文摘

我们组所做的一项研究表明黄芪加上种植党参和Plastrum testudinis是有效的治疗儿童β地中海贫血在随机对照临床试验。然而,支撑这种治疗的作用机理仍有待阐明。血液收集患者参加临床试验,有核富含血红的单核细胞分离促进RNA和蛋白质的提取。rt - pcr用于监视球蛋白基因的表达和p38 MAPK和总和磷酸化p38 MAPK表达评估使用免疫印迹分析。的表达α- - - - - -,β- - - - - -,γ球蛋白mrna治疗后没有明显影响r .踝骨或复合配方。然而,克γ球蛋白mRNA水平在两个治疗组显著增加(与预处理水平相比)后12周的治疗。此外,治疗后的Gγ球蛋白表达均明显高于治疗组与对照组相比。尽管p38 MAPK信使rna和蛋白质含量是影响治疗,治疗后磷酸化p38 MAPK的显著增加r .踝骨和复合配方组与对照组相比。这些数据表明,支撑有效使用的分子机制r .踝骨在儿科(及其复合配方)β地中海贫血的治疗促进G的感应γ球蛋白p38 MAPK激活后表达。

1。介绍

血红蛋白(Hb)疾病,特别是β地中海贫血,是最常见的单基因疾病由突变引起的β球蛋白轨迹。合成障碍导致异常或减少成人血红蛋白(HbA)生产过剩,无可匹敌的α在发展成红血球细胞进行攻击。临床症状包括骨髓扩张,脾肿大,严重贫血,需要定期输血。临床管理的β地中海贫血患者包括终身输血和螯合疗法去除多余输血铁(1),在某些情况下,骨髓移植(2,3]。β地中海贫血症状根据严重程度分类是基于稳态Hb和输血依赖性。β地中海贫血主要和β地中海贫血媒介物都是遗传造成的β球蛋白基因突变(4]。此外,β在童年地中海贫血会导致中度贫血,经常进行输血依赖性随着时间的推移,铁装,独特的并发症有关扩大红细胞生成和溶血。

虽然同种异体造血干细胞移植(HSCT)和基因转移疗法可用于患者β地中海贫血,现代药物和必要的财政资源大部分这些程序不可用β血红蛋白病的患者(5- - - - - -7]。胎儿血红蛋白的药理感应(住宅)可能是一个有前途的替代治疗这些患者的治疗选择。住宅由两个α球蛋白和两个γ球蛋白链(α₂γ₂)和高度表示胎儿和出生后的早期阶段;然而,随后住宅水平下降后并发增加HbA (α₂β₂)表达式。增加住宅水平在HbA合成功能可以弥补缺口β地中海贫血患者和合成γ进行攻击可以中和过量的不平衡α进行攻击,减少红细胞损伤和改善贫血和许多并发症β地中海贫血(5]。药物诱导的住宅也代表了一种潜在的更便宜,更广泛适用的治疗手段β世界各地的人。药物促进的感应γ球蛋白包括羟基脲(胡),5-azacytidine,丁酸和促红细胞生成素,胡锦涛是唯一的候选人,已经证明改善的临床过程β地中海贫血(8- - - - - -11]。然而,这些代理是不适合与有效性、安全性和易用性。例如,响应胡锦涛变量和削弱的反应常常是观察后长期管理。此外,γ球蛋白感应代理可能会导致myelotoxicity,潜在的致癌物质。此外,这些治疗方案的成本是一个重要的限制(7]。因此,有效和安全的替代基因诱导试剂(非常不错12- - - - - -14]。

中国传统医学(中医),单独或结合其他治疗方案,已经用于治疗贫血(2,15- - - - - -17]。有人建议,Yisui圣雪颗粒(18),Plastrum testudinis(龟板)[19]延长红细胞寿命通过antilipid过氧化反应和膜稳定。黄芪(黄芪[AMW];黄琦在中国)中医根曾被用于治疗贫血(16,20.]。我们之前在体外实验表明,Plastrum testudinis、AMW和种植党参可以提高γ球蛋白mRNA表达和住宅生产人类红细胞K562细胞培养,从患者红细胞祖细胞β地中海贫血(19,21]。随后,我们进行了一项随机、对照、双盲的临床试验与AMW及其复合配方(AMW +种植党参+Plastrum testudinis)治疗β地中海贫血(14]。合成数据表明,治疗12周后,AMW和复合配方增加住宅的水平,红细胞,意味着微粒Hb,网织红细胞β地中海贫血,没有副作用14]。因此,AMW和复合配方能改善β地中海贫血的症状,导致住宅基因表达。此外,一个额外的研究由我们组证明黄芪独立和复合配方可以诱导K562细胞中p38磷酸化和培养人类红细胞的外周血祖细胞β地中海贫血患者(22]。然而,这些结果需要进一步验证。因此,我们的目标是阐明作用机制与AMW及其复合配方β地中海贫血患者,研究专注于球蛋白基因表达和下游信号通路。

2。材料和方法

研究在本研究中进行了符合赫尔辛基宣言和伦理委员会批准的这项研究是广州医院中医。所有参与病人或其法定监护人签署知情同意表格之前发起了这项研究。

2.1。样品

的血液样本用于本研究的参与者先前的随机、对照、双盲的临床试验(14]。试验包括35例,2 - 18岁,与确认β地中海贫血的基础上Hematopathy的诊断和治疗标准(23]。受试者没有接受输血或治疗贫血在前12周之前登记和血红蛋白水平相关范围从4.5到10 g / dL时登记。十三岁的受试者接受r .踝骨(AMW), 11例治疗复合配方(AMW +种植党参颗粒(CPG) +Plastrum testudinis颗粒(PTG)), 11个患者接受安慰剂。飞行员在我们实验室进行实验(数据未显示)表明,样本容量大于10每组分析所需的对象。

外周血是来自患者治疗前和治疗后12周指定的临床试验(14]。所有的病人(或其法定监护人)允许我们使用提取的血样本研究研究分子机制的治疗效果。血液样本被收集到遗传损伤管包含Na-EDTA和整除从这些样本用于这项研究。

2.2。治疗

治疗过程和信息有关治疗的有效性与AMW复合配方以前陆et al。(2012)报道14]。简而言之,AMW和复合配方(AMW + CPG + PTG)是由广东易纺制药有限公司(中国广东省)。草本植物提取和10 g的粒状r .踝骨每克AMW 10克种植党参3 g的CPG, 10 gPlastrum testudinisPTG的0.7 g。安慰剂是准备使用糊精和一个完全相同的协议,用于草药造粒。所有颗粒都是口服药物用温水在禁食状态和治疗12周进行。

2.3。外周血单核细胞隔离

单核细胞的人口大部分由有核从外周血红细胞被隔离使用不连续Percoll密度梯度离心法。两毫升的儿科患者的外周血从每个放在一个离心管中。每个血液整除随后稀释2毫升的PBS (pH值7.4)。双密度Percoll列准备一毫升每1.090 g / mL和1.075 g / mL稀释Percoll细胞隔离媒体(法玛西亚)。1.090 g / mL Percoll解决方案是分层离心管底部,和1.075 g / mL Percoll慢慢的解决方案是,轻轻地从注射器在密集的解决方案没有令人不安的接口。4毫升的外周血样本稀释慢慢添加到顶部的双密度Percoll列和离心机在室温下30分钟的400 rpm。1.090克/毫升之间的细胞层和1.075 g / mL Percoll媒体被隔离。这个细胞群包含主要有核红细胞和少量淋巴细胞和粒细胞(24]。这些细胞被洗了三次PBS的两卷。其次是在1250转离心步骤10分钟抛弃上层清液和颗粒。这些细胞被用于提取RNA和蛋白质。

2.4。测量球蛋白mRNA

从有核富含血红的单核细胞RNA分离使用试剂盒®试剂(Sangon生物科技、上海、中国)根据制造商的指示。一百单位M-MLV(表达载体,卡尔斯巴德,CA)被用来合成cDNA从4μ我的总RNA。定量实时PCR当时使用SYBR执行绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司,诺沃克,CT)和ABI 3900实时系统(应用生物系统公司)。以下引物和探针序列:α球蛋白正向引物(5′-GAGGCCCTGGAGAGGATGTT-3′)和α球蛋白反向引物(5′-CGTGGCTCAGGTCGAAGTG-3′);β球蛋白正向引物(5′-GGCAACCCTAAGGTGAAGGC-3′)和β球蛋白反向引物(5′-GCAGCTCACTCAGTGTGGCA-3′);一个γ球蛋白正向引物(5′-GAGCTCACTGCCCATGAAT-3′)和Aγ球蛋白反向引物(5′-CTCTCAGCAGAATAGATTTATTATTTCT-3′);Gγ球蛋白正向引物(5′-AGCTCACTGCCCATGAAG-3′)和Gγ球蛋白反向引物(5′-CTCTTAGCAGAATAGATTTATTATTTCA-3′);和p38 MAPK正向引物(5′-ACGTTCTACCGGCAGGAGCT-3′)和p38 MAPK反向引物(5′-AAGCAGCACACACAGAGCCA-3′)。人类β肌动蛋白是作为内生控制;正向引物序列用于放大这个轨迹5′-GCGCGGCTACAGCTT CA-3′和反向引物序列5′-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。归一化后的所有数据进行了分析β肌动蛋白表达和每个反应进行了一式三份。rt - pcr实验进行了一式三份。

2.5。标准的互补和标准曲线的制备

三个互补脱氧核糖核酸样本随机选择从每组和放大使用相应的引物对准备标准控制DNA。从琼脂糖凝胶PCR产品分离和提取。DNA浓度用分光光度法测量(260海里)。DNA被认为是高质量的/比在1.8和2.0之间。

信使rna序列稀释10倍后测量标准DNA (10⁸到10⁴超纯水的副本)。这个决心是在使用后一式三份SYBR绿色实时rt - pcr检测。相关Ct值绘制对DNA拷贝数构造一个标准曲线。

2.6。SYBR绿色实时rt - pcr检测

实时rt - pcr检测进行了使用SYBR绿色主人混合(表达载体)工具包。浓度为0.2μ每个引物被用于每个反应。rt - pcr进行最后一卷25μ包含5 L相互反应μ5 L×SYBR绿色主人混合,0.5μ每个10 Lμ正向和反向引物,0.5μL(核苷酸(10更易/ L), 2μ0.5 L的cDNA、μL的Taq (3 U /μL)和16.5μ超纯水的L。优化后的热循环条件如下:40 93°C的周期为3分钟,15秒93°C, 55°C 25 s, 72°C 25。荧光测量在每个周期。

2.7。免疫印迹和抗体

对于全细胞提取准备、有核富含血红的单核细胞在radioimmunoprecipitation细胞溶解试验(里帕)缓冲区包含一个完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏,潘茨堡,上巴伐利亚,德国)10分钟在4°C和提取(50μg)分离利用sds - page和转移到聚乙烯二氟化物薄膜(PVDF)。膜与兔子孵化anti-p38 MAPK抗体(1:500),山羊anti-mouseβ肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA),或兔子anti-phospho-p38 MAPK抗体(Bioworld技术1:500年,圣路易斯公园,MN)。HRP-conjugated抗体或anti-rabbit二级抗体(1:5000)购买的西格玛奥德里奇(圣路易斯,密苏里州)和圣克鲁斯生物技术,分别。样本大小有关的免疫印迹分析三组类似描述了先前的实验;也就是说,患者13r .踝骨复合配方,患者,11和11个安慰剂患者药物在免疫印迹分析进行了分析。

2.8。统计方法

使用SPSS软件进行统计分析(版本13.0)。结果给出了意味着±标准差(SD)。Greenhouse-Geisser修正了nonsphericity考虑当决定意义。学生的t以及或单向方差分析中用于评估统计学意义意味着值组。方差分析分析后,费舍尔最显著差异(LSD)执行测试来确认数据和比较手段(被认为是统计学意义)。

3所示。结果与讨论

3.1。标准曲线和试验的可靠性

单核细胞的人口大部分由有核从患者红细胞和RNA随后被提取。对于每一个样本,γ- - -β球蛋白mRNA水平是使用荧光技术测量的rt - pcr检测分析相关的分子机制AMW和复合配方治疗12周。Ct值绘制与稀释标准DNA拷贝数和相关的标准曲线线性范围在3 - 4日志显示单位的DNA拷贝数(10⁸-10年⁴拷贝/μL为Gγ球蛋白;10⁹-10年⁵拷贝/μL为α- - - - - -,β- - - - - -,γ球蛋白;和10⁹到10⁶拷贝/μL p38 MAPK)。线性回归分析是用于建立标准曲线α球蛋白(;),β球蛋白(;),克γ球蛋白(;),一个γ球蛋白(;),p38MAPR (;),β肌动蛋白(;)。

3.2。Gγ球蛋白mRNA之前和之后的治疗

细胞表达α- - - - - -,β- - - - - -,γ球蛋白基因在胎儿和成人发展为了合成血红蛋白。成人血红蛋白是一个包含两个四聚物α球蛋白子单元和两个β球蛋白亚基(α₂β₂)。相反,胎儿血红蛋白是由两个组成的α球蛋白和两个γ球蛋白子单元。评价球蛋白基因表达在有核富含血红的单核细胞来自患者治疗前后使用标准RT-qPCR和引物对特定的人类α- - - - - -,β- - - - - -,γ球蛋白透露mRNA的表达特定于这些球蛋白基因的转录。rt - pcr数据表明,Gγ球蛋白mRNA各组在治疗没有显著差异(),但明显不同的各组治疗后()。进一步多重比较表明,Gγ球蛋白mrna的复合配方组()和黄芪治疗组()均明显高于对照组;没有发现显著差异之间的复合配方组和黄芪治疗组()。之间的显著差异发生安慰剂治疗组;然而,AMW和复合配方组之间的差异不显著(图1)。Gγ球蛋白mRNA水平复合配方组高出1.65倍治疗前相比,治疗后()。同样,克γ球蛋白在mRNA水平黄芪治疗组高出1.53倍治疗前相比,治疗后()。这些差异被认为意义重大。相比之下,没有观察到显著差异在Gγ球蛋白水平对照组前后安慰剂的病人药物治疗()(图1),这表明AMW及其复合配方G显著增加γ球蛋白mRNA转录。后者的现象可以解释增加住宅的临床试验中观察到的水平。然而,无论是AMW还是其复合配方的影响α- - - - - -,β——或γ球蛋白mRNA水平治疗12周后(图2)。

3.3。p38 MAPK信号通路治疗前后变化

p38 MAPK最初被确定为一个激活的蛋白激酶的压力。这个激酶也已被证明能够协调细胞反应在红细胞生成(25- - - - - -27]。p38 MAPK对血红蛋白的合成至关重要和p38老鼠表现出严重的贫血和死亡在子宫内由于有缺陷的血管生成和胎盘机能不全28]。丁酸钠和trichostatin红细胞细胞治疗,p38 MAPK介导住宅感应通过激活营地反应元件结合蛋白1 (CREB1)。p38信号调节Gγ通过下游效应器,球蛋白转录在红细胞成熟CREB1,结合Gγ球蛋白营地响应元件(G-CRE)。此外,p38或CREB1功能增强γ球蛋白转录和这些监管效果观察是守恒的原发性红细胞细胞生理测试条件下(29日]。

鉴于p38 MAPK信号通路是中介与压力诱导的关键γ球蛋白mRNA (30.),我们建议G的感应γ球蛋白基因表达后AMW和复合配方治疗可能增加p38 MAPK表达或激活。事实上,一项研究由我们组表明,复合制剂之一,Plastrum testudinis,促进γ球蛋白mRNA积累和住宅在K562细胞中合成后p38 MAPK信号通路的激活。这些结果验证后观察预处理后,后者影响是抑制K562细胞与p38 MAPK抑制剂,SB203580 [30.]。此外,我们小组进行的另一项研究表明,水提取的黄芪0.5,水提取物复合配方,更易与独立/ L丁酸钠诱导K562细胞中p38磷酸化和培养人类红细胞的外周血祖细胞β地中海贫血。所有这些反应了类似的时间效应简介:磷酸化在6 - 8 h p38水平开始上升,在48-60 h达到顶峰,之后开始下降。再次SB203580抑制p38磷酸化的增加最初引发的水提取物(22]。

因此,我们测量总p38 MAPK (t-p38)和磷酸化p38 MAPK (p-p38)水平在有核富含血红的单核细胞在AMW收集,复合配方,或安慰剂治疗患者。我们观察到t-p38 mRNA(图3(一个),和0.965治疗前后)和蛋白质(数字3 (b)和3 (c),和0.476治疗前后)水平组之间没有显著差异。然而,p-p38蛋白质含量在所有三组(图类似3 (d);)在治疗前,治疗后和蛋白质含量明显不同(图3 (d);)。方差分析分析LSD和随后的分析表明,p-p38水平明显高于后AMW和复合配方治疗与安慰剂相比。相比p-p38蛋白质含量,测定治疗前,复合配方和AMW团体表达了2.3 - 2.2倍更多的蛋白质,分别在治疗后(图3)。但是,这些治疗组之间的差异没有显著不同。

我们之前报道的临床结果与AMW和复合配方治疗(14]。治疗12周后,小儿患者β地中海贫血增加了胎儿Hb、红细胞和微粒Hb和网织红细胞。此外,没有观察到不良的影响对白细胞、中性粒细胞、血小板、肝和肾功能。治疗是有效的在64%和62%的儿童β地中海贫血的复合配方和AMW组,分别。这些结果表明AMW和复合配方是有效和安全的。此外,增加Hb和住宅水平观察AMW复合formulation-treated病人,表明两种治疗方法可能是有效的和安全的住宅感应的病人。

传统中药(TCM)被认为是导致副作用相对较少。然而,目前报告与中医有关的使用β地中海贫血是复杂的和单一的识别γ球蛋白诱导物从中药制剂是很困难的。我们以前报道,为儿科AMW和一个相关的复合配方β地中海贫血可以显著提高血液参数(14,16),导致住宅水平升高的患者治疗12周AMW或复合配方。与丁酸政府相比,感应是持久,不抑制红细胞细胞。地中海贫血是一种血液疾病和一些中药制剂已报告改善贫血病人的血液参数(17]。更具体地说,Plastrum testudinis已被证明诱导γ球蛋白表达红细胞细胞(未发表的数据)。

根据中医理论和观察到的影响在体外和在活的有机体内,我们开发了一个AMW配方和AMW相结合,CPG, TPG配方β地中海贫血的治疗。作为这项研究的一部分,我们报告AMW治疗或12周显著影响G的复合配方γ球蛋白mRNA水平和增加磷酸化p38 MAPK水平没有伴随总p38 MAPK信使rna和蛋白质含量的变化。这些结果表明,AMW和复合配方γ球蛋白gene-inducing试剂。多个受体,然而,由于中医目标明确的行动机制往往难以识别。需要更大规模的研究来证实我们的初步结果有关γ球蛋白基因诱导和改善贫血的发生。此外,我们相信,额外的因素包括铁负载,β地中海贫血的并发症,如肝脾肿大,心脏衰竭,生长发育迟缓,和长期安全、剂量优化和治疗方案有关中医也值得探索。因此,治疗AMW和复合配方可以诱导Gγ球蛋白基因表达体内。这种感应可能会刺激住宅合成和增强患者总血红蛋白水平β地中海贫血。此外,独立研究由我们组和另一组中使用的代理证明在当前的研究中使用的治疗方案不引起这些住宅刺激现象通过细胞毒性机制(21,31日]。因此,我们认为,住宅综合刺激通过p38 MAPK信号通路可能发生。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Zhuoming陆设计研究,招募和治疗的患者,进行了分子生物学实验,分析数据,撰写的手稿。新华社钱与研究设计协助,病人招募和治疗,分子生物学实验。Chunhong张、陈Zhiwen和光亮如杜协助招聘和治疗的病人和分子生物学实验的执行。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

本研究支持由广东省中医药管理局,广东,中国(2010285和2010285号),和广东省自然科学基金(没有。2015 a030310311)。特殊合作资助从广东省科技部(没有。2011 b032200002)资助这项研究。作者感谢徐(从广州Qenequick生物技术)尾戒缠住先生为他的援助与分子生物学实验。