文摘

本研究进行评估Huzhang-Guizhi草药的疗效对(HG),首先包含在Hu-Zhang权力记录在太平天国生辉方,单钠尿酸盐在(MSU) crystals-induced痛风性关节炎大鼠。我们发现,预处理与HG与痛风性关节炎大鼠显著减弱踝关节肿胀,这有益antigout效应可能是介导的,至少在某种程度上,通过抑制肿瘤坏死因子-α(TNF -)和interleukin-1β(il - 1)生产滑液以及核转录因子κB p65 (NF -B p65)蛋白表达在滑膜组织中。此外,metabonomic分析表明,5和6与痛风性关节炎相关的潜在生物标志物在血浆和尿液,分别是主要参与能量代谢、氨基酸代谢、肠道微生物的新陈代谢,被确定。HG可以反向MSU-induced痛风关节炎的病理过程通过调节干扰代谢途径。这些结果提供了重要的机械的见解HG的保护作用与MSU-induced痛风关节炎大鼠。

1。介绍

痛风,一个古老的和常见的炎症性关节炎,是一种风湿性疾病造成沉积尿酸晶体(谷氨酸钠尿酸盐,密歇根州立大学)在人体组织和体液。这个过程是由生产过剩或尿酸的排泄。某些常见药物,酒精,和膳食食物是因素之一。急性痛风通常会体现作为一个敏锐地红,热,关节肿胀和极度的痛苦。这些急性痛风发作与口服消炎药物治疗反应良好,可能是预防药物和饮食的改变。反复发作的急性痛风可以导致一种退行性慢性关节炎称为痛风性关节炎(1]。

抗炎治疗痛风性关节炎的目的是消除巨大的疼痛,肿胀,残疾是由于急性发作(2]。非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)或秋水仙碱是根据当前一线全身治疗痛风性关节炎治疗指南(3]。然而,非甾体抗炎药的副作用可能包括急性肾功能衰竭和消化道出血。此外,治疗患者的禁忌是慢性肾脏疾病(CKD) (4]。作为补充和替代医学的一部分,中国传统药物和针灸也被用于治疗痛风,这,在某些情况下,一个优于非甾体抗炎药的副作用5- - - - - -7]。

草对(两个草药混合物)为基本组成单位的中草药配方,具有特殊的临床意义在中国传统医学(中医)和比其他更简单的复杂的公式在不改变其基本治疗功能(8]。蓼属植物cuspidatum(被称为“Hu-Zhang”)抗病毒,抗菌,抗炎,神经和心血管功能9]。桂枝(被称为“Gui智”)展品抗病毒,抗菌,抗肿瘤药,抗炎,抗过敏药、镇痛属性(10]。的结合这两种药草,称为Huzhang-Guizhi草对(HG)(比例为6:1),首先是包含在Hu-Zhang权力记录在太平天国生辉方,和我们之前的研究展示了antigout HG在急性痛风性关节炎大鼠模型的影响(11]。同时,HG也用于其他公式,如Lexing-tongfengke已广泛用于治疗痛风性关节炎在诊所12]。然而,痛风性关节炎的生化机制HG行为仍然难以捉摸。因此,我们的研究旨在阐明HG行为治疗的机制。

代谢组学是系统生物学的完善的领域,已经应用于观察有意义及相关生化变化由于疾病、毒性、营养和其他变量。Metabonomic研究可以提供宝贵的信息对理解分子机制和新颖的见解障碍在生物系统的状态13]。最近,使用超高效液相色谱与质谱(UPLC / MS),大鼠的代谢与MSU-induced痛风性关节炎和针灸的生物效应研究[5]。众所周知,核磁共振(NMR)谱和质谱(MS)与色谱分离步骤)(通常适合metabonomic的技术分析,但有不同的分析优缺点和提供补充信息14]。我们所知,metabonomic痛风性关节炎的研究在老鼠模型中基于NMR尚未报道。

在这项研究中,我们观察膨胀指数,组织病理学变化,炎性细胞因子的生产,和核转录因子,免疫组织化学κB p65 (NF -B p65)调查的有效性和抗炎机制对MSU HG crystal-induced在大鼠痛风,痛风性关节炎的实验模型中所观察到的类似临床痛风。此外,metabonomic方法应用于描述相关的代谢MSU-induced痛风关节炎和观察HG的保护作用在大鼠血浆和尿液。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

Huzhang和Guizhi从Heshuntang购买(广州)和身份验证的生药学的专家。蒸馏水是纯化使用Milli-Q超纯水系统(微孔,贝德福德,妈,美国)。密歇根州立大学晶体和氧化氘(D₂啊,99.9%)来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF -)和interleukin-1β(il - 1)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自亲和力BioReagents(美国有限公司黄金)。NF -B p65抗体购自圣克鲁斯生物技术有限公司(圣克鲁斯、钙、美国)。

2.2。草药萃取

的混合物Huzhang(60克)和Guizhi (10 g)碎成小块提取与水(1:10 w / v)下热回流2 h。收集滤液和残留在水中被回流(1:10 w / v)为1.5 h。两批滤液合并,然后集中在一个真空获得HG提取最终浓度为0.7 g / mL (w / v,表示为原材料的重量)。

2.3。动物处理和样品收集

所有的实验都是经当地伦理委员会批准,所有实验程序是符合美国国立卫生研究院的指导护理和使用实验动物。

共有18只成年雄性SD大鼠体重180 - 200克商业来自广州中医药大学实验动物中心,中国。老鼠保持温度控制(°C)和照明(08:00-20:00)条件与食物和水可以随意。经过7天的驯化,动物被随机分为三组(每组):(1)对照组;(2)痛风性关节炎模型组,(3)HG预处理组(HG组)。HG预处理组的老鼠被填喂法管理口头与HG剂量的9.3克/公斤体重每天一次连续7天。剂量在这项研究是根据剂量之前详细的文献中11]。控制和模型组收到车辆的体积相同,无菌生理盐水的形式,随着预处理组为7天。痛风性关节炎是诱导建立根据协议(15]:1 h后给药7天,密歇根州立大学晶体(100毫克/毫升,悬浮在无菌生理盐水)在左脚踝关节注射的老鼠模型组和HG 100年一个卷组μl .对照组收到了100年μL无菌单关节内注射生理盐水。不断注入密西根州立大学后,尿液收集(24小时)冰冷船只含有叠氮化钠0.5毫升的2%代谢笼。尿液收集后,所有的动物都被乙醚吸入麻醉和血液样本获得通过老鼠的轨道静脉丛。肝素被用作抗凝剂。等离子体是由离心分离在3500 rpm,持续15分钟。所有的尿液和血浆样本保存在−80°C,直到他们被立即解冻之前分析。从每个踝关节滑膜灌洗液收集注射5毫升磷酸缓冲盐(PBS)进入关节腔。洗胃液体被离心机在400克10分钟和上层清液储存在−生化决定前80°C,和滑膜组织轻轻的分开了免疫组织化学检查。

2.4。测量踝部水肿

关节炎的发展是通过测量评估痛风的脚踝大小之前和之后的感应。动物的发炎踝关节的周长测量使用3毫米宽的卷尺没有弹性MSU水晶注射后24小时。为了量化脚踝水肿,数据被转换为一个百分比的变化的脚踝大小作为膨胀指数使用以下公式:膨胀指数=(脚踝大小−主要脚踝大小来衡量)/主要脚踝大小。

2.5。炎性细胞因子的测量踝关节灌洗液

肿瘤坏死因子的水平和il - 1在踝关节灌洗液,可以分泌在MSU所致急性痛风性关节炎的过程中,通过使用商用ELISA试剂盒测定根据制造商的指示。il - 1的浓度和肿瘤坏死因子-根据标准曲线计算。

2.6。组织病理学评价和NF -免疫组织化学κB p65

滑膜组织在10%福尔马林溶液固定,在提升等级的酒精脱水,嵌在石蜡中。石蜡部分被切割的厚度5μm和苏木精和伊红染色(圆))组织学评价根据标准程序。NF -的表达B p65通过免疫组织化学方法研究分析5μ石蜡切片。简而言之,部分来自不同动物的滑膜组织组deparaffinized二甲苯和分级乙醇系列脱水。之后,组织部分微波了8分钟两次而沉浸在0.1 M柠檬酸缓冲(pH值6.0)实现抗原检索。冷却后,部分与PBS清洗三次,和内源性过氧化物酶活性被3.0%的H₂O₂在甲醇室温25分钟。与PBS三漂洗后,组织被封锁的3% BSA(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)30分钟在室温和孵化anti-NF -B p65抗体(稀释1:100)在一夜之间在4°C。在PBS洗了三次后,部分被孵化与山羊anti-rat二级抗体(美国CA Dako)在室温下50分钟。曝光后,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB),部分与苏木精复染色,增加浓度的乙醇脱水,安装与中性树胶。幻灯片是可视化光学显微镜下细胞immunopositivity的程度进行评估。

2.7。样品制备和¹H核磁共振光谱学

400年μL与200年大鼠尿液的稀释μL磷酸盐缓冲剂(0.2 mol / L Na₂HPO₄-0.2 mol / L不₂阿宝₄彻底,pH值7.4)在旋涡混合器混合,随后离心机在4°C 3500 rpm 15分钟去除沉淀物。500年μL的上层清液转移到一个5毫米NMR管和50μL D₂O W / V TSP-d(包含0.05%₄)补充道。400年μL(等离子体被转移到一个5毫米NMR管。最后,50μL磷酸盐缓冲剂(0.2 mol / L Na₂HPO₄-0.2 mol / L不₂阿宝₄,pH值7.4)和50μL D₂O喜忧参半的等离子体。D₂O为NMR谱仪(提供场频锁溶剂16]。

¹核磁共振光谱的血浆和尿液样本记录在298 K力量皇冠三世500 MHz光谱仪(BrukerBiospin Rheinstetten,德国)操作在500.13 MHz¹H的频率。血浆样本,water-suppressed Carr-Purcell-Meibom-Gill (CPMG)旋转回声脉冲序列(rd - 90°- (τ-180°-τ)acq)总旋转回声延迟(100 ms)是用来减弱信号从蛋白质和脂蛋白。128自由感应衰减(fid)被收集到64 k数据点的光谱宽度10000 Hz的放松延迟3 s和收购时间3.28秒。尿液样本,所有¹使用标准的1 H NMR光谱收集d核奥佛好塞增强光谱学——(NOESY) presaturation脉冲序列。128自由感应衰减(fid)被收集到64 k数据点。光谱获得的光谱宽度是10000 Hz,收购时间3.28秒。放松长时间设定在3 s。

2.8。数据分析

数据表示为平均值±标准偏差(SD)。统计分析进行了使用单向方差分析(方差分析)其次是事后图基的测试。值小于0.05被认为是重要的。

血浆和尿液样本的获得光谱处理傅里叶变换之前0.3赫兹谱线增宽因子。所有的光谱都是手动修正阶段和基线扭曲使用MestReNova软件(Mestrelab研究。L,西班牙圣地亚哥德孔波斯特拉)。等离子体的光谱是引用内部乳酸甲酯共振(δ1.33)。等离子体光谱分裂和信号积分是计算在0.01区间δ0.50 - -9.0。该地区的δ4.68 - -5.22被消除不完美的含水饱和度的影响。尿的光谱被引用TSP的化学位移δ0。光谱分裂和信号积分计算在整个地区0.01区间δ0.5 - -9.0。该地区的δ4.47 - -5.98的影响被消除水和尿素。最后,所有剩余的光谱区域被归一化光谱的集成总面积减少任何重要的浓度差异。

合成积分数据导入SIMCA-P 12.0软件(Umetrics、期刊、瑞典)主成分分析(PCA),偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA) mean-centering和帕累托缩放后,增加技术的重要性低离子丰度没有显著放大的噪音。例如,模型参数拟合优度,善良的预测,,被用来评估这些模型的质量。代谢物与VIP(变量重要性的投影)值≥1.0(从OPLS-DA模型)和价值观(计算出独立样本以及或Mann-Whitney以及)被视为潜在的生物标记物17]。

3所示。结果

3.1。汞对脚踝水肿的影响在密歇根州立大学Crystal-Induced痛风性关节炎大鼠

如图1(一)膨胀指数有显著增加的痛风性关节炎模型组比对照组()。HG可以显著减少膨胀指数在老鼠MSU-induced痛风性关节炎()。

3.2。汞对肿瘤坏死因子的影响和il - 1生产在踝关节灌洗液

肿瘤坏死因子的水平和il - 1在踝关节灌洗液中显著升高痛风性关节炎模型组与对照组相比(,数据1 (b)和1 (c))。HG-pretreated老鼠表现出显著减少促炎细胞因子检测生产相比,那些在痛风性关节炎模型组()。

3.3。组织病理学HG对痛风性关节炎的影响

密歇根州立大学晶体显著增加白细胞浸润在表面和深层的踝关节滑膜与对照组相比,中性粒细胞中非常丰富的混合滑膜细胞渗透。滑膜变得增生增厚,炎性细胞和血管翳形成,摧毁了底层的软骨。相比之下,预处理与HG白细胞减少流入与痛风性关节炎大鼠滑膜的轻微增生滑膜组织(图中观察到2)。

3.4。免疫组织化学NF -κB p65

与对照组相比,NF -的阳性表达B p65蛋白在细胞质和细胞核的滑膜痛风性关节炎模型组显著增加()。汞可以抑制NF -B p65蛋白引起的过度MSU晶体(图3)。

3.5。分析¹核磁共振资料

典型的¹核磁共振光谱获得等离子体和尿如图4和5。根据先前的研究[代谢物共振被分配18- - - - - -20.)和Chenomx NMR套件(Chenomx Inc .)、埃德蒙顿、AB、加拿大)。

3.6。代谢在痛风模型大鼠的摄动

PCA和PLS-DA得分图显示在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/9398435(图1和图2)。为了最大化之间的分离实验团体和关注代谢变化明显导致分类,随后OPLS-DA模型执行。如OPLS-DA评分地块(图所示6(一)和6 (b)),控制之间的分离和痛风性关节炎模型组明显,表明他们已经完全不同的代谢。模型参数如下:,,等离子体= 0.832;,,尿液。一般来说,优秀的模型得到的值,,高于0.8 [21]。此外,验证这些OPLS-DA模型的鲁棒性,200 -迭代排列进行了测试在相应PLS-DA与相同数量的组件模型OPLS-DA模型。验证情节表明原始OPLS-DA模型既不是随机的和overfitted更动和值明显低于相应的原始值(数字7(一)和7 (b))[16]。

选择根据贵宾值(VIP≥1)和OPLS-DA模型值单变量统计分析(),5和6内源性代谢物与痛风性关节炎被确定为潜在生物标志物在血浆和尿液,分别(图8和表1)。与对照组相比,β葡萄糖明显下调,而亮氨酸、赖氨酸、乳酸和谷氨酰胺明显调节等离子体的痛风性关节炎模型组。痛风性关节炎模型组还显示高尿水平的丙酮酸,琥珀酸,2-oxoglutarate,和柠檬酸,以及低水平的三甲胺N-oxide (TMAO)和hippurate与对照组相比。

3.7。HG的干预与痛风性关节炎MSU-Induced老鼠的代谢模式

OPLS-DA分数情节由NMR谱数据从大鼠血浆和尿液样本的控制,模型,和HG预处理组显示趋势恢复健康对照组HG预处理组以及一个明显的分离痛风性关节炎模型组和HG预处理组(数字6 (c)- - - - - -6 (f))。相应的验证情节(数字7 (c)- - - - - -7 (f)基于200次排列测试证明了这些OPLS-DA模型的鲁棒性。此外,所有的潜在生物标志物与MSU-induced痛风关节炎大鼠显著逆转了HG除了三甲胺N-oxide尿液中(图8和表1)。上面的结果,这也符合那些数字1- - - - - -3指出,毫无疑问,HG的预处理与痛风性关节炎大鼠诱导实质和特征代谢的变化。

4所示。讨论

痛风性关节炎炎症反应是密歇根州立大学微晶核,沉淀在关节组织从过饱和体液或摆脱现有关节存款(22]。密歇根州立大学晶体,首先确定为痛风性关节炎的病因论的代理,在18世纪,可以刺激各种类型的细胞,包括单核细胞巨噬细胞、中性粒细胞和滑膜细胞,导致快速增加生产促炎细胞因子和趋化因子(7,23,24]。炎症反应的临床症状表现为剧烈的疼痛,水肿和红斑关节。潜在的密歇根州立大学crystal-induced鼠关节痛风性关节炎的炎症作为一个有效的实验模型是由测试典型antigout药物(25,26]。这个实验模型引起的中性粒细胞显著积累类似于人类的情况。我们使用这个完善的模型探讨汞对MSU诱导的关节炎的影响晶体。结果表明,汞明显减毒的膨胀接头,减少膨胀指数与痛风性关节炎MSU-induced老鼠。此外,组织病理学观察还显示,HG减少白细胞浸润(主要是中性粒细胞)踝关节滑膜的痛风性关节炎大鼠。这些结果表明,汞可以保护动物从密歇根州立大学crystal-induced痛风性关节炎和关节损伤。

肿瘤坏死因子-和il - 1被认为是特别重要的在痛风性关节炎的发病机制27,28]。肿瘤坏死因子-和il - 1调解的快速upregulation主要为中性粒细胞内皮配体,E-selectin,为了应对注入密西根州立大学晶体到关节空间(27- - - - - -30.]。两种肿瘤坏死因子-和il - 1il - 6的强大刺激,引发产品,可以分别占明显的急性期反应(31日,32]。在这里,我们发现汞可以显著降低TNF的表达增加和il - 1在大鼠痛风性关节炎。

NF -B显然是最重要的一个监管机构的促炎基因表达上调很多肿瘤坏死因子等细胞因子的表达,il - 1,引发33]。激活NF -B是报道形成异质二聚体,通常包含两个蛋白质,p65和p50子单元。p65亚基已经证明对许多炎症基因的转录,关键活动包括粘附分子、细胞因子和趋化因子34]。此外,细胞因子刺激的NF -B,如肿瘤坏死因子-和il - 1,还可以直接激活NF -B通路,从而建立一个积极的自身调节的循环可以放大炎症反应(35]。激活NF -B可能因此痛风性关节炎的发病机制的关键一步,和抑制NF -B可能是有效的治疗痛风性关节炎。在目前的研究中,免疫组织化学分析表明汞抑制NF -活跃的表达B p65滑膜。

总的来说,这些发现表明NF -之间的正反馈循环包括TNF - B和细胞外的信号和il - 1可能会打断了HG。

一些代谢物的变化参与能量代谢中观察到这个工作。痛风性关节炎模型组显示下降葡萄糖和乳酸水平升高血清与琥珀酸含量的增加,2-oxoglutarate,柠檬酸,丙酮酸在尿与对照组相比。丙酮酸,糖酵解的产物,代表了一个重要的结点在有氧和无氧条件下碳水化合物分解代谢。柠檬酸、2-oxoglutarate和琥珀酸是三羧酸的关键中间产品(TCA)周期包括不仅葡萄糖有氧氧化,而且脂肪和氨基酸代谢的主要途径。乳酸是在厌氧条件下葡萄糖代谢的最终产物。乳酸升高被发现是一个常见的四种类型和关键生物标志物的人类关节炎包括痛风36]。因此,我们的研究结果表明糖酵解活性的加速度引起的痛风性关节炎。2-oxoglutarate的差别,对这些琥珀酸,柠檬酸,丙酮酸、乳酸和upregulation葡萄糖在场HG预处理组与模型组相比,表明HG能够有效地改善能量代谢改变。

等离子体的代谢物分析表明,亮氨酸和赖氨酸在模型大鼠显著增加,表明痛风性关节炎诱导氨基酸代谢障碍。与此同时,谷氨酰胺,谷氨酸的酰胺,提供了一种无毒氨的储存和运输形式。因此,改变模型组的谷氨酰胺水平可能反映了谷氨酰胺形成的障碍,也可以用作索引氨基酸代谢的干扰引起的痛风性关节炎。HG可以恢复亮氨酸含量的增加,赖氨酸,纠正和谷氨酰胺,展现其能力氨基酸代谢的干扰引起的痛风性关节炎。

尿TMAO和hippurate明显减少痛风性关节炎模型大鼠相对于健康对照组。减少尿排泄hippurate是急性痛风患者中观察到的37]。这些代谢物是唯一由肠道细菌代谢,痛风性关节炎表明可能与肠道微生物区系的变化有关(38]。HG有效减毒hippurate的改变,反映了其对肠道微生物群的保护行动的新陈代谢。

虽然与痛风性关节炎相关的潜在生物标志物识别和干预HG的影响显然是观察,有限制在当前的研究中。首先,由于缺乏个人草预处理组,是不可能确定每个草单独的角色。最好是设置五个动物组比较每个草的影响和未来研究的混合物。其次,观察代谢表型变化的潜在机制值得进一步研究与目标验证潜在生物标志物在人类患有痛风性关节炎和测试新的药物的功效。第三,额外的机械信息和代谢物的标记可能被使用MS-based metabonomic技术为核磁共振提供补充信息。

5。结论

总之,antigout HG的效果观察与痛风性关节炎MSU-induced老鼠,就是明证抑制关节肿胀和抑制炎症细胞浸润。这种有益的antigout效应可能是介导的,至少在某种程度上,通过抑制肿瘤坏死因子-,il - 1和NF -B p65蛋白表达在滑液和滑膜组织。此外,¹H NMR-based metabonomic方法是首先应用于本研究显示,MSU-induced痛风关节炎的病理生理过程密切相关的中断一些代谢途径包括能量代谢、氨基酸代谢、肠道微生物的新陈代谢,HG具有保护作用对这些代谢障碍。这些结果提供新的见解痛风性关节炎的发病机制的深入理解,以及发现的临床诊断和治疗的目标,也提供了进一步的证据的潜在使用HG antigout代理。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(81173194号,81403075)和广东省科技计划项目,中国(没有。2012 b060300031)。

补充材料