薯蓣皂苷配基,通过ER - 5-Methoxypsoralen改善胰岛素抵抗α在HepG2细胞/ PI3K / Akt-Signaling通路

文摘

确定薯蓣皂苷配基的效果和底层机制(DSG)和5-methoxypsoralen (5-MOP),两个主要活性成分在中国古典处方Hu-Lu-Ba-Wan (HLBW),胰岛素抵抗,HepG2细胞培养介质中含有胰岛素。治疗与DSG 5-MOP,进行组合,分别。结果表明,HepG2细胞的孵化与高浓度胰岛素明显和糖原合成减少葡萄糖的消耗。然而,治疗DSG 5-MOP,或它们的组合显著逆转的条件和增加了磷酸化表达雌激素受体-α(ERα)、肉瘤(Src),一种蛋白激酶/蛋白激酶B,糖原合成酶激酶3β(GSK-3β),p85调节亚基的磷脂酰肌醇3-kinase p85 (PI3Kp85)。在转录水平,上述基因的表达也增加了除了GSK-3的负调控β信使rna。葡萄糖的增加表达的4 (GLUT-4)与此同时通过免疫荧光观察。然而,DSG的协同效应和5-MOP改善糖代谢并没有明显的在目前的研究。这些结果表明,DSG和5-MOP可能改善胰岛素抵抗通过ER-mediated PI3K / Akt激活通路可能是2型糖尿病的新战略,特别是女性estrogen-deficient条件。

1。介绍

糖尿病的患病率逐年增加。它不仅降低人们的生活质量,但也导致死亡的一系列并发症。根据国际糖尿病联合会估计,全球糖尿病患病率与20 - 79岁的成年人中有8.3%在2013年(1]。在东南亚地区,19.1%的全因死亡率50-59-year-old男性和25.7%的全因死亡率在50-59-year-old妇女被归因于糖尿病。更年期妇女似乎有一个引人注目的发病率增加2型糖尿病(T2DM)病人体内2]。很大一部分健康的绝经后妇女显示胰岛素敏感性下降(3]。因此,我们推测,雌激素可能在维持葡萄糖体内平衡起到至关重要的作用。尽管大量证据的有效性estrogen-containing疗法在减轻更年期症状4),许多妇女采取中药来调节血糖,因为副作用。

在中国,草药用于治疗糖尿病了数千年。Hu-Lu-Ba-Wan (HLBW)是一个重要的公式在中医中描述这本书杨贾史沧海。这个处方组成的生长foenum-graecum和补骨脂主要是用于改善性功能障碍。在诊所,我们发现HLBW对血糖有积极的影响在患有2型糖尿病。这种降糖效应也被证明了我们之前的研究2型糖尿病大鼠(5]。

DSG(图1(一))是一个重要的甾体激素的前体,可以发现生长foenum-graecum。许多研究报道DSG的有益作用在治疗糖尿病6,7]。5-MOP(图1 (b))是一种植物雌激素,可以提取补骨脂。其降糖效果也被发现在体内和体外8,9]。已报告(尽管他们类似雌激素的作用10,11),相对较少的研究检查了他们通过雌激素受体直接影响糖代谢,这是分布在多个器官和介导雌激素作用。

在人体中,葡萄糖代谢在特定的靶器官如肝脏合成和分解肝糖原。在胰岛素抵抗的情况下,有一个缺乏肝脏葡萄糖的吸收和糖原合成,进而会导致血糖升高。因此,胰岛素敏感性下降最终导致2型糖尿病的发生。PI3K / Akt-signaling途径是主要的下游分子通路的胰岛素和葡萄糖在动员中扮演着重要的角色在促进表达和易位GLUT-4 [12,13]。因此,本研究的目的是确定是否有相声ER-mediated降糖效果之间的两个植物雌激素和古典PI3K / Akt-signaling HepG2细胞通路。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

牛血清白蛋白是购自以色列贝特Haemek生物产业有限公司(以色列)。罗斯威尔公园纪念研究所- 1640 (rpmi - 1640)从Hyclone实验室购买公司(美国UT Logan)。DSG得到从Aoke生物学研究有限公司有限公司(中国,北京)。β雌二醇是购买从阿拉丁工业公司(上海,中国)。5-MOP、人类胰岛素、二甲亚砜(DMSO)和麦胚凝集素(WGA)染料从Sigma-Aldrich有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。胰蛋白酶、青霉素、链霉素、3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定包、免疫印迹装备,4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),特里同x - 100,不变色安装介质从古格购买生物科技有限公司(武汉,中国)。Bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验设备是获得Biosci生物技术有限公司有限公司(武汉、湖北,中国)。葡萄糖测定设备购买从北京Applygen技术有限公司(中国,北京)。肝糖原测定工具包是购自南京建成生物工程研究所(中国南京)。单克隆抗体对PI3Kp85, ERα,GLUT-4从密理博公司购买(美国Billerica的)。单克隆抗体对Akt p-Akt (Ser473) GSK-3β,p-GSK-3β(Ser9)、Src和p-Src(酪氨酸- 416)从细胞信号技术购买(美国贝弗利,MA)。多克隆抗体对次α(酪氨酸- 537)购买从圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。试剂盒试剂、PrimeScript RT试剂盒和SYBR预混料交货Taq买来豆类生物公司(大连、辽宁、中国)。Fluorescent-marked LI-COR生物科学所提供的第二抗体(美国东北林肯)。剥离得到缓冲Beyotime生物技术研究所(上海,中国)。山羊Anti-Rabbit Dylight 488(免疫球蛋白)和Dylight 549(山羊Anti-Mouse免疫球蛋白)从Abbkine购买,Inc .(美国CA雷德兰兹)。

2.2。细胞培养和治疗

HepG2细胞,由部门提供免疫学、同济医科大学、华中科技大学,培养在rpmi - 1640中补充10%的边后卫,青霉素100单位/毫升和100g / mL链霉素和维持在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂和95%的空气。确保细胞生存能力DSG长期孵化期间,5-MOP,β雌二醇在1640年修改RMPI介质,通过MTT测定细胞生存能力评估根据制造商的协议。

约3×10⁵细胞/好转入6-well板块融合并允许一夜之间成长70%。后10 - 12 h rpmi - 1640年饥荒中没有的边后卫,媒体在模型和干预组取代rpmi - 1640中包含胰岛素(10⁻⁶mol / L) 36 h。不同干预组、中包含DSG 5-MOP DSG + 5-MOP或β分别雌二醇随后补充说。

2.3。细胞上清液和葡萄糖含量测量细胞内糖原含量

24小时后药物刺激,上层清液收集确定葡萄糖消耗葡萄糖测定设备采用葡萄糖氧化酶法。细胞然后用磷酸盐(PBS)冲洗两次。经胰蛋白酶消化细胞悬液,然后离心,用生理盐水resuspended三次。细胞被打破的超声波技术(VCX150、超音速和材料、牛顿、CT、美国)。由肝细胞内糖原含量测定糖原试验设备使用硫酸蒽酮比色法。

2.4。免疫印迹分析

HepG2细胞被洗两次与PBS和细胞溶解在4°C radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区包含phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒。由离心细胞碎片被12000 g×15分钟在4°C,和上层清液蛋白质化验浓度采用BCA法。五十μg蛋白在SDS可溶性加载缓冲区和在沸水中加热10分钟;然后是10% sds - page分离(120 v, 90分钟)和转移到硝化纤维素(NC)膜(280毫安,90分钟)。然后膜被封锁在超纯水5% BSA粉1 h,其次是与主抗体(次孵化α,呃α,Akt p-Akt p-Src Src, p-GSK-3β,GSK-3β、PI3Kp85和β肌动蛋白)在一夜之间在4°C。5分钟的膜清洗TBST三次每个和孵化fluorescence-labeled二级抗体在室温下1 h。然后在TBST膜被洗了四次5分钟。检测,乐队可视化使用近红外荧光成像系统(美国NB奥德赛,林肯)。带密度被Image-Pro量化+(6.0版)。结果提出了光密度的比值的磷酸化乐队总目标或目标β肌动蛋白带。

2.5。定量实时聚合酶链反应分析

总RNA来自每个小组与试剂盒提取试剂。总RNA的纯度和浓度是衡量一个核酸/蛋白分析仪(美国热,罗克福德,IL)。然后2μ克总RNA reverse-transcribed使用PrimeScript RT试剂盒Mastercycler梯度聚合酶链反应(PCR)装置(股份公司、德国汉堡)。总反应体积是20μ2.0 l .然后μ20 L (cDNA被放大μ包含0.4 L PCR扩增反应μL底漆,0.4μL反向引物,6.8μL ddH₂啊,0.4μL火箭参考染料(50 x)和10.0μL SYBR预混料聚合应用生物系统公司的交货StepOne实时PCR系统(StepOne,促进城市、钙、美国)。整个过程有三个阶段:第一阶段,30年代的95°C;第二阶段,95°C 5 s;第三阶段,60°C 30年代。的方法用于数据分析。引物序列表1。

2.6。免疫荧光分析

细胞生长在显微镜盖玻片。被胰岛素36 h建模后,干预中添加。这些细胞被固定在4%缓冲福尔马林和permeabilized Triton x - 100年的0.5%。部分与GLUT-4或ER孵化α抗体的稀释1:500一夜之间在4°C。洗后用PBS ()三次,部分在稀释的二次抗体孵育1:1000 1小时在室温下。然后用DAPI轻复染色的部分或洗涤后编剧。免疫荧光,幻灯片直接安装在不变色安装介质和可视化荧光显微镜(尼康ECLIPSE CI或一个奥林巴斯共焦显微镜模型FV1000在800×600像素的分辨率)。Image-Pro + 6.0软件被用于免疫荧光的半定量的分析。

2.7。统计分析

所有结果平均值±标准偏差(SD)和通过SPSS 19.0软件进行分析。单向方差分析(方差分析)是用来确定统计学意义。基于是否认为平等的方差数据,分别使用LSD或Dunnett T3的测试。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。DSG和5-MOP ER的表达的影响αHepG2细胞免疫荧光

对数生长期的细胞用于检测ER的表达α。在我们的研究中,双重染色α和质膜显示ER的存在α在原生质膜、细胞质和细胞核通过使用共焦成像。合并后的图像还显示,DSG 5-MOP DSG + 5-MOP,β雌二醇的增加导致ER表达较模型组(图2)。

3.2。DSG 5-MOP,β雌二醇对细胞生存能力

在本研究的条件下,最大无毒浓度如下:DSG (10⁻⁵mol / L), 5-MOP (10⁻⁶mol / L)β雌二醇(10⁻⁶mol / L)(图3)。

3.3。DSG的影响和5-MOP上层清液葡萄糖含量HepG2细胞

与对照组相比,培养HepG2细胞在胰岛素(10⁻⁶mol / L) 36 h导致上层清液葡萄糖消耗明显降低()(图4)。然而,治疗DSG 5-MOP DSG + 5-MOP,β雌二醇导致增加葡萄糖消耗(,)。DSG + 5-MOP似乎显示治疗组较弱的影响葡萄糖消耗而独自DSG ()。数据验证了活细胞计数。

3.4。DSG和5-MOP HepG2细胞胞内糖原合成

如图5,情况模型组的细胞内糖原合成了低程度与对照组相比)。同时,细胞内糖原含量显著增加,DSG 5-MOP DSG + 5-MOP,β雌二醇组(,)。DSG + 5-MOP集团在这方面并没有呈现一个更出色的性能与两个中药单体组。

3.5。DSG的影响和5-MOP蛋白质ER的表达α/ PI3K / Akt-Signaling通路

为了探索DSG的机制和5-MOP改善胰岛素抵抗,我们检查了蛋白表达PI3K / Akt通路包括p-Src(酪氨酸- 416)/ Src, PI3Kp85 /β肌动蛋白,p-Akt (Ser473) / Akt, p-GSK-3β(Ser9) / GSK-3β。我们还发现ERα上游,这可能是一个蛋白质的途径及其磷酸化酪氨酸- 537。如图6,在我们的研究中,治疗与DSG, 5-MOP,或它们的组合都表现出显著增加上述蛋白表达率较模型组(,)。没有出现好的效果时,联合治疗组与中药单体组除了对p-Src / Src的影响。结合集团(DSG + 5-MOP)增加导致更多p-Src / Src与中药单体组()。有趣的是,β雌二醇似乎一点也不影响p-Akt / Akt的表达较模型组。这是不同于对其他蛋白质的影响,显示显著增加()。

3.6。DSG的影响和5-MOP ER基因表达在转录水平α/ PI3K / Akt-Signaling通路

探测DSG的影响和5-MOP基因表达在转录水平上,我们进行了rt - pcr。如图7,在我们的研究中,治疗与DSG 5-MOP,他们的结合,β雌二醇所有显示增加的ER基因转录αSrc, PI3Kp85, Akt较模型组的基因水平(,)。相反,Gsk-3负调控基因β干预后显示减少表达式(,)。我们也没有发现区别结合组(DSG + 5-MOP)和他们的单体组关于促进对基因转录的影响。有趣的是,我们还发现,DSG的影响比DSG的组合+ 5-MOP促进转录的一种蛋白激酶()。

3.7。DSG和5-MOP GLUT-4 HepG2细胞的表达

确定DSG的影响和5-MOP GLUT-4的表达,细胞被免疫荧光与DSG孵化后,评估5-MOP DSG + 5-MOP或β雌二醇24 h。如图8,GLUT-4的表达显著增加治疗组与模型组相比,(,)尽管没有DSG的优越效果+ 5-MOP组出现了。相反,5-MOP组表现出更明显的影响增加的内容比DSG + GLUT-4 5-MOP集团()。

4所示。讨论

糖尿病是一种慢性代谢紊乱引起的胰岛素分泌受损或降低其生物有效性。2型糖尿病是糖尿病的主要形式表现为胰岛素抵抗和糖尿病人口的-95%(占90%14]。在生理条件下,肝脏提供了一个主要调整glucostasis通过合成和糖原分解,氧化分解的葡萄糖和糖质新生。当肝脏工作不当,如对胰岛素的敏感性较低,这可能导致血糖的波动。因此,改善肝脏的胰岛素抵抗的治疗2型糖尿病的一个重要方向。

在中国,中药也被广泛用作治疗2型糖尿病(另一种方法15]。植物提供了一个巨大的宝藏的天然产物作为医学的一个主要来源。生长foenum-graecum和补骨脂两个常见的药物用于2型糖尿病由于yang-tonic效果。的主要成分,DSG 5-MOP,被选为目标在我们的研究中组件的兼容性的方法(16]。在以前的研究中,DSG 5-MOP显示,多重活动对糖代谢障碍(17,18]。一些研究认为DSG的降糖效果的调节代谢相关酶19,20.),其与各种目标分子,和相关的信号通路21,22]。最近的一项研究[23]探索潜在的DSG改善氧化应激在糖尿病的管理。5-MOP机理的探索对血糖控制的影响也进行了,包括其抑制作用的蛋白酪氨酸磷酸酶1 b (9和氧化应激8]。然而,分子机制有关DSG和5-MOP葡萄糖代谢的影响远未被完全理解。DSG和5-MOP考虑类似雌激素的作用,我们进一步探讨ER信号的可能作用在调节糖代谢与PI3K / Akt-signaling通路,调节葡萄糖代谢的直接信号通路。

近年来,PI3K / Akt途径获得了认可它在代谢调节中的作用。基于体内和体外研究中,需要PI3K insulin-induced葡萄糖吸收和抑制葡萄糖的生产24,25]。p85 PI3K监管对碘氧基苯甲醚α基因被报道在发展中2型糖尿病的风险增加(26]。许多的代谢影响,包括调节糖代谢,需要PI3K下游目标Akt激活。完成一种蛋白激酶的激活需要磷酸化ser473的C末端。持续活跃Akt诱发易位GLUT-4的质膜促进葡萄糖吸收,也使磷酸化GSK-3β增加糖原合成(27,28]。Src是一个上游Akt蛋白。在Tyr416可以激活一种蛋白激酶磷酸化Src完成后续的信号转导(29日]。海恩斯等人进行的一项研究。30.表示一个复杂的呃,c - src, PI3Kp85,使我们的注意力ER-initiated membrane-localized类固醇激素受体信号通路。因此,我们认为的可能机制β雌二醇诱导PI3K / Akt激活HepG2细胞(图9)。

我们的实验室结果表明DSG和5-MOP可以改善胰岛素抵抗由于加速葡萄糖效用和细胞内糖原合成。这种现象是伴随着ER的磷酸化αSrc, PI3Kp85 Akt, Gsk-3β。基因转录也进行了测量与合成增加,Src, Gsk-3 PI3Kp85,和一种蛋白激酶,但不是β治疗后通过DSG或5-MOP。Gsk-3β是一个负调控分子PI3K / Akt通路的下游。治疗后,Gsk-3的基因表达β降低了。通过免疫荧光,我们增加了ER和GLUT-4发现,葡萄糖利用率增加的迹象。然而,DSG的协同效应和5-MOP胰岛素抵抗并没有明显的在这个研究。DSG,基于植物的类固醇,作为各种天然或合成甾体激素的前体。它有一个结构与雌激素相似,主要的雌激素,讨论我们的手稿。模仿,我们假设DSG可能结合雌激素受体的别构部位立即并达到饱和状态。在这种情况下,绑定的DSG 5-MOP雌激素受体的亲和力下降,导致抽搐由于减少抑制雌激素的模仿。没有DSG 5-MOP可能通过激活雌激素受体产生影响。这可能是原因,没有协同效应发生在结合这两个化合物。然而,确切的机制需要进一步调查。

仍有一些限制我们的工作。在目前的研究中,没有直接证据证明ER之间的联系α和PI3K通路。因此需要进一步的深刻研究。

总之,我们的体外研究表明DSG和通过一个ER 5-MOP可以改善胰岛素抵抗α介导PI3K / Akt激活途径,这其中牵扯到的一种新型治疗方法使用这种天然产品治疗代谢疾病,如2型糖尿病。

缩写

HLBW:	Hu-Lu-Ba-Wan
DSG:	薯蓣皂苷配基
5-MOP:	5-Methoxypsoralen
呃:	雌激素受体
GLUT-4:	葡萄糖transporter-4
2型糖尿病:	2型糖尿病。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(号。81273683,81473637,81473448)。

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