文摘

Bakuchicin furanocoumarin隔绝补骨脂并展示了几种生物活性。尽管有研究bakuchicin的生物效应,其调制的力量CYP活动以前没有调查。在这里,我们调查的抑制性影响bakuchicin CYP亚型的活动通过使用探针底物的鸡尾酒汇集人类肝脏微粒体(高)和人类的重组cDNA-expressedCYP。Bakuchicin强烈抑制CYP1A-mediated非那西汀O-deethylation与集成电路₅₀值为0.43μ米高。它证实了人类重组cDNA-expressedCYP1A1和CYP1A2值为0.11μM和0.32μM,分别。Lineweaver-Burk图表明,抑制机制bakuchicin竞争性抑制。总的来说,这是第一个研究调查潜在的CYP1A1和抑制CYP1A2 bakuchicin和报告对高级别竞争抑制的影响。

1。介绍

细胞色素P450 (CYP)是一组heme-containing酶嵌入在内质网的脂质双分子层,和它的作用在许多药物的新陈代谢,类固醇,和致癌物质1]。他们主要为生物转化的外源性物质更容易从疏水状态可抽出的亲水形式(2]。CYP的规定活动的主要原因是药物之间或herb-drug交互(3]。此外,控制摘要经常导致药物不良作用在癌症治疗(4]。

的CYP1A亚由两名成员CYP1A1和CYP1A2。CYP1A是人类的一个重要CYP亚科和扮演一个角色在一些临床使用药物的代谢包括茶碱,氯氮平,他克林、食源性前致癌物5]。的CYP1A亚由两名成员CYP1A1和CYP1A2。CYP1A1等额外的肝组织的发现主要是肺、胃肠道、胎盘和皮肤(6]。CYP1A1不是明显表现在肝脏,而CYP1A2表达主要在肝脏7]。然而,多环芳烃(多环芳烃)显著诱导CYP1A1的表达在肝脏,肺,肾,肠道的老鼠8]。CYP1A1、著名的芳基碳氢化合物羟化酶是参与环境前致癌物的代谢活化。CYP1A2,人类肝脏的主要cyp之一(~ 13%),响应各种芳基胺和杂环芳基胺的代谢在治疗药物9,10]。特别是CYP1A亚历来被认为扮演了一个重要的角色在许多前致癌物的bioactivation包括多环芳烃、杂环芳香胺,真菌毒素(9,11]。具体的抑制CYP1A都集中在潜在的癌症预防和治疗药物的发展(6,9,12]。

Bakuchicin furanocoumarin孤立的种子补骨脂已被用于东方医学(13)(图1)。它有几个生物效应包括antivasorelaxant效应由硝酸oxide-cyclic GMP (NO-cGMP)信号在大鼠主动脉环(14),抗菌活性与细菌数量(15),和抗肿瘤效应引起的强烈的DNA聚合酶抑制16]。虽然bakuchicin曾被研究过的药理作用和选择性抑制的影响其结构类似的类似物,补骨脂素和isopsoralen,调查,其CYP活动的影响还没有被研究过,直到现在(图1)[17]。在这里,我们调查的选择性抑制作用bakuchicin CYP1A在人肝微粒体(高),并演示了其竞争性抑制。

2。材料和方法

2.1。材料

Bakuchicin(化学纯度> 99.8%)被隔绝p .骨脂(图1)[13]。池高级别(BD UltraPool™高150®)和人类的重组cDNA-expressedCYP1A1和1 a2得到从康宁绅士(沃本,MA)。非那西汀、香豆素、安非他酮、紫杉醇、奥美拉唑、双氯芬酸,右美沙芬,chlorzoxazone,咪达唑仑,葡萄糖6-phosphate,β烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(βnadph)和葡萄糖6-phosphate脱氢酶从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)。所有其他化学试剂均为分析纯,被用来作为收到。

2.2。选择性抑制Bakuchicin CYP1A

bakuchicin的抑制性影响新陈代谢的8种不同的表列出CYP-specific基质1(18]。孵化项目都是在重复执行和数据表现为手段。短暂,每个反应都表现为0.5毫克/毫升汇集人类肝脏微粒体在最后孵化量0.1毫升。孵化介质由0.1米磷酸钾缓冲(pH值7.4)包含鸡尾酒的探针底物和NADPH-generating系统(上天)葡萄糖6-phosphate 0.1米,10毫克/毫升βnadph, 1.0 U /毫升glucose-6-phosphate脱氢酶。探讨IC₅₀期间bakuchicin CYP1A抑制bakuchicin(0-25的最终浓度μ米)是没有预孵化,孵化。此外,该混合物与bakuchicin preincubated 15分钟没有探测衬底鸡尾酒在1毫米的存在与否βnadph。后的反应是由为60分钟,添加捷孵化样本通过添加100年终止μ包含0.1%甲酸和2.5 L乙腈μL(内部标准溶液(5μ利血平)在甲醇。离心法和混合后在13000 g×12分钟,5μL整除注射到C18柱质/ MS分析。

2.3。在高抑制模式Bakuchicin CYP1A活动

的抑制模式CYP1A bakuchicin, 0.5毫克/毫升的高级别是孵化与bakuchicin 0, 0.2, 0.4和0.8μ米0.1米磷酸钾缓冲(pH值7.4)为60分钟37°C。这些都是通过添加100年终止μ包含0.1%甲酸和2.5 L乙腈μL(内部标准溶液(5μ利血平)在甲醇。离心法和混合后在13000 g×12分钟,5μL整除注射到C18柱质/ MS分析。非那西汀被用作探针底物在20岁或80μm .抑制模式被Michaelis-Menten及其二次策划研究。

2.4。对人类重组Bakuchicin失活的影响cDNA-ExpressedCYP1A1和CYP1A2

确认的选择性抑制CYP1A bakuchicin, 10 pmol人类重组cDNA-expressedCYP1A1和孕育了CYP1A2 bakuchicin 0.1 -50μ米和门店60分钟37°C的后80μ非那西汀作为选择性CYP1A衬底。这些都是通过添加100年终止μ包含0.1%甲酸和2.5 L乙腈μL(内部标准溶液(5μ利血平)在甲醇。离心法和混合后在13000 g×12分钟,5μL整除注射到C18柱质/ MS分析。CYP1A1和CYP1A2活动是由非那西汀O-deethylation。的抑制模式bakuchicin CYP1A在人类重组cDNA-expressedCYP1A1和CYP1A2经Michaelis-Menten和次要情节。

2.5。质/ MS分析

所有测量进行使用质/女士多反应监测模式。使用一个Accela质/女士了™LC系统耦合TSQ有利的三重四极质谱仪(美国热费希尔科学Inc .)配有HESI-II喷雾源。电喷雾电离积极执行模式的喷涂电压3500 V(除了检测6-hydroxy chlorzoxazone)。氮被用作鞘和辅助气体的最佳值45和20(任意单元),分别。汽化器和毛细管温度是150和300°C,分别。LC分析一个Inertsil®ODS-2 (3μ米,2.1×150毫米)列(GL科学Inc .托兰斯,CA)是使用。流动相是由乙腈(流动相)和水(流动相B),两者都含有0.1%的甲酸,在0.22毫升/分钟的流量在30°C。

2.6。数据分析

孵化项目都是在重复执行和数据表现为手段。集成电路₅₀值(抑制剂的浓度导致酶活性抑制50%)得到使用活动和日志(百分比我)浓度的情节。动力学参数估计通过曲线拟合使用SigmaPlot(版本12.0,Systat软件有限公司)。

3所示。结果

3.1。Bakuchicin抑制性的影响问题

调查的抑制性影响bakuchicin 9 CYP亚型的活动,我们进行了CYP抑制化验使用探针基质混合物加上一个质/ MS系统。的集成电路₅₀值bakuchicin CYP 8日活动是确定有或没有微粒体预孵化为15分钟37°C预测bakuchicin的抑制机理。CYP2D6 CYP2B和抑制,但CYP1A最强烈抑制高相对于其他cyp IC₅₀值为0.43μM(表1)。因此,bakuchicin选择性地抑制CYP1A-catalyzed非那西汀O-deethylation高级别。

3.2。竞争性抑制的CYP1A Bakuchicin高级别

在表1,集成电路₅₀的bakuchicin CYP1A-catalyzed非那西汀O-deethylation活动确定有或没有预孵化为15分钟37°C探讨抑制机制。在没有预孵化,IC₅₀CYP1A bakuchicin的值为0.43μ米,而集成电路₅₀值为0.22μ预培养后要么有或没有βnadph在池高级别(表1)。没有IC的重大变化₅₀预培养后,有或没有βnadph表明bakuchicin可逆抑制剂的CYP1A-catalyzed非那西汀O-deethylation。此外,调查机制抑制CYP1A-catalyzed非那西汀O由bakuchicin -deethylation CYP1A抑制活动决心根据预培养时间0-20分钟在高37°C。Bakuchicin强烈和剂量依赖性抑制CYP1A-catalyzed非那西汀O-deethylation,但不含时抑制在高级别(图2)。

CYP1A机制抑制bakuchicin决心使用Lineweaver-Burk图(图3)。通过测量获得的动力学是CYP1A-catalyzed非那西汀O-deethylation bakuchicin(0)的存在,0.2,0.4,0.8μM(图3(一个))。Bakuchicin被发现是一个可逆的竞争性抑制剂和值(0.09μ米)计算从次要情节CYP1A(图3 (b))。

3.3。选择性抑制Bakuchicin CYP1A1

调查的选择性抑制的影响bakuchicin CYP1A1和CYP1A2 bakuchicin与人类重组孵化cDNA-expressed分别CYP1A1和CYP1A2(图4)。Bakuchicin CYP1A1-catalyzed减少非那西汀O-deethylase活动集成电路₅₀值为0.2μ米,而集成电路₅₀是1.4μ美元CYP1A2-catalyzed非那西汀O-deethylase活动是7倍高于CYP1A1的值(图4)。

的抑制模式bakuchicin CYP1A1和CYP1A2证实了动力学研究在人类重组cDNA-expressedCYP1A1和CYP1A2(图5)。Lineweaver-Burk情节是通过人类重组的动力学研究cDNA-expressedCYP1A1和CYP1A2-catalyzed非那西汀O-deethylation bakuchicin的浓度在0,0.2,0.4,0.8μ分别为M(图5(一个))。模式表明bakuchicin竞争性抑制剂,和它的价值CYP1A1计算从次要情节是0.11μ米,而其价值CYP1A2是0.32的三倍μM(图5 (b))。这表明bakuchicin抑制CYP1A1比CYP1A2在高选择性。

4所示。讨论

的CYP1A亚科是众所周知的参与bioactivation和致癌物的解毒19]。CYP1A1也扮演着重要的角色在褪黑素的生物转化,花生四烯酸、二十碳五烯酸,营养基质和环境致癌物20.- - - - - -22]。CYP1A2与芳基胺氧化是重要methylxanthines如咖啡因和茶碱的脱甲基,O脱甲基萘普生、羟基化的他克林、ropivacaineR华法林和咖啡因、非那西汀的脱烷基化作用和脱甲基的三环类抗抑郁药(10,23,24]。此外,CYP1A2是参与代谢的药物约20%的临床代谢药物如用于长期治疗精神分裂症和抑郁症的25- - - - - -27]。因为CYP1A广泛参与药物代谢、选择性抑制CYP1A1和CYP1A2是重要的底物,防止CYP-related的药物之间的相互反应主要经历CYP1A-mediated新陈代谢。

此外,CYP1A1催化代谢活化致癌多环芳烃亲电试剂反应的啮齿动物(28]。为例子,苯并芘及二苯并蒽、苯并[h]荧蒽和激活CYP1A1形成环氧化物中间体,它们进一步激活形成二醇环氧化合物(29日]。杂环胺也是代谢的代谢活化CYP1A1 [10]。羟基化的位置N2 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo (4、5 b)吡啶(PhIP) CYP1A1发起PhIP-DNA加合物的形成,导致致癌作用(11]。因此,抑制CYP1A1活动为了抑制CYP1A1-mediated致癌活性中间体的形成一直关注小说在化学预防策略。

CYP1A bakuchicin的抑制作用是预测结构类似物的抑制作用,补骨脂素,isopsoralen [17]。补骨脂素和isopsoralen确认为可逆时间抑制剂在人类和大鼠肝微粒体。在目前的研究中,我们调查了选择性抑制bakuchicin CYP1A在汇集问题的影响。这证实了选择性抑制CYP1A-catalyzed非那西汀O-deethylation在高级别,和人类的重组cDNA-expressedCYP1A1和CYP1A2。在高级别,bakuchicin显示模式的可逆的竞争性抑制剂值为0.09μCYP1A M。此外,Lineweaver-Burk阴谋表示bakuchicin是竞争性抑制作用的抑制机理值为0.11μM和0.32μ米在人类重组cDNA-expressedCYP1A1和CYP1A2,分别。理解herb-drug交互的基本机制不仅在预防药物毒性很有用,但也在发展中新的癌症预防治疗。本研究表明,CYP1A基质代谢的药物,尤其是在高剂量或当有草的积累,可能是重要的metabolism-based herb-drug相互作用[30.,31日]。

p .骨脂是一种重要的药用植物广泛用于传统医学在中国、印度和美国作为一个强心剂,血管舒张,pigmentor,抗肿瘤、抗菌、细胞毒素,或打虫药28]。提取Bakuchicin (1.51 g)p .骨脂水果粉(300克)的乙醇萃取(32]。bakuchicin的浓度在活的有机体内可以依赖环境中的可变性,制备方法,或病人。因此,重要的是要识别的调制效应bakuchicin CYP活动问题。总之,我们是第一批调查与bakuchicin相关的潜在herb-drug交互通过评估其在高级别CYP1A抑制性影响。我们的研究表明,bakuchicin是一个强大和有选择性的竞争性抑制剂CYP1A1和CYP1A2高级别。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究得到了美国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府(NRF - 2012 r1a4a1028835)和基础科学研究项目通过NRF由科技部、ICT和未来规划(NRF - 2013 r1a1a2021751)。