的影响桦木属翻车机叶提取物对α葡糖苷酶,谷胱甘肽水平Glucose-Induced氧化应激

文摘

b .翻车机叶是一种常见的成分在传统草药组合治疗糖尿病的欧洲东南部。本研究调查b .翻车机ethanolic和水提物作为碳水化合物水解酶的抑制剂,以及他们的能力恢复消息灵通的G2的谷胱甘肽浓度细胞受到glucose-induced氧化应激。植物化学的分析显示芦丁和槲皮素衍生物,以及绿原酸。一般来说,ethanolic提取比水提取丰富的酚类物质。此外,综合分析两种提取物的抗氧化活性(由abt和DPPH自由基清除活性,总抗氧化活性和螯合活动以及ferric-reducing抗氧化能力)已经表明,乙醇提取好游离基清除剂及其金属离子的还原剂。此外,ethanolic提取有效地增加细胞谷胱甘肽水平引起的高血糖和抑制α葡糖苷酶的活动与阿卡波糖。因此,在体外研究使用b .翻车机植物提取物已确认他们的抗糖尿病的属性。

1。介绍

慢性高血糖,可能出现由于糖尿病或代谢综合征,诱发氧化应激敏感组织因为在高浓度葡萄糖形成活性氧(ROS)。葡萄糖浓度升高,从而诱导氧化损伤,可能影响胰岛β细胞,导致胰岛素分泌障碍,进一步加重高血糖的地位。活性氧引起损伤和损伤造成的伤害经典的二次目标函数的糖尿病,如血管、肾脏、神经、和眼睛1),导致心血管疾病以及糖尿病微血管并发症,包括肾病、视网膜病变、神经病变(2]。此外,最近的研究提供了证据表明,胰岛素抵抗和胰岛素信号受损,典型的2型糖尿病,可能是一个因素的发展老年痴呆症和其他神经系统疾病(3]。

Endo -或外源性抗氧化剂发挥重要作用在缓解氧化应激及其后果。最重要的一个细胞非蛋白抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)。谷胱甘肽能保护细胞通过清除氧和氮自由基,减少H₂O₂。谷胱甘肽也很重要在维护其他非酶的抗氧化剂的浓度。例如,氧化维生素C可以恢复的减少了酶促反应的形式使用谷胱甘肽作为底物(4]。除了有助于保护细胞免受氧化损伤、谷胱甘肽解毒作用外源性物质和调节redox-sensitive蛋白质的功能5]。然而,在增加氧化剂、生产细胞内谷胱甘肽的水平可以耗尽。因此,在这样的条件下,持续和快速的补充谷胱甘肽是必需的,这是通过减少氧化谷胱甘肽及其新创合成。然而,高浓度的葡萄糖会导致糖化glutamate-cysteine连接酶,谷胱甘肽生物合成途径的第一个酶,从而导致进一步减少谷胱甘肽水平(6]。有在体外和临床证据表明,异常低水平的细胞内谷胱甘肽可能导致β细胞功能障碍和长期糖尿病并发症的发病机制。因此,兴趣了谷胱甘肽的潜在治疗修改状态的治疗糖尿病。例如,改变了谷胱甘肽状态可以通过使用天然抗氧化剂如硫辛酸(7)、姜黄素或萝卜硫素(4]。这种方法可用于保健品的发展与潜在治疗代谢紊乱和糖尿病(6]。

除了他们对谷胱甘肽含量的影响,自然可以发挥其他生物活性物质,可以有利于治疗糖尿病及其并发症。例如,由于其抗氧化活性,直接或通过他们的影响内源性抗氧化剂,可以保护细胞的目标,因此最容易的组织糖尿病并发症(8]。除此之外,他们可以影响参与碳水化合物代谢的酶,如α淀粉酶和α葡糖苷酶,从而阻碍了餐后葡萄糖浓度增加。阿尔法淀粉酶是唾液、胰液分泌的一种酶催化淀粉水解的较小的寡糖的混合物,然后降解为葡萄糖α葡糖苷酶,酶位于小肠粘膜刷状缘。阿尔法淀粉酶和α葡糖苷酶抑制剂可以帮助发展的化合物用于治疗糖尿病、肥胖和高血压。药用植物可能构成的良好来源α淀粉酶和α葡糖苷酶抑制剂(9,10]。

桦木属翻车机罗斯(桦木科)俗称黄桦,树原产于欧洲和亚洲。在东欧的传统医学,它是用作利尿剂,特别是膀胱炎的病例,以及治疗风湿病和关节炎的疾病。最近的研究表明,其利尿潜力可能源于其endopeptidases-inhibiting属性,虽然黄嘌呤氧化酶抑制属性可能负责其使用在痛风治疗(11,12]。此外,b .翻车机叶提取物可以抑制炎性淋巴细胞的生长和细胞分裂12),以及抑制酪氨酸酶,酶催化黑色素生物合成的第一阶段。白桦树叶提取物也显示抗氧化剂和金属螯合性能(13]。

除了众所周知的使用利尿剂和抗炎药,b .翻车机叶通常是作为草药混合物的一部分用于治疗糖尿病的欧洲东南部的传统医学。这项工作的目的是评估的适用性研究使用的抑制效应b .翻车机提取物对α淀粉酶和α葡糖苷酶,以及评估他们的抗氧化剂,谷胱甘肽在高血糖的保护活动的条件。额外的目标是确定提取的最佳溶剂的活跃的原则b .翻车机叶子。我们所知,这是第一次的桦树提取辅助治疗糖尿病的潜在用途已被调查。

2。材料和方法

2.1。植物材料和化学品

b .翻车机树叶在市场买了草药医生办公室Gornje Kolibe,波斯尼亚和黑塞哥维那。标本鉴定和代金券沉积在生药学、学院制药和生物化学、萨格勒布,克罗地亚的萨格勒布大学。类黄酮和酚酸的标准从Sigma-Aldrich购买(美国)。他们的纯度是97%或更高。甲醇的高效液相色谱法。其他试剂和化学试剂均为分析纯。测量进行了使用Stat传真3200(感知技术,美国)标和T70 + UV / Vis光谱仪(PG仪器有限公司GB)。

2.2。准备的提取

在提取之前,干的叶子b .翻车机研磨和850年通过筛子吗μ筛孔尺寸。植物原料粉(2 g)暂停20毫升的适当的溶剂(80%乙醇或水)在50毫升锥形烧瓶。提取进行超声波浴(Bandelin SONOREX®数字10 P DK 156个基点,德国)在超声破碎法功率720 W, 35赫兹的频率为30分钟80°C。烧瓶内的内容是离心机在3400 rpm(30分钟)。上层清液收集和蒸发在30°C rotavapor (ethanolic提取)或冻干(水提物)。

2.3。光度法决定总酚类、类黄酮和酚酸

提取物中总酚(TP)内容由修改Folin-Ciocalteu比色法(14),而总类黄酮(TF)内容被螯合氯化铝的评估15]。总酚酸(TPA)使用亚硝酸盐测定钼酸试剂(16]。决定,被用作前面描述的修改(4]。分析物质提取的内容从校准曲线表示为毫克/毫升为标准和记录表示为标准的等价物。即TP、TF, TPA表示为没食子酸、槲皮素,分别和咖啡酸等价物(表2)。

2.4。高效液相色谱法分析酚酸和类黄酮

测定酚类成分,也准备了酚酸和类黄酮浓度为0.2毫克/毫升的甲醇提取物的准备在2毫克/毫升的浓度。水解,在400毫升的相应的提取方案μL 6 M盐酸是补充道。获得的混合物在水浴加热2小时,然后过滤5毫升容量瓶。滤纸的沉淀与甲醇和洗瓶内容添加到卷。酚酸和类黄酮是量化使用高效液相色谱仪器(美国安捷伦科技安捷伦1200系列)配备一个爸爸autosampler探测器。Zorbax Eclipse XDB-C18列(5μm, 12.5毫米×4.6毫米,美国安捷伦)和Zorbax Eclipse XDB-C18警卫队柱用于分离。在注射前,标准和提取的解决方案是通过0.45过滤μm聚四氟乙烯注射器过滤器。混合的水、甲醇和甲酸在比例93:5:2 (v v: v)和3:95:2 (v v: v)被用作溶剂A和B,分别。分离了40°C使用以下协议:0分钟20% B, B 10分钟40%,35分钟50%流量为1.0毫升/分钟。应用体积是10μL或80μL nonhydrolyzed或水解样品,分别。高峰作业和识别是基于对比在样品色谱峰的保留时间和紫外光谱与标准。组件是根据各自的量化标准校准曲线在270 nm(芦丁、杨梅酮、鞣花酸、原儿茶酸)或290海里(绿原酸)。检测极限(LOD)和量化的限制(定量限)测定根据[17)(表1)。单个酚类化合物的含量(表中给出3)。

2.5。abt和DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除活性(DPPH RSA)和abt自由基清除能力(abt RSA)中描述被评价为18]和[19),分别。反应在室温下进行。适当的自由基溶液浓度,提取的解决方案是补充道。孵化后,吸光度是阅读在545 nm和734 nm或abt DPPH自由基,分别。RSA是根据方程来计算的,在那里的吸光度-控制(免费的解决方案没有提取)和是包含提取物的自由基溶液的吸光度。提取浓度在50%的自由基出现在解决方案(IC₅₀DPPH RSA和集成电路₅₀abt RSA)使用回归分析计算。叔丁基羟基茴香醚和Trolox被用作标准抗氧化剂对DPPH RSA和abt RSA,分别。

2.6。菲^{2 +}螯合活动

螯合活动(ChA)的调查对亚铁离子物质研究中描述(18]。一个整除的methanolic提取解决方案(150μFeCl L), 0.25毫米₂解决方案(50μL)补充道。5分钟后,反应是由增加1.0毫米ferrozine解决方案(100μL)。10分钟后吸光度在545海里被记录在室温下孵化。反应混合物含有甲醇(150μL)而不是提取解决方案作为控制。使用EDTA螯合标准。ChA计算使用(吸光度的消极的控制,例如,空白的解决方案没有测试化合物)(物质溶液的吸光度)。使用回归分析、螯合活动计算IC₅₀ChA,浓度50%的铁螯合物^{2 +}离子。

2.7。总抗氧化活性

总抗氧化活性(TAA)的提取使用分光光度计测定(20.]。简单地说,一个整除的0.1毫升的样品溶液结合1毫升的试剂溶液(0.6 M硫酸,28 mM磷酸钠,钼酸铵和4毫米)。管受限和孵化一个热块90分钟的95°C。样品冷却到室温后,吸光度测量在695海里。抗氧化活性的校准曲线计算基于抗坏血酸和抗坏血酸当量(AAE)表示为毫克每克干重。

2.8。Ferric-Reducing抗氧化能力

Ferric-reducing抗氧化能力(收紧)评估根据(21]。新鲜收紧工作准备的解决方案是混合25毫升醋酸缓冲(300毫米),2.5毫升的2,4,6-tripyridyl-2-triazine解决方案(在40毫米HCl 10毫米),和2.5毫升氯化铁溶液(20毫米)。0.1毫升的混合物提取的解决方案是添加到0.9毫升收紧的解决方案,在黑暗中在室温下30分钟。吸光度是读spectrophotometrically 593海里。Trolox收紧计算基于校正曲线和表达为毫克Trolox相当于每克干重(TE)。

2.9。的决心α葡糖苷酶抑制活性

抑制α葡糖苷酶测定(早些时候报道22)与轻微的修改。总之,100年μL的测试样品溶解在10% DMSO(4、2、1, 0.5毫克/毫升溶液)与50孵化μL (α葡糖苷酶从酿酒酵母I型(美国Sigma-Aldrich) (1.0 U /毫升溶解在0.1磷酸盐缓冲剂,pH值6.8)10分钟37°C。后来,在反应混合物,50μL衬底(5毫米p-nitrophenyl -α-D-glucopyranoside准备在同一个缓冲区)添加和释放的p硝基酚为405 nm spectrophotometrically 5分钟后孵化。单个空格为测试样本准备正确的背景吸收衬底被替换为50μL的缓冲区。控制样品含有100μL 10% DMSO溶液代替测试样品。酶抑制的百分比计算方程,在那里吸光度的没有测试化合物(提取)和混合代表包含提取样品的吸光度。作为标准参考,阿卡波糖。应用回归分析方便,IC₅₀(测试样本必须抑制浓度50%酶的活动)。

2.10。阿尔法淀粉酶抑制试验

根据执行分析(23]。提取(25μ在不同的浓度和25 L)μL(20毫米磷酸盐缓冲剂(pH值6.9)包含猪α淀粉酶(0.5毫克/毫升)在25°C preincubated 10分钟。其次是25μL 0.5%的可溶性淀粉溶液在相同的缓冲区。反应混合物在25°C孵化反应10分钟,然后停止了50μL 96毫米的3.5 -dinitrosalicylic酸试剂颜色。后来,微型板块是孵化在沸水浴5分钟,冷却到室温。在540纳米吸光度测定,酶抑制率计算如上所述。控制代表100%酶活性被取代提取10% DMSO准备。阿卡波糖是一个标准的参考。提取需要的浓度抑制酶的活性50% (IC₅₀)是由回归分析计算。

2.11。细胞培养和治疗

人类高加索人肝细胞癌(消息灵通的G2)细胞从欧洲收集细胞培养(ECACC)保持在一个孵化器在37°C调湿大气的5%股份₂在MEM培养基培养,补充10% (v / v)胎牛血清(的边后卫),20个国际单位/毫升青霉素和20μ克/毫升链霉素。媒介是每周更新两次。实验,细胞被播种到six-well盘子。盘子被改为FBS-free介质试验前24小时。感应的高血糖的情况下,消息灵通的G2在MEM细胞培养24小时,补充了额外的20毫米葡萄糖(积极的控制,D)。来决定的影响b .翻车机高血糖的提取物对谷胱甘肽含量条件下,消息灵通的G2细胞治疗24 h和20毫米葡萄糖+ 0.5毫克/毫升(d - 0.5), 0.1毫克/毫升(d - 0.1),或0.05毫克/毫升(d - 0.05)b .翻车机提取物。负控制细胞(C)只保持在MEM培养基中含有葡萄糖5.56毫米。

2.12。谷胱甘肽含量减少(谷胱甘肽)

谷胱甘肽的浓度是确定消息灵通的G2细胞溶解产物处理20毫米葡萄糖溶液和不同浓度的提取。使用分光光度测定谷胱甘肽水平量化,基于2,2-dithiobisnitrobenzoic酸(DTNB或Ellman试剂)在37°C (24]。一个黄色的生产彩色5-thio-2-nitrobenzoic酸以405海里。谷胱甘肽水平治疗细胞比较正面和负面的控制细胞。

2.13。统计分析

实验进行了一式三份。结果表示为平均数±标准差。统计比较是用单向方差分析,其次是Dunnett事后检验和t以及多个比较之间的控制和提取,分别。值< 0.05被认为是具有统计学意义。统计分析使用SAS软件中的JMP version 6 (SAS研究所卡里、数控、美国)。

3所示。结果与讨论

3.1。分析总酚类、类黄酮和酚酸

化学溶剂干扰不同的天然化合物的定性和定量不同提取物。这些差异不可避免地反映在抗氧化剂和其他生物中提取的属性(9]。因此,为了研究其抗糖尿病的活动,b .翻车机叶提取使用两种最常见的和相对无毒溶剂:水和乙醇。酚类化合物的内容准备的提取提出了表2。ethanolic总酚类和黄酮类化合物的提取量大约是双重的高于在水提取黄酮类化合物的量。酚酸的数量,另一方面,较高的水提取物。这是符合更高的亲油性类黄酮酚酸相比,这使得他们相对更好的溶于非极性溶剂,乙醇。

高效液相色谱的植物化学成分分析(图1、表3)已经确认的主要酚类化合物b .翻车机提取是类黄酮芦丁,而其他组件出现在较低的金额。类似于总类黄酮芦丁的含量比水提物在ethanolic高出两倍。在酚酸中,只有绿原酸被发现。

先前的研究已经发现的黄酮类化合物b .翻车机叶衍生品的杨梅酮、槲皮素、山柰酚、芹黄素,毛地黄黄酮。在这些研究中,槲皮素衍生物中含量最丰富的绿原酸在场时的最高浓度p香豆酸衍生品(25]。在提取准备在这项研究中,然而,紫外光谱分析表明,除了芦丁,色谱图中的其他著名的山峰(如峰值为9.49分钟,13.11,和14.38分钟)也属于槲皮素衍生物。这是证实了提取物的分析进行酸水解。两种水解提取含有槲皮素数量非常低的杨梅酮在场时只有在水解ethanolic提取物(杨梅酮太低量化)的数量。除了黄酮、原儿茶酸、黄酮醇降解的产物(26),也发现,以及少量的鞣花酸。其他使用的类黄酮素糖苷配基的存在和酚酸标准(黄芩甙元、白杨素hesperetin,木樨草素、山柰酚、肉桂、咖啡、绿原,阿魏,rosmarinic, syringic、香草酸、芥子酸)中没有检测到提取物。

提出的三个主要机制的抗氧化剂可能发挥保护作用是氢原子转移,单电子转移,和金属螯合(27]。这些机制的比例在草本提取物总抗氧化活性取决于不同的影响。因此,推荐使用一个以上的方法给出一个综合分析的复杂的混合物,比如天然提取物的抗氧化效率。在提出研究中,进行了以下五个化验:总抗氧化活性,abt和DPPH自由基清除实验,螯合和ferric-reducing抗氧化能力测定。丁基羟基茴香醚,抗坏血酸、EDTA和Trolox,抗氧化剂和离子螯合剂,通常用于食品和医药行业,被用作积极控制(28]。

比较抗氧化活动准备的提取提出了表4。彻底清除DPPH自由基能力两者之间没有统计学差异提取,但ethanolic提取更好的abt游离基清除剂。然而,明显降低集成电路如图所示₅₀值,水提取物被证明是更好的铁^{3 +}比ethanolic提取离子的金属离子螯合剂。另一方面,TAA收紧,方法是基于减少化学物种的属性、高ethanolic提取。由于酚类化合物的主要化合物被认为是导致草药提取物的抗氧化活动(29日,30.),更好的ethanolic提取物抗氧化活性并不奇怪。

准备的b .翻车机叶提取物对他们进行测试α葡糖苷酶和α淀粉酶抑制特性。而提取并没有显示任何抑制活动的方向α淀粉酶,α葡糖苷酶活动非常好,与标准的活动,抗糖尿病药阿卡波糖(图2)。Ethanolic提取的集成电路₅₀价值没有统计学上不同于阿卡波糖(表尤为活跃4)。为了确定负责观察到的植物化学物质α葡糖苷酶抑制活性,芸香苷和绿原酸的活性也受到考验。这是以前报道,绿原酸可能在大鼠通过抑制抑制餐后高血糖α葡糖苷酶(31日]。然而,在浓度出现在活跃的提取在这项研究中,芸香苷和绿原酸不可见α葡糖苷酶抑制活性。如果我们比较这一研究获得的结果的集成电路₅₀值所需的芦丁和咖啡酸抑制α在先前发表的作品[葡糖苷酶32,33),我们可以观察到这些酚类化合物的浓度在目前研究显示显著的抑制可能是不够的潜力。然而,它已经发现,芸香苷和绿原酸显示显著降低反α葡糖苷酶活动然后nonconjugated同行,分别为槲皮素和咖啡酸(32,33]。此外,看来,糖基化水平负相关的抑制活动槲皮素衍生品(32]。人们已经发现,植物物质的组合可能有添加剂的影响α葡糖苷酶抑制(34,35]。因此,我们可以得出这样的结论:槲皮素衍生品和其他酚类化合物被发现在调查提取可能发挥重要的添加剂,甚至在观察到的协同作用α葡糖苷酶抑制活性。除了酚类物质,b .翻车机叶还含有三萜烯化合物、桦木醇、桦木酸、齐墩果酸、羽扇豆醇(36]。它已经表明,齐墩果酸和相关五环三萜可能抑制α葡糖苷酶在体外在一个没有竞争力的,与微摩尔的IC时尚存在剂量依赖的相关性₅₀值(37]。因此,它是可能的,这些三萜大大有助于观察到抑制活动。

高血糖的后果之一是生产ROS升高导致明显的氧化应激的状态(1,2]。尽管b .翻车机提取先前已被证明具有显著的抗氧化潜力在体外化学模型(38),我们所知,桦树的叶子提取物没有被调查在活的有机体内也不在体外糖尿病的细胞模型。另一方面,抗氧化剂和芦丁的保护作用,这是最突出的酚类化合物的提取调查在我们的研究中,已经好了在活的有机体内模型。例如,芦丁可以提高抗氧化防御系统对铁overload-induced肝脏氧化应激大鼠。这样的活动可能与抗氧化剂和金属螯合活动(39]。此外,芦丁被证明具有神经保护和心血管40)在体外实验影响糖尿病模型(41),以及许多其他效果在改善糖尿病并发症(这可能是有益的42]。绿原酸,另一个酚类化合物调查中提取,有众所周知的抗糖尿病的性质已被广泛审查(31日),与咖啡消费的观察到糖尿病的保护(43]。一些活动可能与抗氧化机制由于绿原酸可能改善氧化应激在体外糖尿病肾病大鼠肾损伤(44]。因此,我们旨在调查如果b .翻车机叶提取物能改善后果高血糖诱导的氧化应激在糖尿病的细胞模型。

糖尿病导致的氧化应激水平下降的最重要的一个身体的抗氧化剂,谷胱甘肽(7,45]。为了评估的影响b .翻车机叶提取谷胱甘肽浓度,消息灵通的G2细胞处理高浓度的葡萄糖。谷胱甘肽是量化使用开曼的谷胱甘肽分析工具。水和ethanolic提取的能力来减少氧化应激在glucose-treated消息灵通的G2细胞研究(图3)。glucose-treated细胞(负控制)的谷胱甘肽水平明显低于在参与细胞作为确认葡萄糖产生了氧化应激。在实验中使用的浓度,提取减少氧化应激,所看到的显著增加谷胱甘肽的水平相比,消极的控制。除此之外,ethanolic提取物能增加谷胱甘肽浓度与正常相比控制。这个发现和观察到的优秀活动TAA, RP,收紧试验,测试基于样本的能力降低,可能表明ethanolic提取的电子基性质主要是负责谷胱甘肽再生。由于芦丁和绿原酸的抗氧化性能,已被记录在大量研究[39,44,46),它可能会得出结论,观察活动的一个重要组成部分可以归因于这些抗氧化剂的存在。

4所示。结论

b .翻车机提取物具有明显的抗氧化和抗糖尿病的性质,证明了一些抗氧化剂化验,能增加细胞内谷胱甘肽浓度,抑制α葡糖苷酶。溶剂的选择可以显著影响生物性能的草药提取物。在这项研究中,乙醇能够有效地提取多或b .翻车机叶生物活性原则产生较高含量的酚类抗氧化剂的提取和更好α葡糖苷酶抑制谷胱甘肽和再生性能。一些观察到的生物属性可以归因于芦丁,自然类黄酮是主要的调查ethanolic提取酚组成部分。未来在体外和在活的有机体内研究需要进一步研究糖尿病的潜力b .翻车机乙醇提取物及其作用机理。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

萨格勒布大学的金融支持是和善的承认。

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