确定粪便水分含量，我们使用电平衡来干燥粪便粒料，直到达到恒定重量并测量干重。通过以下等式计算水分含量：

2.7。肠转运率分析

根据先前报道的协议进行肠道传输比[36];简单地说，治疗14天后，所有SD大鼠均禁食12小时，但允许自由饮水。每只动物以25ml /kg的体积口服耕胶(20%木炭和10%耕胶的水悬浮液)。30 min后，采用颈脱位法人道处死并解剖。从幽门至盲肠穿越小肠，测量炭粉覆盖小肠的距离和小肠总长度。对于单个大鼠，肠运输的百分比计算为炭粉移动的距离相对于小肠总长度的百分比。由公式计算肠转运率(%):炭的移动距离/幽门至盲肠的距离× 100%。

2.8。血液样本及组织采集

在实验期结束时，大鼠进行12小时禁食，但允许自由进入水。然后通过腹膜内注射戊巴比妥钠（50mg / kg）并置于温度调节的表上，以后麻醉了30分钟。收集血液样品并以3500rpm离心15分钟以获得血清。立即分裂结肠，并在4℃下用正常盐水冲洗，然后分为两件。将一个片段固定在10％福尔马林中，并在分裂的石蜡中加工用于随后的免疫组织化学（IHC）分析，而另一个将其它储存在-80℃直至它们进行测定。

2.9。GAS、MTL、SS和CGRP的评估

采用市售试剂盒ELISA测定血清中胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)、生长抑素(SS)和降钙素基因相关肽(CGRP)的浓度。

2.10。组织学分析

取SD大鼠横结肠，10%福尔马林固定12 h，石蜡包埋，切片5μ.m厚切片，用苏木精和伊红染色(H&E, Sigma-Aldrich, MO, USA)。在光镜下观察这些切片的形态特征，然后使用Leica Application Suite (Leica Microsystems, Switzerland)测量绒毛长度、隐窝厚度和肌肉厚度。

2.11。免疫组织化学分析

我们遵循Zhu et al.(2016)的方法[36]; 未染色5 μ.石蜡切片用于免疫组化分析。切片用兔anti-c-kit(1:10 0)在4℃下染色过夜。采用二抗和亲和素-生物素过氧化物酶复合物法。免疫球蛋白阴性对照用来消除非特异性结合。半定量法检测c-kit的表达水平。然后使用Carl Zeiss成像系统检查组织切片，并使用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics, Silver Springs, MD)定量染色强度。

2.12。实时聚合酶链反应

结肠中c-kit、SCF和PI3K mrna的基因表达水平使用总RNA提取试剂盒(天根生物技术，北京，中国)，根据制造商的协议进行检测。采用ABI StepOnePlus Real-time PCR System (ABI)进行实时PCR。采用SYBR Green I Real-Time PCR Master Mix (QPK201, Toyobo, Japan)检测PCR产物。反应进行了三次重复。取新鲜大鼠结肠组织0.5 g，液氮匀浆。总RNA (1μ.l)根据生产商说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)提取。使用逆转录- pcr试剂盒(Takara Biotechnology Co.， Inc.)按照制造商的方案合成cDNA的第一链。所有目标参数如表所示1．循环方案在下列条件下：95℃，5分钟（DNA变性），其次为40℃，60℃，60℃，20s，72℃，40℃。在扩增循环结束时进行熔融曲线分析。

2.13。免疫印迹分析

Western blot检测结肠标本匀浆中c-kit和SCF蛋白含量。简而言之，用二茚二酮酸法(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)测定均质液的总蛋白。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)在BioRad电泳系统(BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)中分离蛋白质。然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下用含5%脱脂牛奶的TBS处理2小时后，PVDF膜与1:10 00稀释的anti-c-kit (Santa Cruz, CA, USA)、1:50 00稀释的anti- scf (Sigma, MO, USA)和1:8 00稀释的anti- scf一起孵育过夜β-actin(康宸，上海，中国)抗体。使用相应的酶标二抗(Beyotime, Jiangsu, China)检测一抗的结合情况。化学发光检测采用增强化学发光试剂盒(Pierce Biotechnology Inc.， Rockford, IL, USA)和奥德赛红外成像系统(Odyssey Infrared Imaging System, Gene Company Ltd.， Hong Kong)。管家蛋白β-Actin被用作加载控制。相对于水平呈现蛋白质表达量β-Actin。

2.14。统计分析

将测量数据报告为平均值（SEM）的平均值±标准误差，并由SPSS 16.0软件（SPSS，Chicago，IL，USA）分析。单向分析差异（ANOVA），后跟Duncan多个范围测试用于确定所有参数的显着差异。价值观被认为是统计学意义的 ．

3.结果

3．1.组成和功能组成Herba Cistanche.

如图所示1根源，根源Herba Cistanche.含有高浓度的与通便作用有关的生物活性成分。总紫荆芥苷和总毛蕊花苷的浓度分别为0.64 mg/g和0.16 mg/g。采用高效液相色谱法(HPLC)，在适当的保留时间内检测到松果苷和毛蕊花苷含量高的两个峰。

3.2。一般观察

SP大鼠在整个实验过程中均未死亡，说明该动物模型具有较好的安全性和可操作性。与A组比较，模型组大鼠造模后第3天皮毛蓬松、乏力、大便干燥、活动量减少，且随着造模时间的延长症状加重。药物治疗组症状有所缓解，各试验组体重差异无统计学意义，但E组体重略低于其他各组(图)2(一个)）.此外，具有便秘的SD大鼠比A组显着降低食物（ )， B、C、D、E组之间的差异(图2 (b))均不显著。A组和b组之间的用水量也没有变化。此外，C组、D组和E组的用水量没有显著增加(图)2 (c)）.因此，这些结果表明，用AEHC治疗不会引起任何体重、食物摄入量或饮水量的变化。

３．３．AEHC对洛哌胺便秘大鼠大便数及水分含量的影响

与正常粪便相比，治疗前B、C、D、E组粪便干燥、细小、坚硬，无光泽。大鼠注射洛哌丁胺( )，但经AEHC治疗后增加( ） （数字3(一个)和3 (b)）.

3.4。AEHC对洛哌含胺诱导的便秘大鼠小肠道途率的影响

从图中可以看出4，五组间基线小肠转运时间无差异。B组木炭粉推进率明显低于a组( ）.虽然C、D、E组的肠道转运率也显著高于B组( ），C，D和E组比A组显着降低。

3.5。用Aehc的干预部分增强了结肠运动指标功能

B组大鼠血清GAS和MTL水平较A组大鼠明显降低( 、职责)。另一方面，C组、D组和E组( 有效地提高了GAS和MTL的管理水平Herba Cistanche.B组大鼠SS值高于A组( ）;C组、D组和E组的SS水平降低( )(图5）.与便秘大鼠相比，群体中的CGRP水平正常大鼠（ ),在Herba Cistanche.C、D和E组均保持不变( ）.

3.6。结肠的组织学改变

为了研究AEHC治疗是否可以诱导结肠组织的结构改变，在H＆E染色后五组的大鼠的横向上测量绒毛长度，穴位厚度和肌厚度。通过比较每组大鼠的结肠病的病理，结肠粘膜光滑，含有小动脉和粘膜下的小静脉和大量的脂肪细胞。此外，肌肉层由平滑肌细胞组成，周式完成。绒毛的平均长度在B组比A组（ ）.而C组的绒毛平均长度较B组增加了30%以上(图)6和7） ( ）.同时，D组和E组的绒毛平均长度较B组显著增加(图)6(一)和6 (b)） ( ）.肌肉厚度的变化与绒毛长度的变化相似。B组肌肉厚度明显较a组薄，但C、D、E组肌肉厚度较B组增加30-35%(图)6和7）.综上所述，AEHC可增加便秘大鼠结肠的绒毛长度和肌肉厚度。

3.7。AHEC处理增加c-Kit和SCF蛋白表达

结肠中检测c-kit的免疫反应性，各组细胞均为c-kit阳性。如图所示8， B组c-kit表达水平低于A组( ）.C组C-kit的表达水平高于B组（ )，而c-kit在D组和E组比B组存在更多( ）.经不同浓度的水提液处理后Herba Cistanche.2周后，Western blot检测c-kit和SCF蛋白表达水平。Western blot分析显示，洛哌丁胺处理后大鼠结肠c-kit和SCF表达水平显著降低(图)9）.数字8 (e)结果显示，500只便秘大鼠c-kit下降显著增加31.2%μ.g / ml AEHC ( ）.另外，治疗用100和200μ.g/ml AEHC提高c-kit蛋白表达水平。在100、200和500处理下，SCF蛋白表达显著增加20.1、24.7和8.4%μ.g/ml AEHC(图9）.

3.8。AEHC对c-Kit、SCF、PI3K mRNA表达的影响

为了研究AEHC治疗是否可以影响与肌肉收缩相关的mRNA的调节，使用特异性引物在便秘大鼠的冒号中观察到C-kit，SCF和PI3K表达水平的改变。结果表明，与A组相比，B组中C-kit的mRNA水平显着降低（ )， C、D、E组的mRNA水平均高于B组( )(图10）.我们还检查了C-kit的SCF的mRNA表达。B组大鼠SCF的mRNA表达明显低于A组，而用AEHC治疗C，D和E增加SCF mRNA表达（图10）.此外，我们还检测了AEHC对PI3K基因表达的影响。第14天，C、D、E组PI3K基因表达水平显著高于B组( ）.

4。讨论

便秘是一种非常常见的疾病，其特征是排便不良。它大大降低了人们的生活质量，给患者和国家医疗保险带来了巨大的经济负担[32］．天然产品和药用食品现在越来越受到关注，因为它们有潜力成为治疗便秘的新药[37，38］．因此，我们研究了AEHC对洛哌胺诱导的便秘大鼠的治疗作用。

洛哌丁胺、阿托品-地苯诺酯和吗啡被广泛用于诱导实验动物便秘。在三种药物中，洛哌丁胺由于抑制了水的分泌和肠壁的顺畅运动，导致排便时间延长和肠腔通过时间延迟[39］．

本研究中对体重的分析未发现各组之间有任何差异。实验结束后，也没有发现任何差异。AEHC低剂量组体重仍最低，模型组和正常组体重最高。便秘通常是一种功能性疾病。本实验诱导的慢传输型便秘不影响大鼠在实验期间的营养摄取和体重。造模前各组大鼠粪便量及水分含量无差异;造模后均显著降低，不同剂量AEHC后粪便含水量均显著升高。对大鼠结肠碳粉推进剂速率进行研究后发现，模型组大鼠结肠碳粉推进剂速率明显降低，AEHC低、中、高剂量组均保持正常。结果表明，不同剂量的洛哌胺对慢性传输性便秘有一定疗效Herba Cistanche.能不同程度地恢复结肠的推进功能。

胃肠激素是胃肠粘膜和胰腺内分泌细胞分泌的高性能生物活性物质，具有兴奋和抑制双重作用，调节胃肠运动功能[40，41]，其中天然气，MTL和SS具有重大影响。前两种激素刺激消化汁的分泌，约束胃肠道平滑肌，促进胃肠内容物的运动，并激发胃肠蠕动。相反，SS抑制了消化果汁的分泌，胃肠道平滑肌的收缩，以及胃肠排放的[42］．发现模型组的结肠组织中的气体和MTL水平是最低的，表明建模方法肯定降低了结肠组织中的气体和MT1的浓度。作为结肠运动性的主要胃肠激素，气体和MTL的浓度增加了不同剂量的AEHC，因此提高了结肠运动性。相反，模型组的结肠组织中的SS水平最高，表明建模方法可以促进结肠组织中SS的浓度。CGRP是最强大的血管扩张器之一，其弛豫效果比收缩效果强10倍。作为调节消化功能的重要神经递质或神经调节剂，CGRP可以抑制大多数胃肠运动和各种消化果汁的分泌[43］．模型组CGRP浓度高于A组，说明造模方法可增加结肠组织中CGRP浓度，这可能也是结肠蠕动减少导致便秘的因素之一。AEHC组结肠组织中CGRP浓度低于模型组，提示AEHC对结肠运动的抑制作用较弱。

c-Kit是一种跨膜蛋白。其配体的干细胞因子(SCF)由神经元细胞和平滑肌细胞产生。促进ICC的发育分化，维持其正常的生理功能。c-Kit标签间接反映ICC的数量和密度[44，45］．此外，ICC细胞在调节胃肠运动中起着关键作用，是胃肠运动的起搏器。因此，某些胃肠运动障碍可能导致ICC细胞数量和功能下降。根据以前的研究，慢性传输性便秘患者的结肠细胞计数减少。因此，本研究采用特异性表达和免疫组化技术对大鼠结肠细胞进行了观察。与正常组比较，模型组细胞数量明显减少，但治疗后细胞数量增加。研究表明ICC细胞和干细胞因子(stem cell factor, SCF)与c-kit/SCF信号通路密切相关。SCF是c-kit在机体各组织中表达的天然配体，但主要由骨髓基质细胞产生。每个c-kit单体通过细胞外结构域1-3与SCF结合。SCF二聚化后，c-kit单体的结构发生变化，产生均质二聚化，从而导致细胞膜上氨基酸残基的自磷酸化，刺激各种第二信号分子调控ICC的细胞功能。 The second signal molecule is phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), an apolipoprotein that converts 4,5-diphosphoinositide into 3,4,5-triphosphoinositide through the combination with tyrosine 721 of c-kit. Previous research showed that PI3K inhibitors Wortmannin and LY294002 gave rise to abnormal development of ICC by blocking the signal [46］．我们的实验发现，不同剂量AEHC组模型组c-kit、SCF蛋白和mRNA的表达先下降后升高，虽然低于正常水平。PI3K的mRNA表达明显增加。因此SCF/c-kit可能通过PI3K起作用。结果表明，AEHC可通过增加ICC细胞数量来调节胃肠道平滑肌。低剂量的AEHC对便秘没有显著影响,而中剂量和高剂量老鼠的首次排便时间缩短,增加粪便的含水量,改善推进剂的结肠癌、精制粪便的量,增加气体,MTL、CCK水平,加强了结肠收缩性。转化后AEHC的有效剂量初始为20 g/d，相当于本研究的中剂量和高剂量。

5.结论

本研究发现AEHC通过改善ICC功能和调节神经递质来促进肠道运动，证明AEHC具有治疗和预防便秘的潜力。提取物通过PI3K/SCF/c-kit信号通路增加ICC量，改善结肠慢波产生，调节平滑肌收缩节律。

然而，更详细的实验研究可能会提高对AEHC治疗STC的其他分子途径的了解，并有助于指导前瞻性临床研究评估其疗效和安全性。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

作者的贡献

颜帅和岳寅子对这部作品的贡献是一样的。所有作者都通过了最终论文。

致谢

国家自然科学基金项目(no . 81573979);国家自然科学基金项目(no . 81573979);本研究还获得了江苏省中医药管理局科技项目(no。苏州市科技发展计划资助项目(YB2017061);苏州市工业技术创新项目(2015172);SYSD2016136,不。SYS201775,没有。(SYS201776);苏州中医医院学院项目(YQN2015007)。感谢中国博士后科学基金资助项目(2017M620220)的资助。

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