Isoliquiritigenin和甘草酸对HepG2细胞诱导的氧化氧胁迫的保护作用涉及NRF2活化

抽象的

雷公藤甲素(TP)是一种活性成分Tripterygium wilfordii.钩F.，拥有广泛的生物活动。氧化应激可能在TP诱导的肝毒性中起作用。isoliquiritigenin（Isl）和甘草酸（Ga）是有效的肝保护剂。本研究的目的是研究NRF2途径是否与ISL和GA对抗TP诱导的氧化应激的保护作用有关。用ISL和Ga（5,10和20，用TP（50nm）用Tp（50nm）处理Hepg2细胞24小时（5,10和20 μm）分别为12小时和24小时。结果表明，TP治疗显着增加了ROS水平和降低的GSH水平。ISL和GA预处理均降低了ROS，同时增强了细胞内GSH含量。另外，TP治疗明显降低了NRF2的蛋白质表达及其靶基因，包括HO-1和MRP2以外的NQO1。此外，ISL和GA显示的活动作为NRF2的诱导剂，增加了HO-1，NQO1和MRP2的表达。将当前数据携带，证实ISL和Ga可以激活HepG2细胞中的NRF2抗氧化反应，增加其靶基因的表达，其可以部分地与其在TP诱导的氧化应激中的保护作用部分相关。

1.介绍

雷公藤甲素（TP），一种从广泛使用的中草药中提取的主要活性成分Tripterygium wilfordii.Hook f. (TWHF)，已被证明具有多种生物活性，包括抗炎、免疫调节和抗增殖活性[1］．然而，TP的临床应用受到其治疗窗狭窄和肝毒性、肾毒性、生殖毒性等严重毒性的限制[1］．其中，肝毒性引起了极大的关注[2]TP诱导肝毒性的可能机制与活性氧（ROS）引起的氧化应激损伤有关[2］．

核因子红细胞2相关因子2（NRF2）是对导致氧化应激的物质的细胞抗性的新出现调节因子[3.］．在生理条件下，Nrf2存在于细胞质中，与kelch样ech相关蛋白1 (Keap1)结合。在应激条件下，Nrf2从Keap1解离并易位到核中，在核中与抗氧化反应元件(ARE)结合，导致其靶基因的表达[4]这些包括许多细胞保护蛋白和药物外排转运蛋白，如血红素加氧酶1（HO-1）、NAD（P）H：醌氧化还原酶（NQO1）、谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCL）和多药耐药相关蛋白2（MRP2）[5，6］．NRF2途径被认为是重要的内源性抗氧化信号通路，并且越来越多的研究表明NRF2作为治疗靶标的潜在作用，以防止由氧化应激引起的肝损伤[7，8］．

甘草(乌拉尔甘草)是一种常用中药，含有多种生物活性化合物，包括三萜皂苷(主要是甘草酸及其生物活性代谢物甘草次酸(GA))、黄酮类化合物(如异甘草质原苷(ISL))、香豆素、生物碱、多糖和氨基酸。ISL和GA是两种主要的生物活性成分，因为它们具有有用的药理特性，如抗氧化、抗炎、保肝和抗病毒活性[9］．ISL和GA的结构如图所示1．

甘草治疗类风湿性关节炎临床常与雷公藤联用，以达到减毒增效的作用[1，10］．此外，甘草酸与TP具有协同作用，使得TP在较低的剂量下有效，TP的毒性可以降低，因为TP的毒性是剂量依赖的[11］．然而，肝脏应戊厄或仍有待阐明的细节。在我们以前的研究中，我们证明甘草可以干预NRF2途径，以诱导其靶基因，这表明使用甘草以降低药物毒性的新机制[12］．基于该观察，我们的目的是研究ISL和GA对NRF2途径的调控作用以及ISL和GA对人肝癌HepG2细胞中TP诱导的氧化应激的保护作用。

2。材料和方法

2.1。化学品和试剂

ISL(纯度> 99%)、GA(纯度> 99%)、TP(纯度≥98%)购自中国长沙On-Road生物技术有限公司。叔- 从Sigma-Aldrich（圣路易斯，Mo，USA）购买 - 余羟基喹啉（TBHQ），二甲基亚甲醚（DMSO）和甲基唑基四唑（MTT）。谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒购自南京江城生物工程研究所（南京）。反应性氧物种测定试剂盒购自Beyotime生物技术研究所（中国上海）。NRF2抗体购自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。HO-1，NQO1和MRP2抗体购自Abcam Biotechnology Co.（米尔顿，剑桥，英国）。其他化学品来自商业供应商的分析等级。

2.2。细胞培养

从湘雅细胞库(中国长沙)获得的人肝癌细胞株HepG2在添加10% (v/v)胎牛血清(中国杭州四集清)的Dulbecco Modified Eagle’s Medium (Hyclone，美国Logan)中培养，37℃，5% CO培养箱₂.将ISL、GA、tBHQ和TP溶解在DMSO中，并将储备溶液储存在−20°C。药物在使用前用培养基新鲜稀释至指定浓度。实验条件下的二甲基亚砜浓度从未超过0.1% （v/v）。

2.3。MTT测定

通过MTT测定法测定细胞活力。简而言之，在24孔组织培养板中计算并镀细胞，播种密度为2×10⁴细胞/。生长24 h后，用ISL、GA(0、5、10、20、40、60、80和100)预培养细胞μM）和TP（0,110,20,40,50,60,80，80，80，80 ,,80，80，80 ,,80，80,80,80，80，80，80,80，80,80，80,80,80，80,80，80,80，80,80，80,80，80,80，80,80，80,80，80,80,80，80,80，80,80,80，80,80,80，80,80，80,80,80，80,80,80，80,80，80,80,80,80，80,80,80，80,80，和100nm）。然后将MTT（5mg / ml）加入到每个孔中（300 μL）并孵育3-5小时，然后除去MTT和DMSO（300 μL)加到每口井中。振荡10分钟后，将每个样品转移到96孔微量滴定板上，在490 nm处记录吸光度。

2.4。测量细胞内ROS

荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS的积累。HepG2细胞以5 × 10的密度接种于96孔黑色培养皿中^3.然后分别用不同浓度的ISL、GA处理12 h和24 h。然后取出完整的培养基，用含TP (50 nM)的培养基替换24 h。用无血清培养液洗涤细胞，用DCFH-DA (10μM)在37°C下放置20分钟。在488 nm的激发波长和525 nm的发射波长下测量了荧光强度。

2．5．谷胱甘肽的检测

对于GSH含量的测量，HepG2细胞在60厘米中接种²6 × 10的菜肴⁵ cells/well. Cells were exposed to drugs as described above, after which cells were harvested and lysed by ultrasonication. Following centrifugation at 3500 ×g for 10 min at 4°C, the supernatant was maintained on ice until assayed by GSH detection Kit according to the manufacturer’s instructions.

2.6。细胞裂解物的制备和Western Blotting

用RIPa缓冲液（CW Biotech，北京，中国）裂解细胞，并将等同量的蛋白质分离10％SDS-PAGE并转移至PVDF膜。在室温下在TBST中的5％非乳牛奶中封闭1小时后，将膜在4℃下与初级抗体一起温育过夜。随后，然后在室温下与二抗孵育免疫印迹。根据制造商的协议，使用电化学发光（ECL）试剂盒（Advansta，USA）开发了膜。

2.7.统计

从实验结果报告为平均值±标准偏差（SD），并用SPSS 19.0进行。所有数据都是通过单向ANOVA进行分析的，然后进行Tukey的测试。统计显着性被接受值小于0.05。

结果

3．1.TP、ISL和GA的细胞毒性作用

采用MTT法检测HepG2细胞活性，评价药物对HepG2细胞的毒性作用。如图所示2（a）和2（b）其中，ISL对细胞活性的降低呈剂量和时间依赖性，而GA对细胞无明显的毒性作用。根据这一观察，低剂量(5、10和20μ分别选择了12小时和24小时的ISL和GA治疗，用于以下研究。暴露于所需时间后，相对细胞存活率依赖性降低（图2（c））.而且，IC_50.（24h）为41.0nm，选择24小时，选择50nm的浓度用于以下实验。

３．２．氧化应激

评估ISL和GA与TP对ROS水平的影响，并使用NRF2的经典活化剂TBHQ作为阳性对照。如图所示3（a）在50nm TP处理24小时后，观察到相对RO的增加，这可能导致ROS引起的细胞损伤的概率增加。然而，与单独的TP处理相比，ISL和Ga剂量依赖性减弱了TP诱导的ROS生产。

3.3。抗氧化活性

检测细胞内GSH含量以证实ISL和GA的抗氧化活性。24小时后TP显著降低细胞内GSH水平 h.如图所示的处理方法3 (b)．此外，这种下降通过施用ISL和GA而依赖性增强细胞内GSH含量的ISL和GA衰减。

3．4．ISL和GA对Nrf2及其靶基因表达的影响

TP明显抑制Nrf2的表达(图4）.此外，结果表明，与TP处理基团相比，ISL和GA预处理组中NRF2的蛋白质表达量依赖性增加。此外，测量包括HO-1，NQO1和MRP2，包括HO-1，NQO1和MRP2的下游基因的蛋白质表达（图5和6）.TP显著降低了HO-1和MRP2的蛋白丰度，显著提高了NQO1的表达。与tp处理组相比，ISL和GA预处理组HO-1、NQO1、MRP2表达明显增加，且呈剂量依赖性。

4.讨论

TWHF是一种着名的草药，广泛用于治疗各种疾病，包括类风湿性关节炎，肾病综合征和狼疮[1］．TP是从1972年提取和分离的主要活性成分，其药理作用已被广泛研究。但在该化合物可以达到其临床潜力之前，仍然存在重大挑战，例如涉及肝毒性和差的水溶性的严重毒性[13］．为了提高其功效并降低其毒性，TWHF经常与其他中草药组合使用，例如乌拉尔甘草菲施（甘草）和黄芪膜(费)。Bunge (14］．甘草也是多年来一直是一种常用的中药。ISL和Ga，从甘草中获得的两种主要活性成分，含有迈克尔受体，许多常见者是诱导者[15］．这α.，β- 饱和羰基已被证明以改变Keap1的特异性半胱氨酸残基，其在结构上证实了对NRF2途径的活化作用[16]此外，我们的实验室先前发现ISL（从甘草中提取的四种化合物）是HepG2中最有效的Nrf2途径诱导剂[12］．在本研究中，我们进一步表达了ISL和GA可以激活Nrf2通路，增加其靶基因的蛋白表达，并对tp诱导的HepG2细胞氧化应激具有保护作用。

NRF2途径的激活在预防异卵相关氧化损伤时发挥枢转作用[17］．在目前的研究中，发现NRF2的保护作用部分归因于其参与II期酶和III期药转运蛋白的协调诱导。HO-1催化前血红素分解代谢的第一和速率限制步骤，血红素到一氧化碳，Biliverdin和游离铁[18，19］．据说是在细胞损伤和氧化应激后抗氧化活性在抗氧化活性中发挥保护作用[20.］．NQO1是一种催化电导电代谢和内源性和外源化学品的解毒的细胞溶质类黄蛋白[21］．由调节剂（GCLM）和催化（GCLC）亚基组成的GCL是GSH的生物合成率限制酶[22］．MRP2参与化学物质向胆汁的排泄，特别是谷胱甘肽-、葡萄糖醛酸-和硫酸盐共轭代谢物[23］．所有这些都是重要的药物代谢酶和转运蛋白，并在抗氧化和毒物代谢和排泄中发挥了至关重要的作用。

许多研究包括我们的研究专注于甘草对NRF2途径的影响[12］．一项研究发现，ISL对鼠巨噬细胞中的脂多糖诱导的炎症反应具有抑制作用，其可以与抑制KeAP1相关，增加NRF2易位，并诱导UGT1A1，NQO1和HO-1的mRNA表达[24］．另一方面，GA通过BALB / C小鼠的NRF2上调延迟了顺铂诱导的肾损伤的进展[25］．而且，GA保护了CCL₄-诱导小鼠慢性肝纤维化涉及Nrf2上调[26］．虽然众多研究证明ISL和Ga可以激活NRF2途径，但目前的研究是第一个结合ISL和GA的ISL和GA与TP进行评估它们对降低TP诱导的肝毒性的影响。

Nrf2是一种抗氧化转录因子，通过与AREs相关并诱导其靶基因来抵抗氧化应激。TP抑制Nrf2通路的作用已在心脏组织和间质细胞中得到证实[27，28]因此，目前的研究假设它也是HepG2细胞中TP的靶点。值得注意的是，Nrf2、HO-1和MRP2的蛋白表达明显降低，这表明该事件可能导致抗氧化防御诱导降低（图1）5)[29］．事实上，目前的结果观察到HepG2细胞中GSH含量和抗氧化酶HO-1的蛋白表达降低，这与Nrf2激活降低有关。然而，该结果与近期报道的BALB/C小鼠中Nrf2和HO-1的表达略高于对照组的报道不一致[7］．差异可能是由于不同的治疗时间和实验对象。此外，在TP处理基团中观察到增加NQO1的蛋白质表达，表明NQO1可以由其他转录因子调节。此外，与TBHQ处理基团相比，提及HO-1，NQO1和MRP2高剂量ISL-Premroped组的蛋白质表达略高。它表明，ISL的HO-1，NQO1和MRP2表达的调节可能是通过与NRF2的独立直接的互动和其他因素（如HIF-1）进行30.，但这一点还有待阐明。

由于在体内评价中缺席，因此，由于TP激发的肝毒性更好地在动物模型而不是HepG2细胞模型中，我们的研究存在一些局限性。此外，未检测到NRF2的核积累以确认NRF2的核转位。因此，即使在NRF2 - / - 动物和NRF2的核转移中，进一步的研究将在动物和NRF2的核转移中进行进一步的研究进一步证明了ISL和GA的NRF2活化机制。

结论

集体，目前的研究表明ISL和GA有效地减弱了TP诱导的氧化应激和NRF2途径参与了保护。据我们所知，本研究是第一个显示ISL和GA激活NRF2相关的HO-1，NQO1和MRP2，并对TP诱导的肝毒性施加抗氧化防御。因此，结果为保护TP诱导的氧化应激提供了新的和有意义的洞察力。此外，该研究意味着NRF2途径可以提出新的生物学靶标，并且ISL和Ga可能是通过NRF2途径部分地预防药物诱导的肝毒性的候选者。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

基金资助:国家自然科学基金项目(no. 81202985, no. 81473411, no. 81573686);201208430206)。作者感谢马艳霞的帮助。

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