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振宇吴，盛世张，裴李，小宗·鲁，嘉嘉王，鲁清赵，岳琪王那 “效果Aurantii Fructus immaturus flavonoid对大鼠离体胃平滑肌条收缩的影响“，基于证据的互补和替代医学那 卷。2016年那 文章ID.5616905那 7. 页面那 2016年． https://doi.org/10.1155/2016/5616905/5616905/5616905/5616905
效果Aurantii Fructus immaturus flavonoid对大鼠离体胃平滑肌条收缩的影响
摘要
本研究旨在调查效果Aurantii Fructus immaturus flavonoid（AFIF）上分离胃平滑肌在大鼠中的收缩，并探讨其底层机制。大鼠胃窦分离纵向平滑肌条（ALSMS）和幽门环形平滑肌条（PCSMS）悬浮于组织腔室。观察ALSMS和PCSMS到AFIF给予的答复。环鸟苷酸（cGMP）和蛋白激酶PCSMS的G（PKG）水平通过ELISA试剂盒测定。在这项研究中，AFIF显示对ALSMS收缩没有显著影响，但剂量依赖性地降低PCSMS的平均收缩幅度。当AFIF浓度达到3000时g / ml，6000 g / ml，和10000 G / ml，其对PCSMS收缩的抑制作用显着。AFIF的这种效果在CA中削弱了2＋- 丛生的环境。和n-Nitro-L-精氨酸甲基（L-名称），一氧化氮合酶（NOS）的抑制剂，与对照相比，显着抑制AFIF的作用（）.经AFIF孵育30 min后，PCSMS中cGMP和PKG水平较对照组显著升高(）.我们的研究结果表明，AFIF对大鼠PCSMS具有剂量依赖性舒张效应，这可能与NO / CGMP / PKG / CA的调节途径有关2＋．
1.介绍
功能性消化不良(FD)是一种疾病，定义为在罗马没有任何器质性、全身性或代谢性疾病的情况下，餐后持续或复发的上腹部不适和上腹部疼痛标准(1］．据系统回顾，FD在世界范围内的患病率为11.5%~14.5% [2，并显著降低患者的生活质量[3.那4.］．胃排空功能障碍被认为是FD的致病因子之一，并导致这种疾病的主要临床症状[5.］．不幸的是，现有的促动力药仍不能令人满意，促进FD的症状。
最近，中国草药的治疗效果及其对FD提取的效果已经密切关注[6.］．Aurantii果实immaturus（AFI），干果柑橘橙l .,柑橘sinensis.藿香，是治疗胃肠疾病的主要中草药之一。先前的研究表明，AFI有助于治疗FD [7.］．作为“AFI”的主要有效成分[8.]，Aurantii Fructus immaturus flavonoid（AFIF）可以在FD大鼠促进胃排空过程[9.］．然而，AFIF治疗效果的机制尚不清楚，并且尚未报道AFIF对分离的胃肌肉条的作用。
如我们所知，Antrum和Pylorus是胃排空过程中的两个重要功能单位。胃排空过程的正常行为取决于肛门肌肉的收缩，幽门肌的放松，以及这两个功能单元的协调。NO / CGMP / PKG的途径有助于通过调节CA来调节胃肌肉收缩2＋大量涌入的过程。
在本文中，我们研究了AFIF对隔离胃窦肌条及幽门肌条行动大鼠研究是否能促进胃窦肌肉收缩或减弱幽门肌肉收缩。要探索和外钙内流AFIF的动作之间的连接2＋，我们研究了Afif在不同的CA中的行动2＋环境。为了探讨基于NO / CGMP / PKG途径的AFIF的动作机制，我们研究了L-NAME对AFIF的作用的影响，并测量了AFIF孵育后肌肉条的CGMP和PKG水平。
2.材料
2．1.动物
雄性Sprague-Dawley大鼠从重要的河流实验室，中国和体重290-310克获得。将这些动物在合适的条件下（在22℃并喂养AD Libitum）中。该研究根据国家医疗学研究所的护理和使用实验室动物研究所的原则进行，并从北京中医学院当地伦理委员会收到许可。
２.２.药品和试剂
AFIF（批号：20140305，由江西庆丰药业有限公司制造和识别的药物管制）分别用克雷斯溶液分配成不同浓度。使用以下试剂：乙酰胆碱（批号：A6625，Sigma-Aldrich Co.LLC），Neostigmine Bromide（批号：N2001，Sigma-Aldrich Co.LLC），阿托品硫酸盐（批号：1306281，北京传统医院中医），和-硝基- l -精氨酸甲基(L-NAME，批号:N5751, Sigma-Aldrich Co. LLC)。在mmol/L条件下，克雷布斯溶液的组成为:NaCl 120.6、KCl 5.9、NaH2宝4.1.2，Mgcl.21.2，碳酸氢钠3.15.4, CaCl22.5和c6.H12O.6.11.5。大鼠循环鸟苷一磷酸（CGMP）ELISA试剂盒（批号：KGE003，研发系统）和大鼠蛋白激酶G（PKG）ELISA套件（批号：EY-（ELA）-2763，上海易燕生物科技有限公司中国）用于衡量CGMP和PKG的水平。
2.3。仪器
CH-1015超级恒温浴是来自中国上海粤兴科学仪器有限公司。流动设备来自AD仪器，澳大利亚：MLT 02021D外部等距力传感器，PL 3508-0028四通道记录器，ML 0146 / C-V PANLAB四室器官浴，ML110 PowerLAB放大器和PowerLAB / 4SP数据处理和分析系统。
3.方法
3．1.组织准备
所有老鼠都被禁食20小时，并免费获得水。每只老鼠都被打得失去知觉，整个胃被切除。沿大曲度开胃，用克雷布斯溶液冲洗。平行于窦腔纵向纤维切割的肌条(8 mm × 2 mm)命名为窦腔纵向平滑肌条(ALSMS)，平行于幽门环形纤维切割的肌条(8 mm × 2 mm)命名为幽门环形平滑肌条(PCSMS) [10］．除去粘膜的每个条带悬浮在含有15ml克雷布溶液的组织室中，通过在37℃下循环水循环并提供95％o的混合气体恒温恒温。2和5％的co2．每条条的一端固定在腔室底部的钩子上，另一端通过螺纹连接到顶部的外部等距力传感器(MLT 02021D)。每条施加1g负荷张力，用15ml Krebs溶液每15分钟冲洗一次。利用PL 3508-0028四通道记录仪同时记录带材收缩情况，利用PowerLab/4SP数据处理分析系统进行分析。平衡1 h后得到一个稳定的基线，其平均收缩幅度被识别为100%，5μ.加入生理盐水(NS) L作为对照(AFIF浓度为0μ.g / mL)。每次实验前均进行组织准备。
3.2。实验
3.2.1。AFIF对胃平滑肌条收缩的影响
每隔5 min向浴液中连续加入AFIF，使每个腔室的AFIF累积浓度达到3μ.g / mL, 30岁μ.g / ml，300 μ.g / ml，3000 μ.g / ml，6000 μ.g / ml，和10000 μ.克/毫升逐步;每个条带的收缩幅度和收缩频率进行观察。
3.2.2。细胞外CA的影响2＋集中在AFIF的行动
15 mL of Ca2＋缺少克雷布斯溶液(Ca2＋浓度为1.25mmol / l）或ca2＋-rich krebs解决方案（CA2＋浓度为5mmol / l）被放入每个腔室而不是正常的krebs溶液（CA.2＋浓度为2.5 mmol/L)。然后以5 min为间隔，在每个浴槽中连续添加AFIF，使每个腔室的AFIF累积浓度达到3μ.g / mL, 30岁μ.g / ml，300 μ.g / ml，3000 μ.g / ml，6000 μ.g / ml，和10000 μ.克/毫升。观察到PCSMS收缩幅度和收缩频率。
3.2.3。AFIF对胃肌条异常收缩的作用
氯化乙酰（0.35 μ.mol / L),新斯的明(1μ.摩尔/ L），或阿托品（1 μ.将Mol / L）分别向浴中加入浴，诱导PCSMS在AFIF施用之前的异常收缩。然后以5 min为间隔，在每个浴槽中连续添加AFIF，使每个腔室的AFIF累积浓度达到3μ.g / mL, 30岁μ.g / ml，300 μ.g / ml，3000 μ.g / ml，6000 μ.g / ml，和10000 μ.克/毫升。观察到PCSMS收缩幅度和收缩频率。
3.2.4。L-NAME对AFIF作用的影响
条带用L-NAME (10-4mol/L) 20 min后给药。然后在每个浴槽中以5 min为间隔连续添加AFIF，使每个室中AFIF的累积浓度达到3000μ.g / ml，6000 μ.g / ml，和10000 μ.克/毫升。观察到每个PCSMS的收缩幅度。
3.2.5。AFIF对胃肌条cGMP和PKG水平的影响
AFIF (6000μ.在孵育30分钟后，将G / ml）或Ns加入含有Pcsms的每个腔室中。然后测量这些PCSMS的CGMP和PKG水平。根据ELISA试剂盒的说明进行测试程序。
3.3。统计分析
通过单向分析或独立分析所有实验数据。-test使用SPSS 20.0软件(SPSS, Chicago, IL, USA)，用mean±SD表示。被认为是统计学意义的。
结果
4.1。Afif对Alsms的收缩没有显着影响
Afif的给药既不影响平均缩小幅度（图1和2）也不是平均收缩频率（表1和图2）Alsms。
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4.2。AFIF对PCSMS的平均收缩幅度具有浓度依赖性的抑制作用，这与CA负相关2＋浓度
与对照组相比PCSMS的平均收缩幅度降低由AFIF治疗。AFIF的这种作用是浓度依赖性，这成为显著当AFIF浓度达到3000 μ.g / ml，6000 μ.g / ml，和10000 μ.g / ml（那） （桌子2和图4.）.AFIF对PCSMS的舒张作用在Ca中最为明显2＋-缺乏环境，钙含量高2＋浓度显著减弱AFIF的行动（） （数字3.和4.）.
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| 和与对照。 |
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4.3。AFIF（10000 μ.g / ml）显示了PCSMS平均收缩频率的抑制作用
AFIF在PCSMS的平均收缩频率上显示出浓度依赖性抑制作用，但仅当AFIF的浓度达到10000时 μ.克/毫升（表3.）.
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| 与对照。 |
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4.4。AFIF可纠正乙酰胆碱和新斯的明诱导的PCSMS收缩幅度增强，进一步降低阿托品诱导的PCSMS收缩幅度减弱
预处理乙酰胆碱氯化物（0.35 μ.mol/L)和新斯的明μ.mol/L)增加PCSMS的基线收缩幅度，阿托品(1μ.mol / l）降低了它。AFIF校正了乙酰胆碱或Neostigmine诱导的PCSMS的增强收缩，并进一步降低了阿托品诱导的PCSMS的减少幅度（表4.）.
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| 和对预处理。 |
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4.5。AFIF对乙酰胆碱，Neostigmine或Atropine的预处理后PCSMS的平均收缩频率没有显着影响
AFIF对预处理后PCSMS的平均收缩频率无明显抑制作用(表1)5.）.
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4.6。L-NAME明显减弱AFIF的行动上PCSMS的收缩幅度
与NS(对照)相比，L-NAME (10-4 mol/L, 20 min) significantly reduced the relaxation of PCSMS induced by AFIF (Figure5.）.
4.7。AFIF明显增加PCSMS的cGMP和PKG水平
AFIF (6000μ.g / ml）孵育30分钟，显着增加了ELISA试剂盒测量的CGMP和PKG水平的PCSMS（那） （桌子6.）.
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| 和与对照。 |
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5.讨论
最近，中国草药已被密切关注作为功能性脱节的有效治疗[6.]，以及它们中的一些已被证明调节肠胃分离的肌条收缩[10-12］．AFI是芸香科植物的一种，中医学称为“治实”，用于“补气出脾”，改善消化不良症状。它已被证明能促进胃排空过程[13]并成为治疗功能性消化不良的常用药物。它还通过体外实验进行了验证，即AFI降低了大鼠中分离的胃肌肉带的收缩性[14］．AFIF，AFI的主要有效成分[8.]，已上报促进胃排空大鼠以及[9.］．然而，AFIF的治疗效果的机制尚未澄清，AFIF对分离的胃肌肉肌肉的作用尚未公布。
胃排空功能障碍被认为是在功能性消化不良的重要的致病因子，其诱导FD [临床症状5.那15］．但是，现有的促动力剂并不总是令人满意促进FD患者的胃排空进程。最近的研究证实，一些FD患者胃收缩是超了而不是减少[16]，高幽门包油能量会导致胃排空功能障碍[17那18］．一些专家认为，幽门是抵抗的胃排空过程的独立单元[19]而且放松的幽门括约肌是一种可行的方法来调节胃肠蠕动和改善FD症状[20.］．
如我们所知，细胞内Ca2＋平衡是维持正常的收缩和松弛平滑肌的基础。细胞外CA2＋可以通过肌肉细胞充电或排出通过细胞膜，导致细胞内Ca的增加或减少2＋浓度，导致平滑肌的收缩或放松。众所周知，一氧化氮（NO）是消化道运动的消化道中最重要的调节因子之一。它激活细胞内胍基环化酶以催化三磷酸三磷酸（GTP）并产生CGMP，进一步激活PKG以防止细胞外CA的涌入2＋并诱导细胞内钙离子减少2＋浓度，引起平滑肌松弛。报告的研究还表明，NOS降低钙2＋通过上调cGMP水平在肌细胞中的浓度[21］．
先前的动物实验证明，AFIF在血清中上调不浓度[22]和NO可通过抑制幽门的收缩[加速胃排空23］．根据最近的一项研究[24]，枳壳果实，与AFI密切相关的芸香科另一成员，可以减少实验动物的平滑肌收缩，而L-NAME可以显著抑制这一作用。
在这项研究中，AFIF对ALSMS的收缩没有显示出任何显着影响，但它显示了对PCSMS的自发收缩的浓度依赖性抑制作用。当其浓度达到3000时，AFIF对PCSMS的平均收缩幅度的抑制作用显着 μ.g / ml，6000 μ.g / ml，和10000 μ.克/毫升。当其浓度达到10000时，对PCSMS收缩频率的影响才显著μ.克/毫升。在另一个实验中，我们使用Ach和新斯的明诱导PCSMS收缩的增强，可以部分模拟幽门的异常增强收缩。在本实验中，AFIF有效地纠正了PCSMS收缩的病理状态。我们的研究还表明，AFIF的作用与Ca呈负相关2＋结果表明，AFIF对PCSMS的舒张作用可能与抑制细胞外Ca有关2＋流入和下调细胞内Ca2＋专注。我们的研究结果还表明，L-NAME显着减弱了AFIF对PCSMS收缩的舒张效果。和afif（6000 μ.G / ml）孵育显着增加了PCSMS中CGMP和PKG的水平。这些结果表明，通过激活NoS和Upring CGMP和PKG水平来实现AFIF在PCSMS上的舒张效应。然而，在该过程中的AFIF的具体组成仍然仍有待进一步研究。
6。结论
作为AFI的主要有效组成部分，AFIF对PCSMS具有舒张性作用。AFIF的这种效果与激活NOS，上调CGMP和PKG水平密切相关，下调细胞内CA2＋浓度平滑肌。我们的研究可以部分阐明AFIF在待遇FD中的行动的机制，为互补和替代疗法提供一些想法。
利益争夺
两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。
致谢
本研究由以下资助者提供支持：（1）北京市科技委员会项目（Z131100002513012）;（2）北京市政医院临床医学发展项目（Zylx201411）;（3）中国国家自然科学基金（81503514号）。
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