成分分析和抑制作用苹婆属lychnophora对生物膜的形成变形链球菌

文摘

Pangdahai是一种中国传统的药物,特别是形容中国药典的种子苹婆属lychnophora拱腰。在这里,我们分开美国lychnophora外壳和内核、营养内容分析和调查的抑制效应美国lychnophora乙醇提取的生龋齿的属性变形链球菌,重要的龋齿的细菌和菌斑的形成。乙醇提取美国lychnophora显示抗菌活性存在剂量依赖的相关性变异链球菌与显著的抑制浓度高于0.01毫克/毫升与对照组相比)。此外,生物膜的形成是下降了美国lychnophora在浓度> 0.03毫克/毫升,而细菌生存在高剂量依赖性降低浓度(0.04,0.08,0.16,和0.32毫克/毫升)。初步乙醇提取的植物化学的分析揭示了一个强大的生物碱的存在,酚苷,和肽而存在的类固醇、萜类、黄酮类、有机酸很低。的美国lychnophora皮的水分和灰分含量高于内核,而皮的蛋白质和脂肪含量较低(比的内核)。这些结果表明,美国lychnophora具有抗菌效果对吗变异链球菌可能相关的生物碱、酚苷,和肽的主要组件美国lychnophora。

1。介绍

中国传统医学Pangdahai由的干燥成熟种子苹婆属lychnophora拱腰,属于梧桐科家族的落叶树。树主要生长在热带地区包括越南、印度、马来西亚、泰国、印度尼西亚、Gwangdong,海南岛在中国(1]。不成熟的种子椭圆形,类似于一个橄榄而成熟种子的长度和宽度近似2 - 2.5和1.2 - -1.7厘米,分别重约2 g(图1)。种子的外层很薄而脆,当浸泡在水中暴露其内部与海绵粘液丰富的一致性(黄棕色2]。

在中医的字典,美国lychnophora是无味的,有粘性的一致性咀嚼时的长度,在本质上是酷还是冷的,味道微甜或苦乐参半的。它已经被用于治疗咽炎,便秘,咳嗽在大多数情况下(3,4]。在中国,美国lychnophora通常煮或浸泡在热水和消费饮料治疗喉咙痛或胀气。最近的报告表明神经保护作用[4]。然而,anticariogenic或抗菌活性的影响美国lychnophora不是众所周知的。外的主要成分是bassorin种子层以及半乳糖和戊糖(主要是阿拉伯糖),15.06%和24.7%,分别在皮(5]。

龋齿是最常见的慢性生态牙科疾病,被称为蛀牙或蛀牙。是一种传染性疾病,很难组织等牙齿的牙釉质,象牙质和牙骨质逐渐和不可逆转地破坏6,7]。龋齿是由某些类型的口服引起的链球菌包括革兰氏阳性变形链球菌,这是最重要的生龋齿的细菌,这种疾病的主要病原体8,9]。变异链球菌代谢消耗的食物中包含的碳水化合物,产生有机酸、启动蛀牙釉质。尽管氟化合物被用来抑制龋齿的形成,高水平是细胞毒性10]。因此,开发新的和安全代理,防止龋齿的形成是很重要的。天然产物是好的候选药物发现包括anticariogenic生龋齿的代理。在目前的研究中,我们表演美国lychnophora抑制经济增长以及酸生产和生物膜的形成变异链球菌。这是第一个报告anticariogenic效应美国lychnophora。此外,我们分析了植物化学物质的成分和营养成分美国lychnophora。

2。材料和方法

2.1。材料

脑心浸液肉汤(BHI)从Difco购买实验室(美国底特律,MI)。葡萄糖和二甲亚砜(DMSO)获得Sigma-Aldrich有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。变形链球菌写明ATCC 25175年从美国购买类型文化集合(写明ATCC,罗克维尔市,医学博士,美国)。

2.2。植物材料和提取

Pangdahai东方药店获得Dae在野阵营牦牛Kuk (Iksan、韩国)和验证了Young-Hoi金正日在环境和生物科学学院,全北国立大学(韩国全州)。凭证标本(18-03-12)上的标本在Wonkwang大学口腔生物化学部门。外壳和内核的美国lychnophora植物材料分离之前使用。乙醇提取制备使用300克的植物材料,这是放置在一个3000毫升瓶和3000毫升的70%乙醇浸渍在室温下72 h。乙醇提取样本然后干燥,称重,并存储在−20°C和收益率为10.68 g (3.56%)。乙醇提取物溶解在DMSO获得实验所需的股票的解决方案。最后DMSO浓度调整到0.1% (v / v)在文化系统中,没有干扰测试,而对照组中含有0.1% DMSO溶液处理。

2.3。抑制生长和体内酸性物质的产生

细菌生长抑制决心使用前面描述的修改方法(11]。细胞生长评估了在管37°C 0.95毫升的BHI含有不同浓度的肉汤美国lychnophora提取物。管注射0.05毫升的一夜的文化变异链球菌生长在BHI肉汤的最终密度5×10⁵菌落(CFU) /毫升和孵化37°C。24小时孵化后,最低抑制浓度(MIC),定义为最低浓度,抑制的明显增长变异链球菌隔夜孵化后,决心通过测量光密度在550 nm (OD)增长的媒体使用酶联免疫吸附试验(ELISA)板读者(分子设备有限公司、森尼维耳市、钙、美国)。此外,文化传媒的pH值确定用酸度计(汉娜仪器、菲律宾)。每个浓度的测量进行了一式三份测试提取和氟化钠(氟化钠,1%)作为一个积极的控制。

2.4。生物膜试验

本研究中使用的生物膜试验是基于前面描述的方法(12]。美国lychnophora提取了BHI汤含有1%葡萄糖在35毫米聚苯乙烯菜或24-well板块(Nunc,哥本哈根,丹麦)。培养基被接种种子耐甲氧西林的文化变异链球菌在最后的5×10的密度⁵CFU /毫升。在37°C,培养48 h后上层清液是完全消除,菜肴,井或井包含复合树脂牙与蒸馏水冲洗。生物膜形成的井的数量是衡量以0.1%的红色染料染色,其次是治疗30%醋酸释放的绑定红色染料染色的细胞,和溶液的吸光度测量在530海里。形成的生物膜表面的树脂牙也沾0.1%红色染料和拍照。

2.5。扫描电子显微镜(SEM)

35毫米聚苯乙烯的生物膜形成菜肴也检查使用扫描电子显微镜(SEM)使用先前描述的修改方法(13]。盘子上的生物膜的形成与蒸馏水冲洗和2.5%的戊二醛固定0.1钠甲次砷酸盐缓冲(pH值7.2)在4°C 24 h。与乙醇分级浓度连续脱水后(60、70、80、90、95,和100%),样本冻干,sputter-coated用金(108年溅射涂布机,Cressington科学仪器有限公司,沃特福德,英格兰,英国),并使用扫描电子显微镜观察(地产- 6360扫描电镜,JEOL,东京,日本)。

2.6。共焦激光扫描显微镜

的杀菌效果美国lychnophora提取是决定使用共焦激光扫描显微镜。的变异链球菌文化(BHI)和额外的BHI稀释介质的密度约1×10⁷CFU /毫升,然后处理高浓度(8 - 64毫克/毫升)美国lychnophora在有氧条件下提取在37°C。30分钟后孵化,细菌都洗PBS和染色使用现场/死BacLight细菌生存工具包(分子探针,尤金,或者美国)根据制造商的指示,15分钟。细菌染色观察使用共焦激光扫描显微镜(LSM 510、蔡司、德国)。这个方法是基于两个核酸染色:绿色荧光SYTO 9和红色荧光propidium碘渍,这有不同的穿透能力健康的活细菌和细菌细胞和标签损坏膜,分别。

2.7。植物化学的筛选

的乙醇提取物美国lychnophora分析了利用植物化学的测试(14]。酚醛塑料,生物碱苷、肽、类黄酮,类固醇,并使用Mayer有机酸测定试剂,氯化铁试剂,莫氏利施试验,双缩脲试剂、Mg-HCl试剂、Liebermann-Burchard试剂,分别和硝酸银试剂。

2.8。分析化验

直接组件(水分、蛋白质、脂肪、碳水化合物和灰)和矿物的内容美国lychnophora提取进行了分析使用官方分析化学家协会(采用AOAC公认的)方法(15]。下面分析的直接营养的决心。水分损失决心揭露后提取样品温度为110°C 5 h强制通风烤箱。总氮测定采用凯氏法与半自动氮分析仪。灰分是由提取的醚溶性材料与石油醚索氏提取器提取样本8 h。然后,2 g的样本被烧焦的,烧成灰烬恒定重量在550°C 5 h低沉炉。碳水化合物含量计算使用新鲜weight-derived数据,根据以下方程:

2.9。矿物内容分析

的美国lychnophora提取内容的钙、铁、钠、钾、镁、和锌进行了分析使用一个原子吸收分光光度计,P含量用分光光度计测定。

2.10。膳食纤维分析

的美国lychnophora外壳和内核提取分别分析他们的不溶性膳食纤维(IDF),可溶性膳食纤维(SDF)和总膳食纤维(TDF)使用相关采用AOAC公认的方法15]。

2.11。统计分析

所有的实验进行了一式三份和数据分析使用社会科学统计软件包(SPSS) 18.0版本程序。数据表示为平均值±标准错误(SE)。之间的差异的实验和对照组学生的评价以及和值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。抑制细菌生长和体内酸性物质的产生

的乙醇提取物美国lychnophora显示明显的剂量依赖性抗菌活性变异链球菌浓度的0.01,0.02,0.03和0.04毫克/毫升(图2)。此外,与对照组相比,抑制效果观察extract-treated组在浓度显著高于0.01毫克/毫升(),而0.1%氟化钠积极控制表现出抗菌活性。比较extract-treated和控制组织的浓度测试(0.01,0.02,0.03,和0.04毫克/毫升)显示抗菌效果的11.02,31.78,77.54和95.76%,分别。

的抑制作用美国lychnophora乙醇提取对酸性物质的产生变异链球菌由提取的影响,pH值,如表所示1。pH值明显降低在未经治疗的对照组(pH),但这种影响是显著地抑制阳性对照组(0.1%氟化钠,pH值)。美国lychnophora提取(0.01 - -0.04毫克/毫升)有明显抑制作用。这些结果表明,乙醇提取的美国lychnophora可以抑制有机酸生产变异链球菌。

3.2。的抑制作用美国lychnophora对生物膜的形成

的抑制效应的提取美国lychnophora在生物膜的形成变异链球菌评估使用红色染料染色图所示3。的提取美国lychnophora(0.01 - -0.04毫克/毫升)抑制的形成变异链球菌生物膜,也被积极的控制(0.1%氟化钠)。此外,美国lychnophora提取诱发显著的颜色强度的变化存在剂量依赖的相关性(OD)彩色生物膜。

扫描电镜照片(图4使用红色染料染色)说明获得的结果。变异链球菌高度和聚合的聚苯乙烯表面35毫米菜肴和对照组可见生物膜形成。然而,生物膜的形成是在下降美国lychnophora在浓度高于0.03毫克/毫升和积极控制的存在(0.1%氟化钠)。

另外,我们观察到生物膜的形成表面的树脂牙红色染料染色(图5)。的提取美国lychnophora(0.01 - -0.04毫克/毫升)抑制生物膜的形成树脂表面的牙齿,和特别有效的抑制浓度高于0.03毫克/毫升。

3.3。杀菌的效果美国lychnophora对变异链球菌

的杀菌效果美国lychnophora显示在图6。的杀菌效果美国lychnophora是由染色培养细菌生活/死BacLight细菌生存工具包共焦激光扫描显微镜紧随其后。在高浓度细菌生存能力下降(0.04,0.08,0.16,和0.32毫克/毫升)美国lychnophora提取,存在剂量依赖的相关性。这一结果表明,高浓度的美国lychnophora提取可以杀菌变异链球菌。

3.4。植物化学的筛选

乙醇提取的植物化学的测试结果如表所示2。初步的植物化学的分析是进行乙醇提取。乙醇提取显示一个强大的生物碱,酚苷,和肽而存在的类固醇,萜类、黄酮类、有机酸很低。

3.5。近似构成

的直接成分分析的结果美国lychnophora提取表所示3。水分(11.97%±0.19)和火山灰(5.38%±0.10)的外壳均高于水分(7.83%±0.05)和火山灰(2.65%±0.03)的内核。蛋白质(3.12%±0.07)和脂肪(0.02%±0.01)低于皮的蛋白质(17.24%±0.23)和脂肪(6.47%±0.25)的内核。没有发现显著差异水平的碳水化合物之间的壳(79.54%±0.21)和内核(65.79%±0.17)。

3.6。矿物分析

的矿物含量分析的结果美国lychnophora提取表所示4。皮显示钙、铁、镁、和K含量显著提高(比的内核)。外壳有铜的含量毫克/ 100克和磷的内容毫克/ 100克,都显著降低(比的内核)。没有发现显著差异在Na外壳和内核之间的水平。

3.7。膳食纤维分析

表5显示了IDF,自卫队,TDF的美国lychnophora外壳和内核。以色列国防军,自卫队,TDF外壳都显著高于内核。

4所示。讨论

有很多研究对龋齿的预防和治疗,这是最常见的感染和慢性口腔疾病在人类身上。众所周知,这种疾病影响平均85.7%的人。龋齿,一旦感染,不是自我,因此,无法治愈没有治疗(16]。此外,如果不及时治疗龋齿可能发展成牙髓炎,可引起严重的疼痛,最终导致牙齿的必要提取(16]。

变异链球菌牙菌斑是常见的人类和是最生龋齿的细菌对牙釉质。饮食糖类代谢,产生有机酸如丙、丁,乳酸,甲酸代谢产品,可以降低牙菌斑的pH值,去除矿物质牙釉质,从而引发龋齿(17,18]。

附着力和殖民的变异链球菌收购了搪瓷薄膜涂层牙表面的初始步骤是牙菌斑的形成,这是一个类型的生物膜。生物膜的形成增强了细菌抵抗宿主防御系统和抗菌素。几个天然物质发达的牙科疾病的治疗和预防。甲醇提取物的叶子绿紫苏属和艾蒿(19)以及白人参(20.)据报道优秀对抗生素的影响变异链球菌。然而,据报道,乙醇提取的美国lychnophora有更多优秀的抗菌效果比这些物质。的甲醇提取物楤木属continentalis(21),以及瞿麦(22)据报道影响2毫克/毫升和4毫克/毫升,分别变异链球菌。此外,乙醇提取的美国lychnophora有优越的抗生素影响这些物质。我们旨在提供科学的证据美国lychnophora提取物能降低导致龋齿的细菌的生长。

在这项研究中,我们准备了乙醇提取美国lychnophora并研究其潜在影响的生龋齿的性质变异链球菌。的提取美国lychnophora抑制的增长变异链球菌。它通常被称为细菌的主要负责牙菌斑的形成和龋齿7]。的乙醇提取物美国lychnophora抑制了pH值下降引起的变异链球菌。这些结果表明,乙醇提取的美国lychnophora可以抑制有机酸生产变异链球菌。此外,乙醇提取的美国lychnophora抑制生物膜的形成,变异链球菌在浓度范围从0.01至0.04毫克/毫升和生物膜的形成上的扫描电镜数据证实了红色染料染色的数据。的提取美国lychnophora(0.01 - -0.04毫克/毫升)也抑制了树脂牙表面的生物膜的形成。在目前的研究中,我们使用0.1%氟化钠是一个积极的控制。它表现出抗菌活性和抑制降低pH值和生物膜的形成变异链球菌作为美国lychnophora。然而,之前的报告表明,氟化合物氟化有细胞毒性化合物用于浓度高于80 ppm (23]。氟化合物研究了抑制龋齿,但龋齿仍然是牙齿脱落的主要原因。因此,有必要开发新代理商拥有更好的预防龋齿的作用。在这个实验中,我们发现一个强大的生物碱,酚苷,和肽和低的类固醇,类黄酮、有机酸。这些化合物可能是负责anticariogenic活动中观察到目前的研究(24,25]。

的美国lychnophora乙醇提取显示水平的生物碱,酚醛树脂,苷肽,大于乙醇提取的报道楤木属continentalis(21]。在乙醇提取的结果楤木属continentalis,它有强大的类黄酮和有机酸,温和的酚醛树脂和类固醇,疲软的生物碱的存在。

然后,我们调查的直接成分美国lychnophora外壳和内核。的皮水分和灰分含量明显高于()比内核以及蛋白质含量和脂肪含量,显著降低(比的内核)。根据李的研究和陈26),铁的水平和P分别为183.0和2786.0毫克/公斤美国lychnophora来自中国,和P在柬埔寨样本2017.0毫克/公斤,多观察我们的研究。的水平钙,镁,钠为1210.0,3323.0,和8.1毫克/公斤,分别是更高的在我们的研究中。以色列国防军的外壳高于皮的柿子(15.71%)、枣(16.88%)、锌(7.32%)、谷物,马铃薯样品(7.36%)(27,28]。自卫队的干豆浆渣含有约16%,高于的外壳美国lychnophora(29日]。安全部队的内核级别低于纸浆的柿子(1.95%)、枣(1.95%)和锌(2.61%)27]。

总之,我们表明,乙醇提取的美国lychnophora可能会抑制酸生产和生物膜的形成,这可能是由于有机酸和苷提取的主要组件的吗美国lychnophora。因此,我们提供了科学证据的潜在的乙醇提取物的功效美国lychnophora治疗龋齿和基础继续ethnomedicinal作为标准治疗应用和未来的发展。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部、科学和技术(没有。2013 r1a1a4a03011203)。

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