文摘
中药正越来越多地用于治疗癌症。我们的临床经验确定Hedyotis diffusa+黄芩barbata最常见的herb-pair(对联药用)用于治疗膀胱癌的核心。本研究旨在探讨herb-pair在膀胱癌细胞的抗肿瘤效应。结果表明,Hedyotis diffusa+黄芩barbata抑制膀胱癌细胞生长和克隆形成存在剂量依赖的相关性和时间的方式。它还通过减少Akt激活诱导细胞凋亡和减少凋亡bcl - 2蛋白的表达和mcl1。进一步的实验表明,mir - 155降低了herb-pair和microrna - 155抑制剂诱导细胞凋亡和抑制Akt激活。过度的mir - 155逆转herb-pair通过激活Akt通路诱导细胞凋亡在膀胱癌细胞系。研究结果表明,Hedyotis diffusa+黄芩barbata通过减少减少Akt激活mir - 155表达,导致细胞凋亡。它展示了潜在的机制Hedyotis diffusa+黄芩barbata的核心治疗膀胱癌。
1。背景
膀胱癌是世界范围内常见的癌症之一。大多数膀胱癌是低级的非侵入性肿瘤侵入性表型可能进步。与非侵入性膀胱癌,muscle-invasive肿瘤往往会转移到其他器官,预后很差(1]。一些治疗策略,包括化疗、放疗和radiochemotherapy相结合,应用于临床和总体生存率提高。但是,这些治疗的生存利益,和生活质量(QOL)的影响因素,如疲劳、疼痛、发病率由于淋巴切除术,化疗或放疗的副作用,更年期症状,仍相当关心的病人(2,3]。因此,小说和更有效的药物或策略需要被开发来提高膀胱癌患者的治疗和预后。
中医药(TCM)已广泛用于治疗膀胱癌患者,这被认为是有利于患者的生命质量,只有最小的副作用。据报道,中医是有效的,86.7%的病人膀胱癌症治疗可以改善免疫系统,降低化疗和放疗的不适,缓解更年期症状(4]。然而,中医在膀胱癌的抗癌效应没有得到充分的研究。
对中医处方通常是复杂的,评价中药处方的组成膀胱癌确定核心中医治疗是至关重要的。核心治疗的定义是最常用的中药,结合在一个单一的处方组成的主要部分草药处方为一个特定的障碍;因此,每个处方包括核心治疗和修改基于病人的症状和体征。的核心治疗特定疾病只能通过分析中药组合的模式识别(5- - - - - -7]。Multiherb中医处方通常包括特殊herb-pairs相互增强,援助和克制。术语“herb-pair(也称为对联药用)”指的是使用两个单草药一起通常用于治疗特定疾病为了提高功效或减少不利影响8,9]。
通过分析以人群为基础的中医处方数据库在我们医院做膀胱癌症和文献(表1)[10,11),Hedyotis diffusa+黄芩barbata被确认为最常见herb-pair用于膀胱癌的核心治疗。本研究的目的是探索抗肿瘤效应,探讨详细的herb-pair(抗肿瘤机制Hedyotis diffusa+黄芩barbata)。简化研究,主要的复合herb-pair被提取并命名为Hd-Sb作进一步调查。
小分子核糖核酸(microrna)是小非编码rna,与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程(12]。研究显示,一些黄酮类化合物,如毛地黄黄酮(13,14),柚皮苷(15),而非瑟酮(16),调节microrna的表达诱导细胞凋亡,抑制软骨肉瘤迁移,逮捕和癌症细胞生长。这些发现显示,监管的microrna的表达是一种新的机制flavonoid-induced癌细胞的生物学改变,并提供一个线索调查的可能性从herb-pair Hd-Sb提取所带来的microrna的变更Hedyotis diffusa+黄芩barbata。
在这项研究中,我们调查的抗癌效果Hedyotis diffusa+黄芩barbata在膀胱癌细胞及相关机制。我们的结果表明,Hedyotis diffusa+黄芩barbata抑制膀胱癌细胞生长和克隆形成和诱导细胞凋亡抑制mir - 155表达和Akt通路。
2。方法
2.1。细胞培养和试剂
人类膀胱癌细胞株T24 5637从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。他们两个都维护在rpmi - 1640中补充heat-inactivated 10%胎牛血清,谷氨酰胺,抗生素在37°C公司5%2。
p-Akt和Akt抗体购自细胞信号技术(美国)。抗体β肌动蛋白,bcl - 2、mcl1和裂解caspase-3,以及辣根过氧化物酶,(合)与anti-rabbit免疫球蛋白,买来Beyotime生物技术研究所(中国)。MTT买来σ(美国)。MTT、Annexin-V-FITC和π买来Beyotime生物技术研究所。mir - 155模拟和抑制剂或负核控制,以及U6, mir - 155的引物,从试剂盒(德国)。
2.2。草本提取物制备过程
干水草药提取物粉末样品(Hedyotis diffusa和黄芩barbata)从西安购买Changyue有限公司(中国西安)。草本提取物制剂是由以下步骤:首先,干粉末成分组成Hedyotis diffusa和黄芩barbata(50毫克每)溶解,混合成5毫升的毫问水由毫问合成A10水净化系统(EMD微孔、德国)在70°C下30分钟涡流每5分钟;其次,冷却至室温后,不溶性材料被离心10000 rpm的埃普多夫5424微型离心机(股份公司、德国)10分钟;第三,上层清液是由通过恢复和消毒的注射器过滤器0.22μ(美国纽约笼罩)膜;最后,草药提取物的上层清液储存在−20°C为进一步使用17,18]。
2.3。细胞生存能力分析
细胞的生存能力是衡量MTT细胞生存能力分析。1×104细胞种植在96孔板,然后用不同浓度的孵化Hd-Sb表示次。麻省理工的解决方案(0.5毫克/毫升)添加和孵化3小时。100年μL的解决方案包含10% SDS和0.01 M盐酸加入溶解晶体。吸收在570 nm(与参考波长630 nm)是衡量微型板块ELISA读者。相对细胞生存能力确定的褶皱控制。所有细胞可行性分析进行了一式三份和3独立重复实验。
2.4。集落形成试验和细胞凋亡测定
500 5637或T24细胞被播种在6-well板和对待Hd-Sb 8天。殖民地与甲醇和固定与结晶紫染色。殖民地含有超过50个细胞的数量统计和控制的褶皱。这个实验进行了一式三份和3独立重复实验。
5637或T24细胞收获与Hd-Sb治疗之后,紧随其后的是洗两次与PBS。那么细胞染色Annexin-V-FITC和π绑定缓冲在室温下30分钟。分析在BD FACSCanto流式细胞分析仪(美国)。Annexin-V和π- (Annexin-V−π−)细胞活细胞,这些细胞的比例,提出了直方图。
2.5。免疫印迹分析
细胞溶解产物分离在含有十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物膜。膜被5%的脱脂牛奶然后孵化主要抗体。洗后,膜被暴露在HRP-conjugated二级抗体。乐队是可视化和捕获使用ECL试剂(Beyotime,中国)和x光片,分别。蛋白质的像素密度量化使用ImageJ软件。
2.6。microrna的隔离和实时PCR
microrna是孤立使用microrna的纯迷你包(ComWin生物技术、中国)根据制造商的指示。miScript II RT工具包(试剂盒)是用于逆转录microrna。mir - 155的表达是由miScript SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒),使用实时PCR。mir - 155表达规范化U6基于他们的Ct值。
2.7。转染的microrna的模仿或抑制剂
5637年和T24细胞转染和mir - 155模拟(50 nM),反- mir - 155 (50 nM),或消极控制核(50 nM)使用Lipofectamine 2000转染试剂(英杰公司)根据制造商的指示。
2.8。统计和数据分析
结果意味着±SD从三个独立的实验。统计分析是由学生的以及或单向方差分析确定试验的统计学意义。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。
支持因素和信心因素用于关联规则挖掘。支持因素指的是草药coprescriptions比A + B草药处方,和信心的比例因子是coprescriptions草药A +草药B的所有处方包括草药A .总之,支持因素是所有的流行中医处方中,和最初使用的因素排除常见中医。另一方面,信心因素被用来决定每两个之间的联系中医的力量组合(herbal-pair),基于条件概率。
3所示。结果
3.1。Hd-Sb抑制膀胱癌细胞生长和克隆形成
调查Hd-Sb在膀胱癌细胞的抗癌活性,我们首先测量了Hd-Sb对细胞生长的影响。5637年和膀胱癌T24细胞治疗与不同浓度的Hd-Sb 48 h和细胞生存能力与高剂量治疗后逐渐减少Hd-Sb(图1(一))。5637个细胞更敏感Hd-Sb相比T24细胞。1毫克/毫升Hd-Sb诱导细胞生存能力的进一步降低80%后72 h(图1 (b))。Hd-Sb对细胞生长的抑制作用也证实了使用克隆形成试验。Hd-Sb显著降低5637和T24细胞的克隆形成剂量依赖性的方式(数字1 (c)和1 (d))。这些结果表明,Hd-Sb抑制膀胱癌细胞生长,以及克隆形成。
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3.2。Hd-Sb膀胱癌细胞的凋亡
我们接下来研究Hd-Sb对细胞凋亡的影响,5637年膀胱癌T24细胞。细胞治疗与1毫克/毫升和2毫克/毫升Hd-Sb 48 h和观察活细胞的显著下降(数字2(一个)和2 (b))。减少细胞凋亡中检测出T24细胞相比,5637年1毫克/毫升Hd-Sb使用时,建议少T24细胞的敏感性Hd-Sb(图2 (c))。
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3.3。Hd-Sb bcl - 2抑制,mcl1表情,和一种蛋白激酶的激活
研究膀胱癌细胞Hd-Sb诱导细胞凋亡的分子机制,我们下一个测量antiapoptosis蛋白质的表达水平和Akt激活(数字3(一个)和3 (b))。Hd-Sb抑制了一种蛋白激酶的磷酸化,而总Akt是没有改变。与此同时,mcl1的表达和bcl - 2被Hd-Sb显著降低。caspase-3 Hd-Sb也增加了激活,一个关键proapoptosis蛋白质。
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3.4。Hd-Sb通过抑制mir - 155表达诱导细胞凋亡
先前的研究已经报道,mir - 155可以调节PI3K-Akt途径抑制细胞的生存能力,我们还发现了一种蛋白激酶通路被Hd-Sb抑制。因此,我们下一步调查如果mir - 155与Hd-Sb-induced Akt的抑制。与Hd-Sb治疗后,mir - 155的表达明显减少在5637年和T24细胞(图4(一))。转染后5637年与mir - 155抑制剂和T24细胞,细胞活力和活细胞的百分比减少(数字4 (b)和4 (c))。此外,mir - 155抑制剂减少一种蛋白激酶的磷酸化,指示mir - 155的积极作用Akt通路(图4 (d))。在一起,这些发现表明,Hd-Sb可以抑制mir - 155表达和降低mir - 155凋亡在膀胱癌细胞通过负调节Akt通路。
(一)
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3.5。mir - 155抑制Hd-Sb-Induced通过增加Akt通路的激活细胞凋亡
由于mir - 155的积极作用Akt激活和细胞生存,我们接下来研究的角色在Hd-Sb-induced mir - 155细胞凋亡。mir - 155模拟显著抑制细胞活力的抑制引起Hd-Sb在5637年和T24细胞(数字5(一个)和5 (b))。同时,Hd-Sb诱导膀胱癌细胞的存活率增加mir - 155(数据5 (c)和5 (d))。此外,mir - 155在5637年增加一种蛋白激酶的磷酸化和T24细胞治疗Hd-Sb(数字5 (e)和5 (f))。这些结果表明,mir - 155可以反向Hd-Sb-induced细胞凋亡促进Akt通路的激活。
(一)
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(d)
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(f)
4所示。讨论
尽管几个批准患膀胱癌的化疗药物用于治疗病人,有毒副作用和耐药性仍在诊所的主要问题。因此,药物副作用最小和最大功效是通缉癌症治疗。Hedyotis diffusa+黄芩barbata是一种天然抗癌herb-pair少,毒性在正常细胞(4,8]。然而,在膀胱癌的详细的抗癌效果和底层机制并不广为人知。在目前的研究中,我们的研究结果证明了抑制膀胱癌细胞生长herb-pair和显示,它通过抑制细胞凋亡细胞mir - 155表达和Akt通路。
Hedyotis diffusa+黄芩barbata诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞在几个癌症研究[4,8,19- - - - - -22]。此外,它还报道,herb-pair抑制癌细胞的入侵和迁移,可以逆转白血病细胞的多药耐药性4,23- - - - - -25]。我们的研究结果表明,水溶性提取物Hd-SbHedyotis diffusa+黄芩barbata抑制细胞生长和克隆形成和诱导细胞凋亡在两个膀胱癌细胞系,和Hd-Sb诱导细胞凋亡主要通过抑制Akt激活。Akt通路发挥了积极作用在细胞生存和调节许多凋亡蛋白的表达。因此,Hd-Sb诱发膀胱癌细胞凋亡抑制Akt通路。先前的研究已经表明了这一点黄芩barbata诱导细胞凋亡的转录抑制mcl1和减少bcl - 2的表达26,27]。Downregulation抗凋亡蛋白bcl - 2和Hd-Sb mcl1的膀胱癌细胞也被观察到。此外,Hd-Sb caspase-3的激活增加导致细胞凋亡。
一种蛋白激酶信号通路由细胞因子直接或间接调控,激酶,microrna [28,29日]。mir - 155据报道针对p85积极调节Akt通路α(30.]或SH2 domain-containing肌醇5′磷酸酶1 (SHIP1) [31日,32]。p85α和SHP1 PI3K / Akt信号通路的抑制剂的抑制这些蛋白质会导致Akt通路的激活30.,32]。在这里,我们发现Hd-Sb mir - 155的表达减少,mir - 155的抑制剂抑制Akt激活,这表明Hd-Sb抑制Akt通路,至少部分通过抑制mir - 155的表达。此外,过度mir - 155逆转Hd-Sb-induced Akt激活的细胞凋亡和抑制膀胱癌,确认在Hd-Sb-induced mir - 155细胞凋亡的干预。这些结果表明Hd-Sb减少mir - 155表达,其次是Akt激活的抑制和诱导膀胱癌细胞的凋亡。
综上所述,我们的研究结果表明Hd-Sb在膀胱癌细胞的抗癌效果,Hd-Sb诱导细胞凋亡,抑制mir - 155表达和Akt通路。考虑Hd-Sb在正常细胞的毒性越少,我们的发现,活性化合物Hd-Sb提取Hedyotis diffusa+黄芩barbata将进一步调查为了找到一种新的药物治疗膀胱癌。
缩写
| 中医: | 中国传统医学 |
| Hd-Sb: | Hedyotis diffusa+黄芩barbata |
| 合: | 辣根过氧化物酶 |
| mir - 155: | 155年微 |
| 生命质量: | 的生活质量。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
郭Wen-Peng和Zhi-Ming Cai的构思和设计研究,和他们的贡献同样作为通信作者;李涛,Yip上环,质彬荣进行实验和统计分析。Wen-Peng郭和李涛锅写道。所有作者阅读和批准了期末论文。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(国家自然科学基金委)(81301739)和广东科技项目(2015 a020214002)来自中国。