文摘

Periplaneta美国提取(PAEs)展览伤口愈合的特性。然而,内在的分子机制并不清楚。这里,我们对待人类皮肤成纤维细胞(HSF)与PAE和扩散是由3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定。伤口愈合和transwell迁移分析被用来检测细胞迁移。核转录因子(NF -κBκB)和细胞外signal-regulated激酶(ERK)通路通过免疫印迹(WB)进行了分析。使用免疫荧光染色检测细胞的关键分子定位。结果表明,PAE增强HSF细胞的增殖和迁移。RelA等关键蛋白质的表达和激活和p-ERK NF -增加κB和ERK途径核易位紧随其后。体内,WB(包含IHC)及免疫组织化学染色显示,PAE增强》κBα和RelA p-ERK激活和核易位。我们的研究表明,PAE的保护作用是通过增强的NF -介导的κB和ERK信号。

1。介绍

皮肤伤口愈合是一个复杂的过程,包括细胞增殖,迁移和矩阵合成。通常分为三个阶段,包括:(1)炎性细胞阶段,(2)细胞增殖,和(3)组织重构(1]。各种类型的细胞包括上皮和间充质细胞和成纤维细胞发挥关键作用在伤口愈合2]。热损伤引起的皮肤组织损伤后暴露于火焰,热表面和液体,极端寒冷,化学品,辐射,或摩擦3]。即使通过生物皮肤替代物改善预后和治疗干预,伯恩斯表示死亡率的一个重要原因。

Periplaneta美国展品在伤口愈合疗效。在1985年,Periplaneta美国提取(PAE),也被指定为W11-a12或Kangfuxin,首次用于临床。随后,它已经被广泛应用在中国治疗严重的溃疡和烧伤。管理静脉注射和口服或直接应用于伤口局部(4,5]。PAE的治疗效应的机制还没有完全建立。早期研究表明,PAE股权提升疗愈的老鼠维持结合辐射(6 Gy) (3和伤口伤6]。在目前的研究中,我们关注的分子机制PAE局部使用热损伤后小鼠的皮肤上的伤口。

ERK属于增殖蛋白激酶(MAPK)的家庭。ERK1 ERK2形式MAPK级联中的核心组件和表面受体的信号转导中起关键作用的核。激活ERK二聚体把原子核和调节多个基因转录,如Elk-1、ATF, NF -κB, Ap-1 c-fos,导致细胞增殖和分化、细胞骨架结构、细胞凋亡等生理反应(7,8]。生物效应,反过来,决定是否ERK-expressing细胞进入细胞死亡程序,生存,或分化9,10]。

NF -κB是一个转录因子调控多种基因的表达和细胞功能,包括移民和生存11]。NF -κB激活是受负面反馈由我κ结合NF - B抑制剂κB,但经历ubiquitin-mediated蛋白酶体降解,释放NF -κB核易位和转录12]。NF -κB触发细胞增殖和迁移。异常NF -κB表达诱发自身免疫性疾病、慢性炎症、代谢疾病和癌症(13]。早期的证据揭示了三个独立的途径:规范化NF -κB通路;另一种NF -κB通路;和一个独立的途径14,15]。规范化途径参与伤口愈合的成纤维细胞迁移和发展。此外,NF -κB是一个redox-sensitive转录因子作为传感器的氧化应激(16]。热损伤诱发局部组织缺氧。我们假设PAE治疗提高了NF -κB信号通过激活伤口愈合的。因此,在目前的研究中,我们调查了PAE的生物功能和机制在人类皮肤成纤维细胞和大鼠皮肤损伤模型来促进PAE的临床应用。

2。材料和方法

2.1。细胞系

人类皮肤成纤维细胞(HSF)细胞株从美国购买类型细胞培养/写明ATCC crl - 2522™是培养与10%胎牛血清的DMEM (Gibco生命科学,大岛)和1% penicillin-streptomycin(σ,V900929) 37°C湿润孵化器以5%的二氧化碳。

2.2。PAE的准备

p .美国获得良好农业规范(GAP)育种基地,四川,中国。粉干p .美国(200克)提取90% EtOH (1.2 L)两次在80°C。溶剂蒸发后,乙醇提取恢复。提取(20 g)是悬浮在水在80°C(200毫升)。过滤后通过0.22µm过滤膜在适当的浓度,这是存储在−20°C到使用。HPLC-diode阵列探测器(HPLC-DAD)是用于研究p .美国提取。PAE的化合物进行了分析(图1)使用Diamonsil C18(250×4.6毫米;5µ米)色谱柱。优化流动相的溶剂(3% v / v甲醇在水中含有0.07% v / v乙酸)和B溶剂(甲醇)。以下的时间(分钟)/流动相梯度(%)/移动使用B阶段(%):0.0 / 100/0,10/100/0,20/70/30,21/50/50,和35/0/100 0.6毫升/分钟的流量在25°C和检测波长254 nm 10μL注入体积。

2.3。肝癌细胞增殖化验

诱导的体外细胞增殖PAE使用MTT试验确定。简单地说,细胞被播种在200年一个卷µL(3000细胞/)在96孔板培养与不同浓度的PAE。包含血清的培养基被MTT每24 h所取代。肝癌和最终浓度为0.5毫克/毫升加入4 h井其次是孵化的37°C。浮在表面的被抛弃,取而代之的是DMSO (150µ信用证)。光密度(OD)测定在570 nm NOVOstar微型板块读者。实验重复了一式三份。可行的浓度计算使用GraphPad Prism 5.0。

2.4。Transwell迁移分析

后化验HSF细胞的迁徙行为PAE治疗Transwell Milicells (8μ米孔隙大小、微孔、美国),90%的支流T-25瓶HSF细胞治疗有或没有,PAE股权(0.3125毫克/毫升)。一个600µl 10%的边后卫生长培养基添加到众议院,其次是胰蛋白酶化使用标准程序。最后的颗粒是resuspended 2毫升的无血清培养基(SF-EMEM)和种子细胞(2×10⁴/细胞)在参议院。孵化24 h后,钱伯斯和4%多聚甲醛固定30分钟和苏木精染色,持续15分钟。我们使用光学显微镜计数细胞。

2.5。细胞划痕测试

细胞划痕试验尤其适合研究调查cell-matrix,和对细胞迁移的相互作用的影响。HSF被播种在6-well板块和10%的边后卫生长介质包含PAE的无血清培养基补充(0.3125毫克/毫升)融合增长到90%。治疗后48 h,培养基被除去,使用一个200层被刮花了μL吸管来创建一个统一的伤口游离。与无菌PBS碎片被轻轻洗。细胞运动到伤口区域监控和拍照在0,使用光学显微镜24和48 h。

2.6。免疫印迹

总蛋白提取(30到50μg)细胞溶解产物的准备。每个样本受到12% SDS-polyacrylamide凝胶电泳。然后,蛋白质是涂抹到PVDF膜(Billerica的微孔,MA)为2 h 230毫安。主要抗体IKKβ(1:1000;细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),导出κBα(1:1000;细胞信号技术,丹弗斯,马,美国),我κBα(1:1000;细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),RelA (1: 1000;细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),p-ERK (1: 1000;细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),ERK (1: 1000;细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)β肌动蛋白(1:1000;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),根据制造商的指示。洗膜后,二次抗体(HRP-conjugated anti-mouse /兔免疫球蛋白)是用于检测。乐队与ECL可视化检测系统。

2.7。免疫荧光染色

在无菌播种细胞后24 h,幻灯片添加不同剂量的PAE 48 h。每组HSF细胞被洗过两次的PBS和固定的4%多聚甲醛(pH值7.4)6-well盘子和孵化与0.5% Triton x - 100 30分钟在室温下,紧随其后的是屏蔽5% BSA 1 h。幻灯片与以下主要抗体:孵化RelA(稀释1:100;细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),phospho-ERK(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),和ERK(美国细胞信号技术,贝弗利,MA)在一夜之间在4°C。这些细胞被孵化与相应的荧光dye-conjugated二级抗体(稀释1:200;美国细胞信号技术,贝弗利,MA)在37°C 1 h和保护。使用荧光显微镜的细胞被可视化。

2.8。小鼠模型的热灼伤

8名健康成年男性C57小鼠从西方购买中国医学院的临床前和法医,四川大学,中国。所有的实验根据指南的护理和使用实验动物在四川的动物实验中心。最初,8动物称重和肌内注射硫酸阿托品(0.04毫克/公斤)。10分钟后,他们注射氯胺酮麻醉结合10%甲苯噻嗪(90毫克/公斤)和2%(10毫克/公斤)肌内。正常动物麻醉时,背上处理1%聚乙烯吡咯烷酮碘。热损伤了固体铝棒(φ10毫米)之前加热开水(100°C)。酒吧是保持对称接触皮肤15秒的背侧。压力对动物皮肤与50克的质量。后立即手术,镇痛dipyrone钠(40毫克/公斤)进行肌内,并保持与钠dipyrone(200毫克/公斤)的饮用水连续三天。左背侧皮肤擦了PAE(5毫克/毫升),而正确的被给予等量的生理盐水。在21天的治疗,伤口愈合率测定天点0,7、14、21治疗后。伤口愈合率测量和完整的伤口愈合时间计算使用公式:伤口愈合率=原来的伤口面积/原始区域(17]。老鼠牺牲后21天。

2.9。免疫组织化学和采用免疫染色

短暂,皮肤组织在福尔马林固定石蜡和嵌入。连续石蜡切片(4μ米)的组织样本制备和孵化一夜之间在4°C主要抗体,其次是孵化与peroxidase-labeled聚合物共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(设想/合、Dako、丹麦)。所有IHC检测进行了根据制造商的指示。

2.10。统计分析

使用SPSS 11.5统计分析(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)或棱镜6.0(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。定量数据与小动物——一张长有学生的评估以及,单向方差分析(方差分析)。被认为具有统计显著性差异< 0.05。

3所示。结果

3.1。体外PAE促进细胞增殖

肝癌细胞增殖试验是用来检测PAE的适当浓度和时间点HSF细胞系在早期通道(通道8 - 10)。执行的化验在24 h, 48 h,和72 h表明,低剂量(0.3125毫克/毫升)的PAE促进细胞生长(图2),特别是在48 h的治疗(< 0.05;单向方差分析)。有趣的是,图中给出的数据2表明,PAE更高浓度(1.25毫克/毫升)可以抑制细胞增殖。最重要的是,我们选择最优浓度为0.3125 mg / mL的时间48小时治疗在后续试验。

3.2。PAE HSF的促进迁移

细胞迁移到一个“伤口”上创建的单层细胞显示伤口愈合的影响。剥蚀的HSF诱导上皮细胞迁移的一部分关闭伤口松散连接的细胞数量,也模仿体内细胞迁移期间的行为(18]。

确定PAE HSF皮肤细胞迁移,我们执行transwell和伤口愈合化验。人类皮肤成纤维细胞治疗与PAE的最终浓度为0.3125毫克/毫升48 h。如图3(一个),细胞治疗PAE显示迁移效率与控制倍(< 0.01)。类似于transwell测定,细胞划痕试验也显著提高迁移的伤口关闭PAE-treated群HSF细胞(图3 (b),< 0.01)。

3.3。PAE增强NF -κB规范途径和ERK的磷酸化

与对照组相比,下游RelA规范化NF -的表情κB通路显著的高于PAE-treated细胞。有趣的是,我们发现ERK的磷酸化水平显著提高的ERK总蛋白质含量变化(< 0.05)(图4(一))。这些建议PAE增强NF -κB典型途径和ERK通路。此外,我们确定了PAE的分子机制激活的NF -κ使用湾11 - 7082 B通路,一个完整的和特定的NF -κB通路抑制剂(图4 (b))[13]。结果表明,导出的表达式κBα逐渐减少剂量的湾11 - 7082。此外,NF -的活动κB通路被抑制。我们添加了PAE(0.3125毫克/毫升最终浓度)后抑制NF -κ使用湾11 - 7082 B通路。治疗后与PAE 48 h,我们发现PAE的重新引入未能恢复》的表达κBα这表明NF -κB通路仍抑制(图4 (c))。此外,如图4 (d)和4 (e),PAE-induced细胞生长和迁移是由预处理预防与HSF湾11 - 7082细胞。结果证实,PAE类似物提升HSF迁移和扩散通过激活NF -κB通路。

3.4。PAE增加RelA和磷酸化ERK核易位

如图5(一个)抗体对RelA显示绿色荧光,而原子核被DAPI染色蓝。重叠的地方在合并后的图像呈现海蓝宝石的颜色。对照组表现出细胞质中的绿色荧光。PAE治疗期间,绿色荧光是均匀分布的,海蓝宝石区域合并图像增加暗示易位的RelA细胞质细胞核。也发现类似的结果在p-ERK蛋白质(图5 (b))。然而,ERK易位发生(图5 (c))。PAE增加蛋白质含量随着核易位RelA和p-ERK蛋白质。

3.5。PAE促进伤口愈合的皮肤热燃烧体内

基于体外PAE对迁移和扩散的影响,我们假设PAE改善皮肤伤口愈合体内。

简单地说,我们创建了一个深度二级热灼伤C57小鼠,在材料和方法描述。最初,我们未能区分皮肤损伤,直到肿胀和溃疡在接下来的日子里被发现。燃烧与PAE擦拭。治疗伤口显示显著的治疗。

显微镜、免疫组织化学和采用免疫染色显示上皮修复,毛囊再生,PAE治疗后和纤维组织的形成。愈合率和愈合阶段显示PAE-treated伤口伤口和控制之间的显著差异。PAE-treated伤口的愈合率高于对照组在治疗阶段(表1和图6,< 0.05)。总的来说,结果表明,PAE大大加速烧伤伤口的愈合。

3.6。PAE增强NF -κB通路和ERK体内磷酸化

定期组织微阵列构造使用收集到的样本从伤口边缘不同治疗方法用描述的方法。免疫组织化学染色(包含IHC)进一步证实了NF -的监管机制κB和ERK途径底层PAE效应在治疗阶段。具体来说,RelA NF -水平κB通路显著改善治疗组和p-ERK染色ERK蛋白总量的增加而几乎没有改变(图7(一))。同时,免疫印迹建议的角色RelA PAE-treated伤口和上游IKK的表达β和我κBα不同组之间没有显著变化。ERK的表达总ERK的磷酸化增强的同时,显示没有变化(图7 (b))。因此,通过增强NF - PAE促进伤口愈合κB和ERK通路活动体内。

4所示。讨论

PAE的治疗作用在伤口愈合临床已经证明19- - - - - -21]。然而,由于复杂的化学成分,其潜在的分子机制仍不清楚。在目前的研究中,我们提取和纯化的产品p .美国更有效的提取和分析进行进一步的研究。我们发现PAE的影响在人类皮肤成纤维细胞在体外的增殖和迁移和热损伤愈合使用小鼠模型[4,19]。结果表明,通过NF - PAE促进伤口愈合ΚB信号在体外和体内。

伤口愈合是精心组织的生物事件组成的三个不同的但是重叠阶段:炎症、扩散和重构。成纤维细胞是主要的皮肤组件之一,因此被视为伤口愈合效率的重要决定因素22]。在我们的研究中,我们发现,PAE HSF的促进增殖和迁移23]。建立PAE的药理作用和验证最优提取工艺,HSF是在体外伤口愈合模型用于评价PAE的细胞和分子的影响。成纤维细胞增强扩散和迁移与PAE(0.3125毫克/毫升)治疗后48 h。此外,PAE显著增加愈合率和减少恢复时间提高上皮修复,毛囊再生,体内及皮肤的热损伤后纤维组织增生(24- - - - - -26]。

生长介质的表达由NF -调制κB通路。NF -κB扮演了一个至关重要的作用在调节细胞外刺激的免疫应答。它通常是隐藏在细胞质中被称为抑制剂抑制蛋白质家族的NF -κ(我κBs) [16,27]。激活NF -κB,从其抑制蛋白质释放RelA我κB -α,紧随其后的是核易位触发特定的目标基因的转录,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6 (23,28]。确定NF -的分子机制κ激活,我们测试了上游IKK的表达β导出,κBα,我κBα和下游RelA激活。结果表明,PAE刺激极大地增加了我的磷酸化κBα和RelA蛋白质。然而,PAE-induced我κBα和激活明显被RelA预处理湾11 - 7082。与此同时,我们发现了类似的结果在皮肤的热损伤体内。总的来说,我们的研究结果表明,体外PAE促进了迁移和增殖和伤口愈合体内通过NF -κB激活。

同时,我们假设PAE可能激活多个途径导致HSF增殖和迁移。我们发现增加磷酸化和核易位p-ERK尽管总ERK的稳定水平。磷酸化ERK1核易位和ERK2基因转录和表达的关键。因此,ERK1/2动力学和本地化的内在联系。ERK1和ERK2是最彻底的研究ERK的家人和参与多种生理过程,包括调节细胞减数分裂,有丝分裂和后期。各种各样的刺激生长因子和细胞因子等与ERK1/2通路的激活有关。ERK激活决定了它的细胞增殖和迁移29日]。在这项研究中,PAE作为刺激使ERK1/2磷酸化,从而导致皮肤伤口愈合。

5。结论

总之,PAE促进伤口愈合在体外和体内实验模型。这些过程与NF -激活的增加密切相关κB和ERK信号通路。此外,增强活动的NF -κB和ERK途径可能代表PAE的主要分子靶点,加速伤口愈合的移植一系列基因的表达在细胞增殖,纤维发生,reepithelialization,重塑2,29日,30.]。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(没有。81403194)。