壳聚糖和海藻酸钠的组合选择,高效,安全自然乙肝疫苗在小鼠模型辅助系统

文摘

乙型肝炎病毒(HBV)感染是主要的公共卫生问题和卫生保健工作者的职业危害。当前alum-adjuvanted乙型肝炎病毒疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效的措施。然而,疫苗有一些局限性包括一些vaccinee响应差和frost-sensitive悬挂。我们的研究的目的是使用另一种天然佐剂系统强烈免疫原性允许剂量的减少和成本。我们测试了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)佐剂与壳聚糖(Ch)和海藻酸钠(S),自然佐剂,无论是单独或结合明矾在小鼠模型。组小鼠皮下注射免疫与Ch HBsAg佐剂或年代,或三倍佐剂与明矾(Al)公式,Ch,和S,或双配方AlCh或肌萎缩性侧索硬化症。这些比较对照组与当前疫苗接种或unadjuvanted HBsAg的公式。我们评估血清转化,HBsAg抗体,血清il - 4,干扰素-γ的水平。结果表明,溶液配方与Ch或对Al-adjuvanted悬挂表现出类似的免疫原性的反应。AlChS给更高的免疫原性反应相比,控制。总的来说,我们的研究结果表明,Ch和S是有效的乙肝病毒佐剂提供自然选择,可能减少剂量。

1。介绍

乙型肝炎病毒(HBV)是最常见的一种病毒性传染病的肝脏和被认为是一个主要公共卫生问题。乙型肝炎病毒是影响卫生工作者的一个重要的职业危害据世界卫生组织(世卫组织)(1]。大约有2.4亿人是慢性乙型肝炎病毒感染是定义为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)积极至少6个月(2]。乙型肝炎病毒感染占30% 53%的原发性肝癌和肝硬化的世界2]。全世界近80%的肝癌病例可能与乙肝病毒是仅次于烟草中已知的人类致癌物(3]。

没有特定的治疗乙肝病毒;然而,自1982年以来一个疫苗乙肝病毒是被证明是安全有效的1]。推荐的疫苗已经被纳入国家免疫系统。到2002年5月,154个国家有婴儿常规免疫接种乙肝疫苗(4]。虽然疫苗有效预防感染,有局限性,包括估计5到15%的疫苗nonresponder [5]。此外,低利率的完成当前疫苗的接种疫苗是另一个问题(6- - - - - -8]。许多原因提出了不良反应或停止响应,包括并发感染或免疫功能低下的患者或遗传因素作为HLA单或细胞因子和趋化因子snp。除了技术错误intragluteal注射或不适当的储存条件(了5]),研究显示可能需要支持者,使用运营商,包括preS-epitope,或使用更强的免疫原性佐剂(5]。

尽管明矾是目前最常用的佐剂与人类和兽医疫苗,它提供了一些需要解决的障碍。明矾,像任何矿产佐剂,很难在物理化学可再生的方式生产。这次失败会影响其制定免疫原性。此外,明矾不能作为这两种冷冻或容易冻干过程导致凝胶的崩溃导致总聚合和降水9]。明矾还佐剂诱发炎症和局部反应在注射部位出现的(10),增加生产的IgE抗体反应作为整体的一部分,Th2概要文件是不可能防止疾病Th1免疫力和MHC类我为保护限制性CTL是必不可少的,例如,病毒感染细胞内寄生虫,或肺结核(11]。

有一种普遍的倾向使用天然产品的潜在来源的免疫调节化合物(12,13]。不同化合物来源于自然起源,如植物、微生物、藻类、昆虫或已经使用在开发新型佐剂的疫苗和治疗其他疾病的药物过敏和癌症等免疫调节疗法需要的地方(12- - - - - -14]。两个天然佐剂候选人是壳聚糖和海藻酸盐。研究显示明显的证据支持他们使用佐剂(9,10,15]。壳聚糖是一种天然多糖,转换由甲壳素脱乙酰作用,被认为是真菌的细胞壁的主要成分,节肢动物的外骨骼,软体动物的齿舌的喙头足类动物,包括乌贼和章鱼。壳聚糖被用于一些临床前和临床研究具有良好的耐受性,优秀的免疫刺激,和积极的临床结果的感染(11,12,14]。海藻酸钠,一种天然多糖,海藻酸的钠盐。这是一个口香糖,从褐藻细胞壁中提取。海藻酸钠通常被认为是无毒、无刺激性的物质。它带来了许多理想的特点,因为它是可生物降解的mucoadhesive聚合物,不产生毒性政府使其合适的聚合物用于疫苗的发展(15]。在目前的研究中,我们比较了提高乙肝疫苗的免疫原性反应使用佐剂系统壳聚糖和海藻酸钠相比,当前使用的辅助系统。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性和雌性Balb / c小鼠(6 - 8周的年龄,20 - 30 g)都包括在这项研究中,来自VACSERA植物园,以往,埃及。动物被安置在符合标准的实验室条件下,控制环境温度°C,%的湿度,12小时光/暗周期。动物被提供了一个标准实验室饮食和水随意。老鼠在实验开始前一个星期适应他们的环境。动物处理是根据指导方针13,16]。允许进行这项研究是获得伦理委员会在学院制药、开罗大学。

2.2。制备壳聚糖和海藻酸钠的解决方案

壳聚糖粉末(美国Sigma-Aldrich)溶解在0.8% (v / v)醋酸和0.9% (w / v)盐水,然后加热在37°C和持续不断的搅拌。海藻酸钠(美国Sigma-Aldrich)溶解在蒸馏水和加热37°C和不断搅拌,直到完全溶解;然后这两个解决方案被高压灭菌消毒。

2.3。佐剂疫苗配方系统和准备

乙型肝炎表面抗原(HBsAg),由葛兰素史克生物制品(比利时),稀释在磷酸缓冲溶液(PBS)最终浓度为1μ克/毫升(表1不同的配方,配方2)。佐剂的疫苗组合表解释道1。总之,我们稀释HBsAg PBS和氢氧化铝凝胶(明矾)(法国赛诺菲-巴斯德)或壳聚糖溶液或海藻酸钠获得HBsAg的最终浓度为0.1μ克/毫升。我们使用明矾在浓度为0.5毫克/毫升(Al)或壳聚糖浓度为0.5毫克/毫升(Ch)或海藻酸钠的浓度5毫克/毫升(S)。每个adjuvant-antigen混合物被动摇了两小时25°C,以确保完整的抗原的吸收到辅助系统(表1公式3 - 5)。明矾的配方组成与壳聚糖(AlCh)或海藻酸钠(AlS)是由添加明矾稀释抗原和动摇了一小时;然后添加壳聚糖和海藻酸钠,动摇了一个小时。最后佐剂联合疫苗配方的三个佐剂(AlChS)被稀释HBsAg准备然后添加明矾、壳聚糖、壳聚糖和海藻酸钠因此用颤抖的半个小时后第一和第二辅助添加;最后混合动摇了一个额外的小时。

2.4。加载功效评价疫苗配方HBsAg悬浮

加载每个疫苗制剂悬浮的功效,即,AlCh, AlS,和AlChS计算间接通过量化自由抗原剩余混合物在10000转离心后的上层清液十分钟如前所述[17,18]。加载功效(LE)值计算根据以下方程:

勒(%)= (HBsAg−免费HBsAg总额)/ (HBsAg的总金额)One hundred.

2.5。免疫研究的实验设计

Balb / c小鼠随机分为8组(老鼠)如表所示1。组控制组(1 - 3)组(1)负控制(PBS);(2)HBsAg 1μ在PBS溶液(1 g / mLμg);和(3)HBsAg 0.1μ克/毫升装上明矾(Al)。组4 - 8与以下配方:免疫组(4)HBsAg 0.1μ壳聚糖溶液中g / mL (Ch);(5)HBsAg 0.1μg / mL的海藻酸钠(年代);(6)HBsAg 0.1μg / mL加载明矾和壳聚糖(AlCh);(7)HBsAg 0.1μg / mL加载明矾和海藻酸钠(AlS);和0.1(8)表面μ克/毫升装上明矾、壳聚糖和海藻酸钠(AlChS)。各自组小鼠皮下注射1毫升的配方指南在活的有机体内分析(19- - - - - -22]。收集血液样本在免疫后4周。血清被离心分离在4000 rpm十分钟和存储−20°C到测试。

2.6。在活的有机体内安全分析

每组中的每个鼠标是14天监控和毒性评估存活率。此外,炎症症状红肿,局部肿胀,脱发在注射部位出现的监控每一个鼠标。

2.7。测量血清转化

阳性血清转化的速度是衡量使用商业酶联免疫吸附试验(ELISA) (Diasorin、意大利)。血清转化的速度是由下列公式计算:

血清转化率(%)= (HBsAg的老鼠与特定的免疫球蛋白数量的血清,等于或超过10个人/毫升)/(每组小鼠注射接种的总数)One hundred.

2.8。测量总HBsAg-Specific抗体和抗体的子类

在每组小鼠血清池,用于测量HBsAg-specific抗体(免疫球蛋白)和免疫球蛋白子类。总免疫球蛋白测定使用商业ELISA定量工具(Diasorin、意大利)所描述的制造商和结果表示为个人/毫升。测量HBsAg-specific IgG1, IgG2a IgG2b,纯化HBsAg (1μg / mL)溶解在0.05 M carbonate-bicarbonate缓冲区,pH值9.6,分发到96 -微量滴定板。涂板在4°C孵化一夜之间,用PBST (PBS 0.05%渐变20)三次,和阻止5%牛血清白蛋白(BSA)在PBST两小时37°C。与PBST洗盘子后,每组的血清添加到井中。盘子在37°C孵化了两个小时。与PBST洗盘子后,辣根peroxidase-labelled anti-mouse同形像(anti-IgG1、anti-IgG2a anti-IgG2b) (Komabiotech、韩国)添加和孵化为一小时37°C。板块再次洗PBST和结合抗体被发现通过添加3,3′,5、5′-Tetramethylbenzidine(三甲)(σ,美国)。反应停止了0.2 H₂所以₄在450/630 nm和吸光度是读一个自动ELISA读者(丹尼克斯,美国)。ELISA滴度是表达个人喜好/毫升,1个人平均吸光度读数的对照组血清+ 2倍标准差(SD)。

2.9。细胞因子的测量

每组的混合血清用于量化anti-mouse干扰素(IFN -γ)和白介素- 4 (IL)使用商业酶联免疫试剂盒(美国Bosterbio),制造商推荐的。细胞因子表达水平在pg / mL。

2.10。统计分析

数据分析使用GraphPad Prism 6.01(美国加州Graph-Pad软件有限公司)。我们用单向方差分析(方差分析)其次是多个比较使用LSD概率法细胞因子和抗体水平的比较。值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。壳聚糖和海藻酸钠显著提高疫苗配方中表面吸附

表面抗原的加载功效(LE)明矾悬挂配方(肌萎缩性侧索硬化症,AlCh和AlChS)测量确认添加壳聚糖和海藻酸钠或明矾没有降低吸附抗原的明矾。相比之下LE %配方中含有壳聚糖和海藻酸钠或仅从明矾显著增加()(图1)。阿尔勒%,AlCh, AlS, AlChS%,%,%,%(分别为±SD)(图1)。因此,新配方的辅助组成的明矾与壳聚糖和海藻酸钠或均显示明显的积极影响与明矾AlCh与Al (),AlS与Al ()和AlChS与Al (的吸附抗原(图)1)。

3.2。天然佐剂的配方没有死亡,没有皮肤过敏测试在活的有机体内模型

组小鼠皮下接种不同的配方(表1),观察14天。没有免疫动物组死亡率和体重变化。另外,我们观察到小鼠免疫与配方含有天然佐剂没有任何地方肿胀和脱发迹象在注射部位出现的而alum-adjuvanted配方(数据未显示)。

3.3。壳聚糖和海藻酸钠比较血清转化在老鼠Alum-Adjuvanted配方

特定抗体HBsAg (anti-HBsAg)至少10 milli-international单位每毫升(mlU /毫升)被认为是一个可靠的标志的保护水平免疫(1,6]。小鼠血清的百分比有anti-HBsAg≥10个人/毫升/每组小鼠接种疫苗的总数百分比是评为积极的血清转化速率。所有组显示阳性血清转化的比例超过50%(图2)。小鼠免疫与配方包含Ch或年代或铝单佐剂unadjuvanted控制相比没有显著差异。

3.4。壳聚糖和海藻酸钠明矾公式显著增加小鼠血清转化免疫与AlChS三重配方

小鼠组织免疫双辅助配方单一佐剂的配方相比没有显著差异或unadjuvanted控制(图2)。观察血清转化的比例最高的三重辅助制定AlChS血清转化速率高达90% ()(图2)。

3.5。壳聚糖和海藻酸钠引起HBsAg-Specific免疫动物的免疫球蛋白

从每组小鼠血清池后28天从接种疫苗被用于测定总HBsAg-specific免疫球蛋白的水平。一般来说,自然佐剂的配方是否单一佐剂加上明矾引起HBsAg-specific免疫球蛋白与alum-adjuvanted配方(图3)。此外,佐剂三重配方AlChS诱导HBsAg-specific IgG水平显著高于alum-adjuvanted集团()(图3)之间的合作表明某种三佐剂。

3.6。配方含有壳聚糖和海藻酸钠引起广泛的Anti-HBsAg免疫球蛋白子类在老鼠身上

配方含有佐剂Al和Ch引起IgG1 IgG2a, IgG2b小鼠血清(图4)。然而,海藻酸钠佐剂组显示更高的血清IgG2b水平相比其他两组(铝、Ch)。同样,AlS, AlCh AlChS佐剂配方引起广泛的anti-HBsAg免疫球蛋白子类(图4)。免疫球蛋白子类都引起AlChS组,增加IgG1子类(图5)。此外,三重配方显示显著增强IgG2b水平观察AlChS集团尤其是与艾尔和Ch组相比)和肌萎缩性侧索硬化症集团()(图4)。

3.7。利用壳聚糖和海藻酸钠与明矾三重配方引起最高il - 4的反应在活的有机体内同时结合壳聚糖和海藻酸钠与明矾双制定了最高干扰素-γ响应在活的有机体内

我们评估了il - 4和干扰素-γ进一步研究每个辅助系统引起的免疫反应和细胞因子的生产配方。小鼠组织免疫与单一的铝佐剂和Ch表现出类似水平的il - 4水平显著高于控制(图6(一))。配方包含显示il - 4水平最低,与控制(图6(一))。同时,双重和三重配方产生il - 4水平显著高于控制和unadjuvanted组(图6(一))。老鼠用三重佐剂免疫系统AlChS引起所有组相比,最高水平的il - 4 ()(图6(一))。

另一方面,所有含有佐剂组引起干扰素-γ水平高于unadjuvanted和对照组(图6 (b))。合并后的佐剂组AlCh AlS, AlChS显示更高水平的干扰素-γ比单身佐剂组()(图6 (b))。海藻酸钠佐剂配方诱导干扰素-高γ生产比明矾或壳聚糖单佐剂的配方()(图6 (b))。AlS诱导干扰素-最高γ水平在所有佐剂的配方(图6 (b))。

4所示。讨论

乙肝疫苗纯化重组蛋白组成,,尽管它的更好的耐受性,不幸的是更少的免疫原性,当单独管理。因此,有一个需要不断开发新的佐剂提高乙型肝炎病毒疫苗的免疫原性,所以可以使用低剂量的表面。在目前的研究中,我们比较了不同的天然佐剂的安全性和免疫原性反应系统壳聚糖、海藻酸钠,或者两者都比当前使用佐剂明矾。尽管明矾佐剂已用于实际接种80多年,其缺点是不容忽视的。主要缺点之一就是传统alum-adsorbed疫苗frost-sensitive停赛,因此不能冻干,因此使得运输和长期储存问题。还明矾抒发Th2-driven抗体反应与小Th1-type反应,限制防止许多胞内病原体尤其是病毒。此外,还有关于炎症在注射部位出现的安全问题(23,24]。

天然产物可以是一个巨大的化合物来源,调节免疫功能12,13,16]。在这项研究中,一些自然衍生化合物的潜在研究被认为是自然来源的疫苗佐剂与生物活性相当于当前商用佐剂。壳聚糖和海藻酸钠都是自然丰富的多糖。壳聚糖是证明是安全、无毒,nonirritable, nonantigenic,生物相容性和生物可降解的25,26]。同样,海藻酸钠被认为是一个安全的食品和药物成分通过美国食品和药物管理局(FDA)。海藻酸钠还可降解和廉价的生产稳定长保质期(9,27]。在我们的研究中,壳聚糖和海藻酸钠佐剂乙型肝炎病毒疫苗显示安全是否单独使用单一的辅助或结合明矾。然而,我们的在活的有机体内安全评估需要进行配方含有明矾更长时间的观察任何可能的长期神经或系统性不良反应与明矾。

我们首先研究了明矾的替换与壳聚糖和海藻酸钠佐剂制定单一的解决方案。壳聚糖和海藻酸钠佐剂的疫苗给类似的免疫原性响应明矾和彼此。这是明显的速度正免疫小鼠血清转化提供50%以上的anti-HBsAg至少10个人/毫升(图2)。此外,Ch和S引起类似水平的总anti-HBsAg免疫球蛋白(图3);此外Ch引起混合Th1-Th2免疫球蛋白子类与Al(图相似4)。同时,年代吸引了IgG2b Th-1-like响应(图4);至少也年代引起il - 4水平和干扰素最高的国家之一γ在小鼠血清(图6)。

它已经表明,Th1、Th2反应可以通过他们的细胞因子的生产特点28]。Th1免疫反应是由干扰素的生产——表示γ老鼠和生产IgG2a IgG2b Th2免疫反应时显示il - 4的生产和增强生产IgG1(数字4和6)[19,29日]。IgG2a / IgG1的比率的公式表示更IgG1 Th2反应(图5)。然而,海藻酸钠组诱导高水平的IgG2b与明矾和壳聚糖集团表明Th1-like反应的倾向。总的来说,这表明有一个自然引发的各种免疫球蛋白子类替代辅助系统,提供更多的保护乙肝疫苗Th1 / Th2反应的另一个标志是IgG2a / IgG1比率。它提供了一个指示Th1 / Th2偏见的免疫反应(28]。老鼠与壳聚糖免疫佐剂的配方展出的所有组中比例最高准确的平衡Th1 / Th2免疫反应增加IgG1表示,IgG2a和IgG2b抗体同形像(数字4和5)。整体这些发现不远的报道是什么用壳聚糖不同类型的抗原和不同的给药途径11,20.,21]。例如,佐剂的壳聚糖溶液与卵巢抗原注入老鼠像双亲地产生类似水平的IgG1, IgG2a, IgG2b [20.]。与此同时,壳聚糖溶液幽门螺杆菌抗原管理口头给IgG2a / IgG1它类似于我们的结果0.9(图5)[21]。

我们的单辅助系统结果也与之前的研究结果相一致,海藻酸钠引起响应转向Th1-like响应在海藻酸钠佐剂疫苗的芽孢杆菌Calmett-Guerin (BCG)管理小鼠皮下注射(15]。我们还发现干扰素的生产——显著增加γ但降低il - 4的生产海藻酸钠佐剂的疫苗相比,明矾和壳聚糖组il - 4和干扰素-近似水平γ(图6)。这些结果符合那些在其他研究发现使用海藻酸封装流感病毒保留其免疫原性和刺激的CD8 + T细胞反应的抗病毒细胞因子的分泌,如干扰素-γ(22]。这些发现支持单独使用壳聚糖和海藻酸钠作为一种替代自然乙肝疫苗的安全辅助代替明矾。

接下来,我们用壳聚糖和海藻酸钠结合明矾作为双重或三重配方,加强保护抗原疫苗的效力的退化在活的有机体内,试图减少HBsAg和明矾的用量,从而更有效的疫苗(30.,31日]。我们发现二重和三重配方提供最好的免疫原性反应。这是明显的三重配方有最高的血清转化(图2),引起混合IgG1总免疫球蛋白水平最高,2 a和2 b(数据给予更全面的保护3和4)。最后,三重配方显示显著的最高水平的Th2细胞因子il - 4,第二个在干扰素AlSγ水平(图6)。我们的数据支持使用佐剂结合减少明矾和HBsAg的用量。这是符合许多成功例子AS04含铝和细菌的脂质,monophosphoryl脂质(32]。这个辅助系统已经在欧洲和许可使用在许多疫苗就像乙肝病毒疫苗(Fendrix®)和人类乳头状瘤病毒(HPV)疫苗(Cervarix®)。

另一个重要参数是评价alum-adjuvanted疫苗(图的吸附效果1)。吸附抗原之前醇佐剂增强的管理是至关重要的免疫原性和必要的在避免快速降解后的抗原管理(33,34]。此外,吸附的程度成为参数评估最终的疫苗的功效的产品(33,34]。添加壳聚糖和海藻酸钠明矾提供有效装载的抗原佐剂系统(图1)。这些结果与报告不同配方的乙肝抗原时有效地与海藻酸涂布壳聚糖纳米粒子与加载效果等于% (28]。然而在我们研究明矾的存在增加了加载时有效地结合壳聚糖和海藻酸钠辅助,达到最大时的三个佐剂AlChS配方(图组合在一起1)。如预期之间的所有辅助配方在这项研究中,three-adjuvant联合集团(AlChS)是最免疫原性配方(数字3,4,6)。

而添加明矾的壳聚糖和海藻酸钠联合辅助系统水平上相互可比的结果给HBsAg-specific免疫球蛋白抗体,免疫球蛋白同形像,和细胞因子的生产,其免疫原性的影响没有显著增加相比单一佐剂的疫苗组。类似的观察发现当抗原和另一个辅助(CpG ODN 1826)被吸附壳聚糖纳米颗粒的配方没有给额外重要的好处比其他配方包含unadjuvanted抗原和佐剂(CpG ODN 1826)制定(17]。

此外,在当前的研究中,一群老鼠免疫皮下注射了1μg HBsAg unadjuvanted,自己感应低但可检测anti-HBs。当我们减少unadjuvanted HBsAg剂量(0.1十倍μg)或0.5μg / mL,我们发现没有反应(数据未显示)。所有佐剂的疫苗配方诱导峰值浓度相当于anti-HBsAg unadjuvanted疫苗(1μ少g),大约高10倍和10倍抗原(0.1μg),除了AlChS集团诱导anti-HBs效价甚至比1μg HBsAg(图3)。有趣的是,关于干扰素-γ水平,佐剂的疫苗配方都明显高于1μg unadjuvanted疫苗似乎特别强烈的海藻酸钠的存在是否单独或结合(图3),而il - 4水平的1μg unadjuvanted组比较少与佐剂抗原佐剂组的异常组与海藻酸钠生产降低il - 4(图6)。相反AlChS集团产生大量产生的il - 4水平约2倍高于1μ(图g unadjuvanted疫苗6)。类似的观察了小鼠相同的应变使用相同的抗原(HBsAg)明矾单独或结合不同佐剂(CPG ODN) [35]。这一结果表明,壳聚糖和海藻酸钠能诱导免疫原性反应相比,相同剂量的10倍unadjuvanted疫苗是否单独使用或结合明矾。

5。结论

我们的研究显示,天然产物可以作为一种安全、高免疫原性乙肝病毒疫苗佐剂。有利的使用自然选择有良好的生物相容性和免疫活动的具体HBsAg小鼠的细胞和体液免疫反应。集体我们的研究结果表明,使用天然佐剂、壳聚糖、海藻酸钠作为单一的辅助或结合明矾可以帮助生产低剂量的乙肝病毒疫苗可能会更便宜。联合制定的三重佐剂抗原佐剂系统是封闭的,并有很强的吸附表现出强烈的对免疫反应的影响。这些反应在细胞因子表达水平最高的水平,血清转化,anti-HBsAg,他们与平衡Th2和Th1同形像。我们的研究提供了一个很好的机会来改善当前许可的乙型肝炎病毒疫苗。然而,需要更多的研究来评估我们的发现的长期安全性和应用在临床的设置。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

引用

1. 世界卫生组织,b型肝炎简报204号,2000年瑞士日内瓦,世界卫生组织,2007年。
2. j . f . Perz g·l·阿姆斯特朗,洛杉矶法灵顿,y . j . f . Hutin和B·p·贝尔”的贡献乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染肝硬化和原发性肝癌在世界范围内,“肝脏病学杂志,45卷,不。4、529 - 538年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. b . n .字段,d . m . Knipe p . m . Howley d·e·格里芬,病毒学领域Lippincott Williams &威尔金斯,费城,宾夕法尼亚州,美国,2001年。
4. d . Lavanchy“乙型肝炎病毒流行病学、疾病负担,治疗,和当前和新兴的预防和控制措施,”《病毒性肝炎,11卷,不。2、97 - 107年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. a . Shlomai和y扫罗,“抑制乙型肝炎病毒复制表达和RNA干扰,”肝脏病学,37卷,不。4、764 - 770年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 疾病控制和预防中心(CDC),流行病学和预防疫苗可预防的疾病、公共卫生基金会,华盛顿,美国,2011年。
7. r·克莱门斯r·桑格j . Kruppenbacher et al .,“加强免疫后的低收入和无一个标准的三个剂量乙肝疫苗上市后监测schedule-results,”疫苗,15卷,不。4、349 - 352年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. k . Cardell B . Akerlind m . Sallberg, a . Fryden”很好的反应率两倍剂量的a和B型肝炎疫苗前nonresponders乙肝疫苗,”《传染病杂志》上的研究,卷198,不。3、299 - 304年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. a . e . Itodo j . Umoh, j . o . Adekeye m . o . Odugbo g . Haruna和m . y . Sugun”alginate-adsorbed钠的现场试验perfringens梭状芽胞杆菌对梭菌的类型C和D类毒素enterotoxemia绵羊,”以色列兽医杂志》上,卷64,不。1,2 - 5,2009页。视图:谷歌学术搜索
10. y加藤,h .馆和y町田,“应用几丁质和壳聚糖衍生物在医药领域,“当前医药生物技术,4卷,不。5,303 - 309年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. m·j·霍夫曼d . a . Zaharoff j·k·法伦,j . Schlom和j·w·格林尼”体内功效的壳聚糖/白介素佐剂系统蛋白质疫苗,”生物材料,32卷,不。3、926 - 932年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. y·m·瓦西里耶夫”Chitosan-based疫苗佐剂:不完整的描述复杂的临床前和临床评价,“疫苗专家审查,14卷,不。1,37-53,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. s . Leary w·安德伍德,r·安东尼et al。兽医动物的安乐死指南,2013年。
14. r . Scherließs Buske k .年轻,韦伯,t . rad和s钩”体内评价壳聚糖作为佐剂疫苗配方在皮下,”疫苗没有,卷。31日。42岁,4812 - 4819年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. f . Dobakhti t . Naghibi m . Taghikhani et al .,“Adjuvanticity海藻酸钠的影响在BALB / c小鼠皮下注射卡介苗,”微生物和感染,11卷,不。2、296 - 301年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. l . c . Chosewood和d·e·威尔逊在微生物和生物医学实验室生物安全,黛安娜出版,2007年。
17. o .博尔赫斯,m·席尔瓦,a . de Sousa g . Borchard h·e·Junginger和a . Cordeiro-da-Silva“海藻酸涂布壳聚糖纳米粒子是一种有效的乙肝表面抗原,皮下辅助”国际免疫药理学,8卷,不。13 - 14日,第1780 - 1773页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. x x y, y香港、美国史et al .,“疫苗交付,海藻酸涂布壳聚糖微粒的准备”BMC生物技术第89条,卷。8日,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. T·l·史蒂文斯a·博西诉m·桑德斯et al。”监管同形像分泌抗体的抗原辅助T细胞的子集,”自然,卷334,不。6179年,第258 - 255页,1988年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. Z.-S。温,杨绍明。关铭徐,X.-T。邹,Z.-R。许”,壳聚糖纳米粒作为辅助促进Th1、Th2免疫反应诱导卵清蛋白的老鼠,”海洋药物,9卷,不。6,1038 - 1055年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. y谢,N.-J。周,Y.-F。龚et al .,“Th免疫反应引起的H幽门用壳聚糖作为佐剂疫苗免疫保护及其关系,“世界胃肠病学杂志》上,13卷,不。10日,1547 - 1553年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. a·c·Boesteanu n s先生m·惠特利·e·s Papazoglou和p·d·Katsikis”生物聚合物封装活流感病毒作为一种普遍的CD8 + T细胞抗流感病毒的疫苗,”疫苗卷,29号2、314 - 322年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. r·k·Gherardi m .卖弄风情,p . Cherin et al .,“巨噬细胞myofasciitis损伤评估长期持久性疫苗衍生氢氧化铝的肌肉,“大脑,卷124,不。9日,第1831 - 1821页,2001年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. e . b . Lindblad,“铝化合物用于疫苗,”免疫学和细胞生物学,卷82,不。5,497 - 505年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. Arai k、t . Kinumaki和t . Fujita“壳聚糖的毒性,”《东海地区渔业研究实验室,没有。56岁,89 - 94年,1968页。视图:谷歌学术搜索
26. t·基恩和m·塔”,生物降解,biodistribution,壳聚糖的毒性。”先进的药物输送的评论,卷62,不。1,3-11,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. 王w·m·辛格,“选择增强佐剂的疫苗效力。”世界日报的疫苗,1卷,不。2、33 - 78年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. s . Romagnani“t细胞(Th1和Th2)子集,”年报过敏、哮喘和免疫学,卷85,不。1、9、2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. j·a·格雷西和j·a·布拉德利Interleukin-12诱发干扰素-γ端依赖切换的同种抗体免疫球蛋白子类。”欧洲免疫学杂志,26卷,不。6,1217 - 1221年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. b . Levast s Awate l . Babiuk et al .,“疫苗佐剂增强作用的组合,”疫苗,卷2,不。2、297 - 322年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. y Perrie, a·r·穆罕默德·d·j·柯比s e·麦克尼尔诉w·布拉姆韦尔,“疫苗佐剂系统:提高单元的功效蛋白质抗原,”国际制药学杂志,卷364,不。2、272 - 280年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. m . e . Pichichero“提高疫苗交付使用新颖的辅助系统,”人类疫苗,4卷,不。4、262 - 270年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. 陈t·克拉普·Siebert d, l·琼斯布劳恩,”与醇佐剂疫苗:优化疫苗效力和热稳定性,”制药科学杂志》,卷100,不。2、388 - 401年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. b·汉森a . Sokolovska h . HogenEsch, s . l .下摆”抗原吸附的强度之间的关系到一个醇辅助和免疫反应,”疫苗,25卷,不。36岁,6618 - 6624年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. r . Weeratna l . Comanita h·l·戴维斯,“CPG ODN允许低剂量抗原对乙型肝炎表面抗原BALB / c小鼠,”免疫学和细胞生物学,卷81,不。1,59 - 62年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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