文摘

目标。探索的改变β淀粉样蛋白(β)和低密度脂蛋白受体相关蛋白1 (LRP1恰巧)在APP / PS1老鼠电针刺激(EA)治疗后,进一步探讨机制。方法。四十个6个月大的APP / PS1小鼠随机分为模型组和EA组,与二十野生型老鼠作为正常对照组。老鼠在EA组处理EA问20 (băi回族)和双边KI 1 (yŏng全)穴位为6周。莫里斯水迷宫应用于评估行为的空间记忆。免疫组织化学(包含IHC)、ELISA、免疫印迹等被用来观察LRP1恰巧和的表达β。结果。莫里斯水迷宫试验表明,与正常对照组相比,模型组的学习和记忆能力明显下降(;)。EA组逆转(;)。海马的表达式βEA组相比明显降低模型组()。LRP1恰巧的表达模型组显著低于正常对照组();EA组中的表达明显高于模型组()。结论。EA疗法可以改善APP / PS1小鼠的学习和记忆能力。的底层机制可能在于upregulation Aβ运输受体和LRP1恰巧。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)、老年人痴呆的最常见原因,是一种神经退行性疾病主要是由进步的认知和记忆障碍(1,2]。

近几十年来,广告被广泛的病理机制研究[3,4]。淀粉样蛋白的积累β肽(β)在AD的发病机制中扮演最重要的角色(5,6]。大量的证据表明,β_1-42存款参与神经元丧失的过程从而导致AD患者痴呆的发生(7]。的高水平β在零星的广告是不平衡的β生产和间隙,特别是无序β间隙(8]。最近的研究关注β间隙通道通过颅微血管饱和流出系统,即运输跨越血脑屏障(BBB),具有传输速度快和大型运输体积。因此,大脑微血管和间隙之间的关系β也至关重要(9,10]。

主要假设支持的主要清算路径这一事实β在大脑的运输β通过BBB进入外周血有很强的清除能力(5,11,12]。此外,BBB模型脑微血管内皮细胞体外培养的线也被用于检测是否β可以运输到BBB,发现是肯定的(13,14]。一个β极地,可溶性大分子物质(15),它不能自由之间交换大脑和外周血通过自由扩散。因此,如果一个β交通在BBB存在,必须有一个β特定的BBB的转运蛋白。

低密度脂蛋白受体相关蛋白1 (LRP1恰巧)已知函数作为BBB间隙(或流出)运输β。流出的β启动时,它将直接LRP1恰巧abluminal膜的大脑内皮细胞(16]。山田et al。17]证明大脑微血管内皮细胞吸收β主要依靠LRP1恰巧BBB-specific蜂窝环境下。贝尔et al。18在动物实验中发现,isotope-labeled一个β注射到老鼠的尾状核会迅速清除了从大脑,和标记β在等离子体被发现。的间隙β可以抑制LRP1恰巧特定抗体。进一步的研究(16,19,20.)表明,在病理情况下,异常的β大脑的水平可能与改变相关的表达LRP1恰巧在颅微血管。

广告一调查报告,55%的患者曾至少一种形式的补充医学希望这些疗法可以改善他们的生活总体质量和延迟进一步的认知功能下降。临床研究显示,针灸能改善AD病人的心理和行为状况,以及认知功能(21- - - - - -23]。电针刺激(EA)是一种简单而有效的现代针灸方法用于治疗许多疾病。一项研究报道,EA问20 (băi回族)显示了一个重要的保护作用对学习和记忆的神经损伤和损伤24]。有更多的证据证明,针灸的治疗效果在广告25- - - - - -27]。然而,机制尚不清楚,需要更多的探索。

在这项研究中,6个月大的APP / PS1转基因老鼠被选为广告的动物模型。EA问20 (băi回族)和KI 1 (yŏng全)给老鼠。影响他们的行为和表达的β_1-42在海马体和LRP1恰巧水平进行了观察和分析,探讨治疗机理,EA AD的早期干预。

2。材料

2.1。动物模型和分组

2.1.1。动物

6个APPswe / PS1dE9双转基因雄性老鼠的动物模型被用作广告,与野生型老鼠相同的年龄和性别作为正常对照组。动物是购自南京大学模式动物研究中心(动物很多:SCXK(宁),2010 - 000年),称重g。所有实验程序遵守指导方针的“实验动物保健原则”由国家卫生研究所制定的立法中华人民共和国为实验动物的使用和护理。实验动物实验伦理委员会批准的协议是北京中医药大学。是努力减少动物使用和实验动物的痛苦。

2.1.2。动物分组和干预

40 APP / PS1转基因小鼠随机分为两组,模型组(M) ()和一个电针刺激组(EA) (20),而野生型老鼠被选为正常对照组(C),所有老鼠与常规饮食在单独的笼子里的屏障系统动物中心北京中医药大学。

关于EA组,EA问20 (băi回族)和双边KI 1 (yŏng全给老鼠,横向穿孔深度2 - 3毫米的一次性无菌针灸针(0.25毫米×13毫米)(北京中研泰和医药公司)。EA的阳极和阴极分别连接到左和右KI 1 (yŏng全),膨胀波的频率2/15 Hz, 1马,和一个针震动的强度,而动物保持安静,韩寒的穴位神经刺激器(北京华为工业发展公司,韩寒的LH202H类型)。问20 (băi回族)位于十字路口的矢状面中线和线连接两只老鼠的耳朵26]。KI 1 (yŏng全)位于脚掌上,在前部附近的缩进,第二和第三跖骨、1/3之间的距离从脚趾到脚跟的网28]。EA的治疗方法是进行鼠标袋老鼠克制,15分钟时间,每隔一天一次6周。正常对照组和模型组小鼠只是限制在同一个鼠标袋15分钟,每隔一天一次,完全连续六周(29日]。

3所示。方法

3.1。学习与记忆行为测试

莫里斯水迷宫测试是在一个圆形池进行测试学习和记忆的行为(30.]。水迷宫训练了2 nd-6th天EA干预6周后,与水温度°C。每组实验前的一天,老鼠被放置在平台10年代适应环境,和每个鼠标提供一段时间的免费游泳在迷宫中1分钟与第四象限的入口点。第一到第四天的实验中,小鼠每组中有一个地方导航测试。老鼠首先放置在平台适应环境面临的10年代,然后按顺序放入水墙远离四象限序列。录音停止后5 s的时候鼠标的平台,和最大游泳时间设定在60年代。在第五天,空间探测试验。平台了,老鼠顺序直接放置到水里的四个象限。一台电脑连接到一个图像分析仪(bs - 124莫里斯水迷宫视频分析系统:提供的药理学实验室隶属于北京中医药大学东直门医院,上海移动信息技术有限公司有限公司)监控游泳模式。

3.2。收集脑组织和检测相关的索引

3.2.1之上。一个β_1-42免疫组织化学

样品制备。每组2只老鼠的大脑在多聚甲醛固定后心脏灌注减少,与乙醇脱水,二甲苯透明了,嵌入在石蜡,冠状平面分段。

一个β_1-42免疫组织化学ABC方法。部分首先脱蜡和水分,放入0.01 mol / L柠檬酸缓冲抗原热修复10分钟和3%甲醇过氧化氢在室温下10分钟。然后被封锁在5%的部分正常山羊血清在37°C 30分钟和孵化主要抗体稀释剂(美国、Abcam ab10148 1: 100)一晚在4°C。孵化中的主要抗体稀释剂后,部分与磷酸盐(PBS)冲洗,然后用二次孵化抗体稀释剂(博士德生物工程,山羊anti-rabbit HRP-IgG, 1: 1000) 90分钟37°C。孵化前的部分与PBS冲洗与AB复杂在37°C和90分钟放入diaminobenzidine (DAB)解决方案10分钟后冲洗PBS的另一个时间。与苏木精后重染,脱水,透明后安装。在显微镜下观察的部分(BX53、奥林巴斯公司、日本)。

3.2.2。激光共焦成像与激光扫描共焦显微镜冰冻切片观察

样品制备。每组3只老鼠,分析物在多聚甲醛固定后心脏灌注。30%蔗糖添加24小时后,和脑组织冰冻切片与场外嵌入式陷入瓶子的底部。

蛋白酶K添加在37°C脑组织后洗了三次与PBS 5分钟。30分钟后,LRP1恰巧(美国、Abcam ab28320 1: 70)和一个β_1-42(美国、Abcam ab10148 1: 100)添加等价与PBS洗了三遍后。孵化一夜之间在4°C,第二抗体(FITC(美国、Abcam ab6785 1: 250)和Alexa萤石®647(美国、Abcam、ab150079, 1: 150))添加洗后用同样的方法。孵化在室内温度为1.5小时,DAPI(北京中山金桥,zli - 9557)添加修复部分洗后。激光扫描共焦显微镜(FV1000,奥林巴斯公司(日本)被用于部分观察。

3.3。收集和保存的大脑组织

在水迷宫测试后,每组小鼠戊巴比妥钠麻醉与0.3%(30毫克/公斤)。15海马被颅骨切开术和ELISA和免疫印迹样品准备时间左右,分别,然后保存在冰箱在80°C。

3.4。准备样品

3.4.1。对于一个βELISA

6对海马在每组和均质重8倍的体积混合酒5 M盐酸胍,50毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸液pH值(8.0),和1毫米PMSF冰。然后海马与16000 r / min,离心机在4°C, 20分钟,浮层。稀释样本分别由混合的上层清液的标准稀释剂体积的3200倍(美国表达载体KHB3441)和体积的800倍(美国表达载体KHB3441)模型的海马体和EA组。正常对照组的样本没有稀释。

3.4.2。对于LRP1恰巧免疫印迹

6左海马被添加到里帕溶解产物溶液包含1毫米PMSF的重量比1:每组100例,然后从组织总蛋白提取后均质化。然后海马在2000 r / min,离心机在4°C, 10分钟,提取后,上层清液的体积计算。样品被准备西方墨点法。

3.4.3。对于LRP1恰巧ELISA

其余9海马每组体重和均相的稀释1:8在PBS。相同的提取方法的提取上清液6对海马。稀释样品进行测试准备通过添加标准稀释的上层清液1:5(美国RD DRE20100)的所有组。

3.5。双抗体夹心ELISA方法

分别的酶联免疫试剂盒用于检测样品。首先,50μL的抗体在室温下操作的解决方案是添加到每个板为120分钟。100μL辣根过氧化物酶标记二次抗体操作的解决方案是添加到每个板在室温和暗反应30分钟。完成板洗四次尝试后执行。一个100μL显色底物操作的解决方案是添加到每个板在室温和暗反应30分钟。板洗四完成后进行尝试。100μL停止的解决方案是添加和混合到每个盘子里。的吸光度检测450海里的地方在30分钟内标。标准蛋白线用Excel。样品的浓度是根据样本数据,转换和β_1-42,一个β_1-40根据样本,而LRP1恰巧浓度计算稀释浓度。

3.6。西方墨点法

sds - page电泳进行10%的分离胶和5%的叠加凝胶和转移到0.45μm PVDF膜。膜阻止了三羟甲基氨基甲烷缓冲液中使用5%脱脂牛奶盐水补充渐变20 (TBST)为0.1%。第一个抗体(美国、Abcam ab92544 1: 20000;ab8227, 1: 2000)添加孵化前一晚在4°C。二级抗体(美国、Abcam ab6721 1: 2000)添加了颤抖和孵化之前在室温为1.5 h。HRP-ECL明亮的液体添加和x射线胶片曝光完成后在黑屋子里发展和修复。校准标记后,进行了分析和扫描,相对表达LRP1恰巧(LRP1恰巧/β肌动蛋白在每组相比灰度值)。

4所示。统计分析

使用SPSS 17.0软件进行统计分析。所有的数据都被当作意味着±标准差()。采用多组重复测量设计的方差分析日期的数据莫里斯水迷宫行为逃脱延迟。单向方差分析测试后使用正态分布和方差齐性,和LSD法用于成对比较的ELISA检测和免疫印迹。如果有一个非正态的分布或方差的异构数据,非参数检验将被使用。将统计意义,而高度统计学意义将。

5。结果

5.1。EA对空间学习和记忆的影响

统计结果表明,根据重复测量的方差分析和效果之间的团体,越狱每组延迟时间的增加明显降低培训的日子里,和组间有显著差异()。有显著差异的训练时间(天)),但没有显著差异之间的交互训练时间和组(天×集团)()。两两比较结果表明,逃跑时模型组延迟时间显著长于控制和EA组(见表1和图1)。

单向方差分析是用来确定平台跨界车的数量和空间的平台象限游泳距离探测试验三组,差异具有统计学意义()。平台跨界车的数量的平台象限游泳距离模型组明显低于正常对照组()。与模型组相比,平台跨界车的数量的EA组显著提高(平台象限),游泳距离在EA组显著延长()(见表2)。

在正常对照组小鼠的游泳轨迹大多集中在最初的目标平台象限,主要和受试者倾向于搜索。然而,模型组搜索的类型是随机的。与模型组相比,在EA组小鼠的游泳轨迹更集中在原始目标象限或相邻的象限,和搜索趋势有线性趋势出现(见图2)。

5.2。EA的效果β而LRP1恰巧

5.2.1。免疫组织化学结果β_1-42在海马体

布朗在正常对照组,有积极的表情的β_1-42细胞内和消极的细胞外。模型组中,有积极的表情的β_1-42和斑块存款与细胞外的密实度。与模型组相比,的表达β_1-42在EA组明显减弱,还有几个扩散老年斑(见图3)。

5.2.2。激光共焦成像的β_1-42而LRP1恰巧在海马体

在正常对照组,斑块的存款β_1-42没有发现,而LRP1恰巧表达主要在血管内皮细胞。模型组,有猴斑块沉积,而少LRP1恰巧是表达。在EA组,老年斑相对减少,只有一些弥漫性斑块,而LRP1恰巧的表达更比模型组。一个β_1-42LRP1恰巧,细胞核被贴上激光共焦成像(见图4)。

5.2.3。EA的效果β_1-40和一个β_1-42表达式

ELISA结果见表3。LSD测试是用于成对比较。结果表明,一个β_1-42和一个β_1-40表达水平和β_1-42/一个β_1-40值模型组均高于正常对照组();一个β_1-42和一个β_1-40表达水平在EA组低于模型组(),而没有显著差异β_1-42/一个β_1-40EA和模型组之间。

5.2.4。EA对LRP1恰巧的相对表达水平的影响

西方墨点法LRP1恰巧被显示在表的结果4和图5。LRP1恰巧/β肌动蛋白的相对表达水平LRP1恰巧灰度值。

LRP1恰巧/肌动蛋白。之间有显著差异模型组和正常对照组(),EA组明显高于模型组()(见表4)。

表5显示LRP1恰巧表达式的ELISA检测结果。之间有显著差异模型组和正常对照组()。没有显著区别EA组和模型组(),但是EA组高于模型组。

6。讨论

无序的间隙β是广告的主要发病机制。一个β通过BBB清除或降解途径的脑细胞流体排水(31日,32]。的一个β水平之间的大脑实质和间质液是老鼠的年龄成反比。对于年长的老鼠,β脑实质水平增加,而一个β脑组织液水平降低(33]。实验研究发现,LRP1恰巧可以运输β从BBB参与的间隙β船(34),和一个β可以减少运输水平。

1997年,成田et al。35)发现LRP1恰巧和广告之间的相关性。然而,在AD的发病机制的研究表明LRP1恰巧是复杂的功能,和一些结果是矛盾的。一方面,LRP1恰巧可以作为一种内化的应用和分解β在细胞器内腔;另一方面,LRP1恰巧在神经元膜还可以执行通过内吞作用的酶促降解β与其配体α2 m和载脂蛋白e;同时,LRP1恰巧对大脑微血管内皮细胞可能调解的流出运输βBBB。因此,LRP1恰巧就是相关的生成和清除β在某种程度上36- - - - - -38]。研究表明,广告模式,运输的β在BBB由LRP1恰巧在大脑受损39,40]。LRP1恰巧表达的抑制大脑健康的老鼠可以减少流出的速度β在大脑的30% (41)和提示的沉积β在大脑。

研究表明,通过注入iodine-labeledβ进入大脑,快速的运输过程β可以观察到在BBB [42]。这个过程可以抑制抑制剂(RAP)和LRP1恰巧的敏感α2巨球蛋白。所有这些证据证明LRP1恰巧BBB的主要载体β运输从大脑;也就是说,LRP1恰巧就是参与的间隙β,它也有一个广告的预防症状的影响几乎可以忽略不计。

实验表明,电针刺激可以提高学习和记忆能力在转基因小鼠和减少β在大脑。的影响机制可能与电脑微血管和一个β运输受体LRP1恰巧[13,18,43]。

我们的研究结果表明,在水迷宫逃脱延迟,老鼠在EA组和正常对照组分别保留了空间记忆在第二和第三天,和逃避与天的增加延迟时间缩短。这表明,EA模型提高了广告的空间学习和记忆能力。ELISA检测显示的水平β明显减少,与免疫组织化学结果显示一致性和激光共焦成像。这可能是一个EA的机制改善AD小鼠的记忆。

AD动物模型APPswe / PS1dE9双重转基因小鼠由人类突变基因的应用和PS1移植到老鼠来提高β水平的大脑,引起一系列病理损伤的广告。这个模型假设β是主要病理致病因素。此前有报道称越狱延迟时间在空间探测试验增加了三个APPswe / PS1dE9双转基因小鼠(44),而在这个实验的初步研究,发现莫里斯水迷宫逃脱延迟时间在EA组和模型组与正常对照组没有显著不同的5个月大的孩子双重转基因小鼠。李的水迷宫实验等。26)表明,学习和记忆障碍开始出现在7 - 8个月的年龄。

这项研究表明,EA可以改善的空间学习和记忆7个月大APP / PS1转基因小鼠模型组中已被证明都学习和记忆障碍。

我们的研究小组曾做过的研究问20 EA (băi回族)和KI 1 (yŏng全)作为APPV717I AD小鼠的干预。EA可以在11个月大的行为干预应用单一转基因AD小鼠神经元变化,β蛋白表达的大脑,特别是有减少的趋势β沉积在海马微血管(43]。EA疗法可以调节APP / PS1双重转基因小鼠海马超微结构(45]。APP / PS1双重转基因小鼠被用于这个研究可能导致早期病理表现等β沉降、老年斑、神经损失,和行为障碍的认知能力与single-transgenic老鼠相比,这样的长度EA可以缩短实验周期。老年斑的出现对大脑皮层的7个月大APP / PS1转基因老鼠表示EA的早期干预。

本研究的重点是LRP1恰巧在EA的效果,关键受体β清除大脑的血管模型。LRP1恰巧主要存在于大脑血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和其他细胞包括神经元,星形胶质细胞,平滑肌细胞(46]。在这项研究中,运用激光扫描共焦显微镜观察coexpression LRP1恰巧和β在海马体,证明LRP1恰巧是在微血管内皮细胞上表达。

这个实验表明,Aβ模型组的水平增加,而EA可以降低β的水平。此外,模型组LRP1恰巧水平下降,而EA LRP1恰巧水平增加。因此,EA的机制参与改善学习和记忆的能力可能会增加LRP1恰巧水平,从而增加的间隙β。

据报道,一个β可以直接经由LRP1恰巧,研究也表明,β只能运送后形成复合物与其他配体等LRP1恰巧载脂蛋白e [47]。EA调节另一个机制ApoE等等通过增加的速度和数量的组合吗β而LRP1恰巧和进一步降低β吗?进一步的研究可能的机制是必需的。

总之,本研究表明,EA可以提高学习和记忆的老鼠。一个β水平是显著降低在EA组与模型组相比,而LRP1恰巧水平也明显高于在EA组,这可能表明的减少β有关LRP1恰巧的运输;因此EA可能参与调节LRP1恰巧功能。提高运输的β蛋白质和减少一个β水平可能是一个功能使用EA方法治疗老年痴呆症,但仍需要进一步的证据。

7所示。结论

EA疗法可以提高学习和记忆能力在APP / PS1转基因小鼠。底层的机制可能是由于upregulationβ运输受体LRP1恰巧,从而作用于由导致学习和记忆水平的下降β在海马体。

伦理批准

所有程序中执行研究涉及动物是依照“实验动物保健原则”由美国国立卫生研究所制定的法律中华人民共和国为实验动物的使用和护理。

同意

知情同意是获得所有个体参与者包括在这项研究中。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

新王,Yanhuan苗族贡献同样这项工作。

确认

这个科学工作是由国家自然科学基金(不支持。81273826)。我们应感谢约翰先生m . Alsobrooks文学士学位,who offered the authors some help in revising the English expression of this paper.