长期影响中医Yangqing Kangxian公式在Bleomycin-Induced肺纤维化大鼠通过调节核因子-κB信号

文摘

客观的。我们旨在评估治疗效果和长期影响YKF和解剖的潜在机制。材料和方法。IPF老鼠给YKF、强的松或pirfenidone,分别从第一天到42天,紧随其后的是28天不干涉的时间间隔通过70天。用力肺活量(FVC)、组织病理学、羟脯氨酸(忧郁)内容、肺系数、血液炎症细胞群,炎性细胞因子水平的肺组织,和蛋白质参与核转录因子的表达——(NF)7 B信号通路被评估在天,14日,28日,42岁的70人。结果。忧郁内容,阿什克罗夫特评分、肺系数和肺纤维化在IPF老鼠血液细胞数量显著增加,而FVC拒绝了。所有上述参数改善治疗组从7天到70天,尤其是在YKF组。信使rna和蛋白质表达的肿瘤坏死因子(TNF)α显著降低,而干扰素(IFN)γ显著增加,磷酸化的细胞质核转录因子kappa-B激酶的抑制剂β(IKKβ),抑制剂kappa-B核因素α(我κBα),和NF -κB明显下调YKF组从7天到70天。结论。YKF有益的保护和长期对肺纤维化的影响了抗炎反应,减轻纤维化。

1。介绍

特发性肺纤维化(IPF)是一个阴险的和进步的障碍表现为异常的细胞外基质的沉积,从而导致不可逆转的破坏肺部气体交换的体系结构和功能障碍(1]。最近的研究表明越来越患病率和发病率增加的IPF (2,3]。这是一个致命的疾病在2 - 5年生存中值估计诊断。然而,目前的治疗方法,由pirfenidone,证明有副作用,带来了沉重的经济负担4,5]。因此,新颖的治疗药物是IPF的有效治疗的迫切需要。

IPF是一种严重的结果异常的肺组织损伤修复过程。这个病理生理的失调包括上皮损伤之间的复杂的相互作用,氧化应激,凝血障碍,炎症,最终导致一些细胞类型转换为myofibroblasts和细胞外基质沉积6]。当遇到入侵者,肺泡上皮细胞可以分泌肿瘤坏死因子(TNF),α中介炎症信号通路(7),它可以放大炎症反应核转录因子的激活——(NF)κ转录因子。炎症反应是负责招聘白细胞和淋巴细胞的氧化应激损伤的加重(8]。数据表明TNF -α高架在支气管肺泡吸入的IPF患者(9]。干扰素(IFN)γ是一个重要的th1细胞因子,抑制成纤维细胞增殖和胶原蛋白积累在体外和体内研究10,11]。

中药(TCM)提供了有效的治疗慢性肺疾病几千年来,包括减轻临床症状,改善肺功能、运动能力(12,13]。长期治疗优势的显著特征是中医治疗。当前传统公式和药用植物单体的研究被证明是有效的治疗IPF (14- - - - - -19]。例如,Buzhong益气公式可以通过调节免疫反应抑制炎症,Yu Ping冯公式可以减轻肺纤维化,减少转化生长因子的表达——(TGF)β1,α光滑的肌肉肌动蛋白(SMA),胶原蛋白(COL) 1。此外,我们先前的研究已经证实,中医公式显示长期慢性肺疾病有益的影响可能通过调节脂质代谢、氧化应激和炎症反应通路系统级(20.- - - - - -24]。在IPF患者的临床治疗中,我们发现Yangqing Kangxian公式(YKF)有有益的影响减轻IPF患者的临床症状,其HRCT出现间质性肺炎。然而,长期影响和潜在治疗对IPF YKF机制不清楚。

在这项研究中,我们观察到的用力肺活量(FVC)、肺组织形态学、羟脯氨酸(忧郁)内容,在血液和肺组织炎症生物标记,激活NF -κB信号通路和旨在调查YKF疗效的机制。

2。材料和方法

2.1。药物

Yangqing Kangxian公式,传统中药的一个公式,是由制药部门河南中医药大学。YKF的主要成分见表1。药草都是水或化学预处理和制成干提取,最终根据其标准操作程序。每个1 g干燥提取包含3.01克生草本植物。

博来霉素从日本购买Kayaku(批号730342)。醋酸泼尼松片是购自浙江仙居制药有限公司,有限公司(批号140138)。Pirfenidone捐赠了北京大陆制药有限公司有限公司(批号150603)。

2.2。动物

二百的雄性sd大鼠中(权重 g,证书:SCXK (Yu), 2010 - 0002年)从实验动物中心购买河南(郑州,河南,中国)被安置在个人通风笼(Fengshi、江苏、中国)位于第一附属医院、河南中医药大学,免费的纯净水和颗粒饲料(Xietong医学生物工程、南京、江苏、中国)。实验室温度保持在22 ~ 24摄氏度(°C),相对湿度在50% ~ 70%。所有老鼠都适应,安置在实验室实验前5天。实验过程是实验动物保健和伦理委员会批准第一附属医院,河南中医药大学(郑州,河南,中国)。

2.3。模型的准备和管理

所有的老鼠被随机分为对照组( ),BLM组( ),BLM + YKF集团( ),BLM + PD组( ),BLM + PF集团( )。控制老鼠气管内的注射磷酸盐(PBS)通过插管后用10%水合氯醛麻醉。其他的老鼠气管内的注射博来霉素(5毫克/公斤)溶解在PBS (25]。控制和BLM老鼠被生理盐水治疗,和其他三组YKF(0.89克/ 100克体重),强的松(0.5毫克/ 100克体重),和pirfenidone(5毫克/ 100克体重),分别为(15,26]。所有的治疗都开始24小时(1天)后博来霉素挑战,q.d。为42天,然后政府停止从43天到70年。表中所示的实验协议2。剂量调整了每周根据身体质量。YKF的剂量是根据人体表面积转换公式计算: : :剂量; :体型指数; :体重。

六个老鼠牺牲在每组7天,14日,28日,42岁,其余都牺牲了70天,样本收获为分析做准备。

2.4。FVC测试

FVC决心与计算机控制肺功能测试(击球)系统(美国BUXCO、DSI、锰)。被麻醉,气管内插管后,老鼠被放置在密封室通过插管和连接到设备,体积和呼吸数据获得的压力传感器和面对FlexiVent软件(美国BUXCO、DSI、锰)。

2.5。血液细胞学分析

FVC测试后,麻醉动物的血液样本收集。血液炎症细胞的数量被自动微分分析细胞计数器(贝克曼库尔特 。T™5 diff,我们在我们的实验室)。

2.6。肺系数计算

与冰冷的PBS溶液被免职,清洗后,肺叶都擦滤纸和肺湿重是重的。肺系数计算肺湿重的比值(mg)和体重(g)。

2.7。在肺组织羟脯氨酸测定

忧郁的内容根据生产指令的测量工具(南京建成,中国)。80毫克肺组织与1毫升的碱性水解,水解在95°C煮20分钟,然后在3000转离心10分钟在4°C。得到的上层清液和羟脯氨酸含量测定的紫外分光光度计(热费希尔、马、美国)。研究结果表示在微克每克组织(μg / g组织)。

2.8。组织形态学和免疫组织化学分析

气管插管,肺是从胸腔中删除。正确的肺外的支气管与缝合线的结扎,肺和右叶被移除。左肺叶通过气管与10%中性缓冲福尔马林perfusion-fixed 30厘米的恒压固定剂2 h,并沉浸在进一步处理之前相同的固定剂72 h。福尔马林固定后,左肺叶切成3毫米厚的组织块和嵌入在石蜡(德国徕卡)分级后乙醇脱水,二甲苯透明样变化。五μ米厚的部分被切片,与标准的苏木精和伊红染色(他)解决方案(Solarbio,北京),和马森的三色的染色工具(Solarbio,北京)根据指令。Histomorphological变化在显微镜下检查(德国徕卡),和三个不重叠的故事被抓获/肺图像分析由两位研究者盲评。阿什克罗夫特分数是评估评估肺纤维化的程度,如下:0:正常的肺;1:最小的纤维性肺泡或细支气管壁增厚;3:适度增厚墙没有明显损伤肺架构;5:增加纤维化肺纤维的结构和形成明确的损害乐队或小纤维质量;7:严重扭曲的结构和大型纤维领域(“蜂窝肺”是放置在这一类);8:总纤维闭塞的领域27]。

免疫组织化学分析,部分被封锁5%牛血清白蛋白(BSA) 20分钟和孵化抗体TNF -α(1:150稀释,bios、北京、中国)和干扰素-γ(1:100稀释,bios、北京、中国)在4°C 12 h,其次是孵化与山羊anti-rabbit免疫球蛋白G (ZSGB-BIO,北京)25°C 2 h;然后用苏木精复染色的部分。上述蛋白的表达与徕卡显微镜观察,收集和图像半定量的分析通过Image-Pro + 6.0专业图像采集与分析系统(媒体控制论,医学博士,美国)。三个不重叠的故事被抓获/肺图像分析由两位研究者盲评。IHS分数计算是罗伯特的报告28]:阳性细胞数量包括以下:不染色得分为0,1 ~ 10%的细胞染色得分为1,11 ~ 50%,51 ~ 80%为3,81 ~ 100%,4。染色强度评分等级和一个0到3:0 =负面;1 =弱;2 =温和,3 =强劲。当有多病灶的免疫反应性和焦点之间的染色强度有显著差异,最强烈和最强烈的染色的平均被记录。原始数据被转换为IHS乘以数量和染色强度的分数。

2.9。实时聚合酶链反应分析

肿瘤坏死因子的表达式α和干扰素-γmrna的肺组织分析定量实时聚合酶链反应(存在)。用试剂盒总RNA提取试剂(加州Ambion我们)根据指令;总RNA浓度和完整性验证了NanoDrop2000 nanospectrophotometer(热,妈,美国),在2%琼脂糖凝胶电泳。逆转录(RT)继续使用上标®三世第一链合成SuperMix存在工具包(表达载体,加利福尼亚,美国),和实时PCR反应是由使用铂®SYBR®绿色qPCR SuperMix-UDG火箭设备(表达载体,加利福尼亚,美国)。指令后的反应系统准备的工具和反应ABI 7500实时仪器(ABI,加利福尼亚,美国)。最初的酶激活步骤2分钟在95°C,紧随其后的是40 95°C的周期15年代和60°C 30年代。PCR年底评估特定的目标基因的扩增,融化曲线从60到95°C也包含在每次运行。肿瘤坏死因子-的引物α和干扰素-γ设计、合成了Genscript生物技术有限公司(南京、江苏、中国)。序列表所示3。

2.10。免疫印迹分析

radioimmunoprecipitation测定肺组织均质(里帕)裂解缓冲包含氟化phenylmethanesulfonyl PMSF和磷酸酶抑制剂(Solarbio,北京)在12000转离心5分钟在4°C,和核总蛋白提取。我的磷酸化κBα(导出κBα)和IKKβ(p-IKKβ)和核磷酸化NF -κB (p-NF -κB)在肺和免疫印迹技术测定。蛋白质浓度检测根据BCA蛋白质的指令分析工具(Solarbio,北京),然后在100°C蛋白变性进行10分钟的2% SDS和5% 2-mercaptoethanol补充道。30μg蛋白分离10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(微孔,贝德福德,妈,美国)。膜被封锁的5%脱脂牛奶然后孵化主要抗体,p-NF -κB,》κBα,p-IKKβ(美国CST, MA), GADPH (Proteintech,武汉,中国)和辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(Proteintech,武汉,中国)随后。信号被使用了超级ECL试剂(Solarbio,北京)和被扫描并量化分子凝胶成像仪®文档™XR系统(Bio-Rad、钙、美国)。

2.11。统计分析

除非特别注明,每组六个老鼠纳入统计分析在7天,14日,28日,42。70天,四个老鼠在BLM组,五在BLM + PD组,和六个老鼠在其他三组,分别被纳入统计分析。

统计数据表示为均值的平均值±标准误差(SEM)。克鲁斯卡尔-沃利斯测试使用,如果数据不符合正态分布;如果数据符合正态分布,单向方差分析后跟SNK或Dunnett T3事后测试被用于多个比较。差异被认为是重要的值< 0.05。所有与SPSS 19.0软件进行统计分析(IBM、纽约、美国)。

3所示。结果

3.1。死亡率

从0到14天,天BLM组和治疗组的老鼠死于严重肺炎由博来霉素诱导。从15到28天,两天老鼠死于窒息时填喂法在BLM + YKF BLM + PF组(表4)。

3.2。在老鼠身上YKF改善肺功能

正如我们所知,肺功能进行性加重的IPF的一个特性。阐明在BLM-induced YKF肺功能障碍的影响,FVC动态测试。因此,老鼠FVC BLM组明显减少。与BLM的老鼠相比,这是改善YKF,强的松和pirfenidone治疗组在整个实验过程中在不同的度。此外,FVC显著增加YKF治疗大鼠70(天 )。三个治疗组没有显著差异(图1(一))。

3.3。在老鼠身上YKF减轻肺损伤和纤维化

肺系数是一个指数来评价肺部水肿。BLM暴露导致的肺系数显著增加7天70 ( )。与BLM组相比,明显降低在YKF组(28天7日,14日,到70年, 或 ),强的松组(7天、14和28日 )和pirfenidone(14天, )。与YKF组相比,强的松组肺系数低14天( )(图1 (b))。

确定治疗后肺损伤的程度,部分肺组织被沾染了他走时,马森三色的,和肺纤维化的严重程度评估根据阿什克罗夫特得分。正常结构与病理变化没有显示在控制老鼠显微镜下。广泛的炎性浸润,以中性粒细胞和巨噬细胞聚集,并观察肺泡壁增厚明显在实质IPF老鼠从7天14博来霉素后0天的挑战。同时,纤维化地区显著破坏肺泡单位和积累胶原的沉积也观察7天,从第14天加重。在28天,42岁,到70年,合并纤维化领域伴随着胶原蛋白积累是很明显的。炎症明显,抑制大鼠治疗YKF,强的松,或从7到70天后pirfenidone BLM的挑战,以及阿什克罗夫特分数的减少纤维化(数字2(一个),2 (b),3(一个))。

肺纤维化的特点是胶原蛋白的积累。忧郁是胶原蛋白内容的索引。忧郁的分析内容进行评估YKF的效果。忧郁高架在BLM挑战老鼠从28天到70天。与BLM组相比,它在YKF明显减少,强的松,各级pirfenidone集团从28天到42天( )。与BLM的老鼠相比,忧郁水平明显降低YKF和pirfenidone治疗大鼠( ),但不是在强的松治疗大鼠( 在70天)。没有显著差异的三个治疗组在每个时间点(图3 (b))。

3.4。YKF调节炎症反应

血液中炎性细胞的数量被自动微分分析细胞计数器。因此,BLM的挑战导致显著增加白细胞数量从7天到70天( 或 ),而有倾向抑制YKF组(42天7日,14日,到70年, 或 ),强的松组(7天、28和42岁的 或 ),pirfenidone组(7天、28天的评分, )。与YKF组相比,pirfenidone组的白细胞人口70(天高 )(图4(一))。

较BLM组、淋巴细胞水平的YKF组显著降低在天7日14日28日和70年( 或 );YKF组淋巴细胞数量明显减少(7天、14和42岁的 或 ),强的松组(7天、14和28日 或 ),pirfenidone治疗组(14天, )。与YKF组相比,淋巴细胞水平更高pirfenidone组14天( )(图4 (b))。

博来霉素组中性粒细胞显著增加从7天到28天( )。与BLM组相比,中性粒细胞水平显著降低YKF(天7、14和28日 )、强的松(14天、28天的评分, 或 ),pirfenidone组(7天、28天的评分, )。嗜中性粒细胞数量是YKF组大于pirfenidone组7天( )。与强的松组相比,中性粒细胞水平低pirfenidone组7天(图4 (c))。

单核细胞在天7和14日增加博来霉素挑战大鼠( )较BLM组;他们大大减少YKF、强的松和pirfenidone组在7和14天( 或 )(图4 (d))。三个治疗组没有显著差异(图4 (d))。

炎性细胞因子TNF -α和干扰素-γ蛋白质和mRNA在肺组织被免疫组织化学染色和rt - pcr检测。从70年7天,TNF的表达α蛋白质和mRNA BLM挑战大鼠明显增加( ),显著降低YKF、强的松和pirfenidone治疗大鼠(数字5(一个)~5 (c))。三个治疗组没有显著差异(数字5(一个)- - - - - -5 (c),数据7(一)- - - - - -7 (b),图8)。干扰素的表达γ蛋白质和信使rna从第七天增加到第14天博来霉素挑战老鼠和减少从28天到70天。YKF和pirfenidone显著增加干扰素的表达γ从70年7天;然而,强的松没有调节干扰素的表达——工作γ在每一个时间点( )。增加干扰素的表达γ信使rna博来霉素诱导的抑制的治疗YKF和pirfenidone ( )(数据6(一)- - - - - -6 (c),数据7 (c)- - - - - -7 (d),图8)。

NF -κB信号通路是一个重要途径,已经被证明是过度激活的炎症反应。NF -κ与博来霉素B信号通路激活在肺组织的挑战。进一步澄清在BLM-induced YKF肺损伤的作用,激活蛋白与NF -κB信号通路被免疫印迹检测。结果如图9(一个)和9 (c)有明显的海拔p-IKK的表达β蛋白质从7天博来霉素挑战后70 ( ),而这是YKF明显抑制,强的松和pirfenidone治疗大鼠( )。与pirfenidone和强的松组相比,p-IKK的表达β减少各级YKF组在整个实验(42天14日,和70年: 或 )。如数据所示9(一个)和9 (d)导出的表达式κBα蛋白质在博来霉素显著增加挑战老鼠从7天70 ( 在YKF),明显抑制,强的松,pirfenidone组( )。与pirfenidone和强的松组相比,导出κBα减少各级YKF组在整个实验(42 14天7日,28日,和70年: )。结果在图9 (b)和9 (e)表明p-P65蛋白的表达在博来霉素显著增加挑战老鼠从70年7天 ,明显抑制YKF、强的松和pirfenidone治疗老鼠 。与pirfenidone和强的松组相比,p-P65减少各级YKF组在整个实验(天7、14、28和42: 或 )。

4所示。讨论

IPF是一种慢性的疾病。没有有效的治疗肺力学的进步的障碍和呼吸功能,诱导的肺组织损伤和修复。许多患者仍遭受生存时间短(29日]。根据中医理论,IPF属于Feiwei疾病的范畴。在早期阶段,主要综合征的特点是气不足,阴和热量和痰瘀(30.- - - - - -32]。基于中医理论和数据从之前的文献研究中,我们设计了Yangqing Kangxian公式,可温补气阴,促进血液循环,消除血瘀、清热、和痰消散。在IPF患者的临床治疗中,我们发现YKF有益的影响减轻IPF患者的临床症状。所以重要的是检查和澄清这个候选人中医公式的影响。

Bleomycin-induced肺纤维化模型是在先前的研究中使用。最初,BLM被发现在鳞状细胞癌和皮肤肿瘤有效,所以它被用于肿瘤的治疗。随着临床使用,副作用逐渐被医生(33]。因为肺纤维化的严重毒性药物,BLM被广泛用于动物肺纤维化模型的建立。bleomycin-induced肺损伤,大量增加炎症细胞浸润,肺泡壁增厚,过量的胶原蛋白沉积,肺泡结构的累积成纤维细胞增生,严重失真已经出现在疾病的进展(34,35]。先前的研究和我们的初步实验结果显示,慢性纤维化引起BLM可以存在很长一段时间(25,34]。因此,BLM-induced肺纤维化模型也适用于长期观察。

在这里,我们发现,炎症细胞浸润,胶原蛋白沉积,和忧郁水平高度观察在我们的研究中,和呼吸功能的下降是引起这些进步的病理变化。YKF管理有许多好处,如改善FVC,减轻肺损伤和减少纤维化程度,退出后仍有长期影响。改善的程度由YKF类似于给予强的松(一种药物被广泛用于治疗一次IPF)或pirfenidone(一种药物有条件地推荐在临床实践指南)。在目前的研究中,炎症细胞数量的增加在血液被治疗YKF镇压。上述结果表明,YKF可能导致调节炎症反应在IPF的过程中。

肺纤维化可能被视为肺部炎症过程的最终结果。损伤后的炎症反应对IPF的过程是至关重要的。响应包括炎症细胞的迁移和活化和某些细胞因子的释放。成纤维细胞增殖、迁移和胶原蛋白生产是由细胞因子刺激的。肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ已被证明是相关的IPF (1,6,9,10,36- - - - - -40]。我们的研究结果表明,肿瘤坏死因子-α是减少YKF治疗大鼠肺和干扰素-γ是增加了。这表明一些炎性细胞因子的释放可能由YKF监管。

对于进一步的潜在机制,我们专注于NF -κB信号通路相关的分子。NF -κB信号通路是一个重要途径,已经被证明是过度激活的炎症反应。在以前的研究中,NF -的激活κ与博来霉素B信号增加肺组织挑战[39,41]。在规范化途径,细胞是肿瘤坏死因子等刺激因素α,其次是IKK的激活β,我κBα和NF -κB;NF -κB核易位和磷酸化调节促炎的基因表达,增加生产各种炎性细胞因子(42,43]。在这项研究中,我们专注于细胞质IKK的磷酸化β和我κBα和核NF -κB (8),发现p-IKK的水平β导出,κBα,p-NFκ在博来霉素B是调节老鼠在每个时间点和被管理YKF表达下调。上述结果表明,抗炎反应,减轻YKF纤维化的影响导致其对肺纤维化的保护作用。

5。结论

综上所述,YKF有益的保护和长期影响肺纤维化,抗炎反应,减轻纤维化。因此,管理YKF可能是肺纤维化的有效疗法。

信息披露

孟李和李丫co-first本文的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

孟JianSheng李,李,李丫为研究设计做出了贡献。孟李和李丫同样这个手稿包括数据分析和手稿起草。SuXiang冯和刘Xuefang促成了制备Yangqing Kangxian公式。彭赵导致免疫印迹分析;Yunping白导致忧郁分析和rt - pcr检测。阳王,青青扁,君子李导致动物实验,组织形态学和肺功能测定。所有作者都阅读和批准最后的手稿。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(81673942,81673942),科学研究和具体基金国家中医临床研究基地(JDZX2015157),和基本的科学研究项目河南中医药大学(2014 kyywf-yq02)。

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