薄层Chromatography-Bioautography和抗菌叶提取物菲律宾的气相色谱分析-质谱法Piper betlel对耐多药细菌

文摘

本研究分离和确定了菲律宾的抗菌化合物Piper betlel .叶乙醇提取物的薄层色谱(TLC)生物自显影法,气相色谱分析-质谱法(gc - ms)。最初,叶乙醇提取物的薄层色谱分离提供了最大的八个化合物值为0.92,0.86,0.76,0.53,0.40,0.25,0.13,和0.013,最好的可视化在检查下UV 366海里。琼脂覆盖生物自显影法分离的化合物演示了两个点0.86和0.13的值显示抑制活动对两种革兰氏阳性细菌耐多药(MDR),即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和vancomycin-resistant肠球菌。的化合物值为0.86对革兰氏阴性细菌MDR也具有抑制活动,即特拉肠杆菌科-肺炎克雷伯菌和金属-β-lactamase-producing鲍曼不动杆菌。gc - ms进行了识别和半挥发性的挥发性化合物存在于叶乙醇提取物。6个化合物,4个新化合物,尚未在医学文献中提到的。化合物分离包括diazoacetate乙酯、三羟甲基氨基甲烷(trifluoromethyl)磷化氢,液heptafluorobutyrate, 3-fluoro-2-propynenitrite, 4 - (2-propenyl)苯酚和丁香酚。这项研究的结果可能会导致新的治疗制剂的发展能够处理特定疾病削弱了反应或者目前不适应现有药物。

1。介绍

Piper betlel .属于家庭胡椒科是一个攀岩葡萄树中使用替代疗法由于其众多的治疗特性,包括其抗菌,抗真菌,抗氧化,细胞毒性,antihelminthic, antiprotozoal,治疗糖尿病药,王亚南,免疫调节特性1]。已知植物广泛分布在印度、斯里兰卡、马来西亚、印度尼西亚、泰国、中国、菲律宾和其他亚热带国家2]。据报道有广谱抗菌活动对不同菌株(1)和真菌(3,4]。

我们的先前的研究结果已经证明了的巨大潜力p . betle治疗耐多药(MDR)的细菌5,6]。的12个菲律宾药用植物抗菌化验,p . betle对所选MDR隔离(异常呈现显著的抑制效果5]。此外,抗菌活性的乙醇,甲醇,超临界CO₂摘录p . betle测定在临床分离的耐多药细菌已被美国传染病学会是在目前在临床管理更具挑战性的菌株。使用的分析方法研究包括标准纸片扩散法和肉汤采用微量法测定的最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)提取的测试微生物。这项研究揭示了杀菌的所有活动p . betle叶粗提取物MBC从19μ克/毫升到1250μ克/毫升。提取物被证明对革兰氏阳性耐甲氧西林更有效金黄色葡萄球菌(MRSA)和vancomycin-resistant肠球菌(VRE)比革兰氏阴性细菌测试。VRE隔离更容易比耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离提取。一般来说,乙醇提取物被证明是更有效的比甲醇提取和超临界CO₂提取所示的革兰氏阳性和革兰氏阴性mdr低中等收入国家。在这种情况下,一项调查的功效p . betle作为抗菌药物的来源是由获得执行它的抗菌化合物的分离和鉴定。

虽然有一些研究关注的植物化学p . betle不同结果,有关于植物的成分或生物活性化合物,暗示的栖息地在药用植物的植物化学中起着重要作用。其中一个文档是当地的一项研究在菲律宾的p . betle,观察到与印度各种精油的主要成分和醚溶性部分菲律宾p . betlechavibetol和chavibetol醋酸,而allylpyrocatechol是叶子的主要成分7]。信息特定药物活性成分的药用植物和随后的重要化合物的分离是至关重要的在寻找新的治疗药物。在治疗MDR细菌的新方法的发展,我们应该能够识别哪些生物活性化合物负责显著拮抗效应对这种病原体,考虑行动的机制和可能的毒性。

几个光谱和色谱分析方法已经开发标准化的产品,从药用植物,包括质谱(MS)、气相色谱分析-质谱法(gc - MS)、液相色谱(LC)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC),和高性能薄层色谱法(效果),以保证其质量,有效性和安全性(8]。

确定生物活性天然产物在植物提取物、生物测定方法的选择是至关重要的。生物测定测试应该是敏感、可靠、简单,提示(9]。类型的提取方法,提取时间,温度,溶剂的极性影响使用质量和生物活性成分的浓度与原料(2,10]。Activity-guided分馏是至关重要的,因为所有分数应该彻底检查和监控,检测或识别高活性化合物进行进一步的分离和净化,直到活跃monosubstances得到[9]。

本研究旨在确定和隔离的抗菌化合物p . betle提取使用薄层色谱、琼脂覆盖和接触(间接)bioautographic化验和识别半挥发性的,并使用气相挥发性化合物。

2。材料和方法

2.1。植物材料的收集和准备

的叶子p . betle收集马德雷山脉山脉脚下的直辖市通用Nakar奎松城,菲律宾。植物被确认和验证穆维拉桑托斯纪念生物学研究所的植物标本,菲律宾大学Diliman,菲律宾奎松市。树叶被彻底清洗,然后风干在室温下七天,粉末状,并存储在无菌密封容器,直到进一步的使用。

2.2。制备乙醇叶提取物

粉干的叶子p . betle依法提取方法Basri和风扇11与一些细微的修改。简而言之,150克粉植物材料浸泡在500毫升乙醇七天偶尔搅拌然后使用绘画纸滤纸过滤1号(英国绘画纸有限公司)。滤液减压下集中使用一个旋转蒸发器在50°C。原油乙醇提取收集并被允许在室温下干燥。股票的解决方案是由在DMSO溶液溶解干提取1×10⁵µ克/毫升浓度。

2.3。耐多药菌株(MDR)

本研究中使用的耐多药菌株:革兰氏阳性MDR细菌,即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和vancomycin-resistant肠球菌(VRE);革兰氏阴性细菌耐多药,即特拉肠杆菌科(CRE)肺炎克雷伯菌和金属-β内酰胺酶(米βL -)生产鲍曼不动杆菌。这些耐多药菌株被分离从匿名病人承认马卡迪医疗中心和Ospital ng马卡迪。都是3级培训医院位于马卡蒂市,菲律宾。隔离都被自动生化测试用Vitek®女士(bioMerieux、马西l 'Etoile、法国)医生比色身份证。易感性的模式是通过Vitek女士AST (bioMerieux、马西l 'Etoile、法国)后麦克风M100-S24解释标准临床实验室标准研究所(12]。

2.4。薄层色谱法(TLC)

TLC系统(CAMAG)配备一个示例涂布用于应用程序的示例。5毫升的叶乙醇提取物分别应用在5厘米×10厘米色谱预镀硅胶板(默克,TLC年级)作为固定相。薄层色谱板是在一个双槽玻璃室含乙酸乙酯的混合物n己烷(7:3 v / v)为流动相。盘子被移除时,溶剂前已经从原来的15厘米提取位置,随后允许干燥。干燥后,开发板上的斑点在可见的(白色)可视化,短的紫外线(254海里),和长时间的紫外线光(366海里)。postderivatization,盘子被喷洒vanillin-sulfuric酸颜色反应和允许干燥。可视化工具和扫描仪用于photodocumentation在254纳米紫外线可见光和紫外线366海里,在之前和之后的应用vanillin-sulfuric酸喷。每个点的提取分离的运动是其表达的保留因子()。值计算为每个地方使用以下公式:

2.5。TLC-Contact(间接)生物自显影法技术

代表耐多药菌株的接种物1.5×10⁸CFU /毫升浓度,即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,VRE, MβL -答:baumannii,CREk .肺炎,擦洗到Mueller-Hinton琼脂板用于接触生物自显影法技术方法的采用楔和纳格尔(13用细微的修改。干TLC板与相应的斑点被放置无菌播种Mueller-Hinton琼脂板上覆盖无菌拭镜纸。TLC板被脸向下silica-coated一边用镜头纸接触均匀,孵化12至18小时4±2°C。然后,TLC板取出,接种琼脂板进一步孵化35岁±2°C 24小时在一个环境空气孵化器。抑制的区是观察并与薄层色谱板价值的结果。

2.6。TLC-Agar-Overlay生物自显影法技术

一毫升代表耐多药菌株为1.5×10⁸CFU /毫升浓度用于每10毫升Mueller-Hinton琼脂。开发的薄层色谱板被放置在一个无菌培养皿(150毫米)。文化是添加到融化Mueller-Hinton琼脂薄层是倒薄层色谱板。固化后的介质,采用薄层色谱板孵化24小时35岁±2°C。TLC-bioautography板喷了水溶液中(2.5毫克/毫升)的methylthiazol四唑(σ,美国)。明显抑制区观察到在一个紫色的背景下(14]。识别特定的化合物是有限的准备不可用的参考标准。

2.7。气相色谱分析-质谱法(gc - ms)

叶乙醇提取物的gc - MS分析了使用珀金埃尔默气(珀金埃尔默来说680 GC-Clarus平方8 t女士)配备Elite-5女士30米×0.25毫米×25µm毛细管柱(二甲聚硅氧烷二苯5%,95%)。gc - ms检测,电子电离与电离能70电动汽车系统。超纯氦气作为载气以恒定流量的1毫升/分钟。离子源、质量传递线和喷油器温度设定在230°C, 250°C,分别和290°C。烤箱温度从50到150°C编程3°C /分钟的速度,然后在等温条件举行10分钟,最后提高到250°C 10°C /分钟。在乙醇稀释样品(1/100,v / v)为1µL是在120年的分裂模式手动注射。质谱扫描范围是在45 - 450m / z,溶剂延迟2分钟。提取的组件被确定基于比较的GC相对保留时间和质谱与NIST女士搜索库软件2.0版。

3所示。结果与讨论

3.1。薄层色谱法(TLC)

分离和识别的生物活性化合物p . betle叶提取物、TLC最初是作为定性方法文档执行提取成分。这种方法被广泛用于单独的次生代谢物如茶多酚,类黄酮、皂苷、生物碱、类固醇,包括氨基酸、蛋白质、肽、激素和农药15]。尽管TLC不提供具体的测量,这是与其他技术结合使用时非常有效。在我们的研究中,薄层色谱p . betle叶乙醇提取物中最多显示9化合物的顺序递减值,如表所示1。五个乐队在可见光下的薄层色谱板可视化明显(图1(一)),6个乐队在短的紫外线辐射(254 nm波长),如图1 (b),8个乐队在长期紫外线辐射(366 nm波长),如图1 (c)从TLC板,和七个乐队喷洒vanillin-sulfuric酸试剂(图1 (d))。得到了最好的决议后,检查了紫外线照射下,衍生vanillin-sulfuric酸喷。化合物与值为0.92,0.86和0.13可视化TLC色谱。有趣的是,化合物0.70是明显的在所有的可视化方法,除了在长期紫外线辐射。

3.2。TLC-Bioautography

在琼脂覆盖和联系(间接)生物自显影法化验,抗菌活性的化合物分离TLC测定。

代表MDR细菌从每一组相应的类似的麦克风和MBC值显示在括号,即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(78μg / mL), VRE (19μg / mL), MβL -a . baumannii(312μg / mL), CRE -k .肺炎(312μg / mL),用于生物自显影法。显著的抗菌活性化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌证明了0.86和0.13的值在琼脂覆盖生物自显影法,显著的清除区明显的抑制在一个紫色的背景(图2)。在接触(间接)方法,只有复合0.86可见,显示为一大清除区抑制紫色背景喷洒methylthiazol四唑(图3)。相同的化合物还演示了对VRE是活动的,可以看到在琼脂覆盖生物自显影法结果图2。革兰氏阴性的抗菌活性,只有化合物对M值为0.86时表现出显著的活动βL -答:baumannii和CRE -k .肺炎(数据2和3)。结果,一种化合物值为0.86时被发现有抑制活动对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌耐多药。基于先前的研究对TLC的植物化合物,值0.86展出的黄酮类和萜类化合物,而值0.13展出的生物碱、皂苷和黄酮类化合物(16,17]。

的琼脂覆盖生物自显影法分析被证明是一个优秀的识别和定位的方法与具体抗菌活性化合物p . betle叶提取物,证明其价值在寻找新的抗菌药物。是适当的评估可以通过TLC分离的化合物,对细菌生长直接在TLC板。这个分析的优点是节省成本,快速、简单,需要一个简单的设置,少量的测试样品,和简单的解释结果,并与高样例输出。

3.3。gc - ms分析

六个挥发性和半挥发性的化合物p . betle叶乙醇提取物被确定基于比较的GC相对保留时间和质谱与NIST女士搜索库软件2.0版。确定的抗菌化合物包括乙diazoacetate, 4 - (2-propenyl)苯酚,丁香酚,三羟甲基氨基甲烷(trifluoromethyl)磷化氢,液heptafluorobutyrate和3-fluoro-2-propynenitrite(表2)。在先前的研究p . betle收集来自不同省份在菲律宾,即联盟,磨料,怡朗,巴拉望,Bukidnon,二十化合物被确定作为植物叶子精油的成分(4]。丁香酚是一种最高的化合物的保留时间,在gc - ms分析的结果同样显示在我们的研究中。另一个印度6个品种的研究p . betle显示出的几个化合物确定叶提取丁香酚同样被发现一个共同的和主要的化合物(18]。丁香酚已经记录了抗菌活性对各种植物和人类病原体,包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(19]。据报道,其作用机理是变形的大分子胞质膜所验证的傅立叶变换红外光谱(20.]。因此,高浓度的丁香酚的存在和丁香酚同分异构体的叶提取物可能是植物化学的特征之一p . betle品种,指出潜在的植物种类和品种的承诺这些微生物代谢产物与人类病原体的来源。的化学成分的变化p . betle提取提供了证据表明,生态条件的增长大大影响药用植物的生物活性属性和功能。

4所示。结论

这项研究的结果证实了存在的各种生物活性化合物在菲律宾的变体p . betle负责不同的生理或治疗活动。我们已经确定了两种化合物通过TLC-bioautography值0.86和0.13显示重大活动对选定的MDR细菌。这个结果指向的潜在开发新型抗菌药物治疗p . betle能够处理特定疾病或医疗条件,要么削弱反应或者目前不适应现有药物。通过gc - ms分析鉴定挥发性和半挥发性的化合物存在于叶乙醇提取物。深入的次生代谢产物在植物化学的分析p . betle,类黄酮、酚酸、生物碱、萜类、皂苷,正在进行中。未来的研究是针对纯化生物活性化合物的发展和安全浓度的定量测定,可用于改进现有药物或创建新的代理对MDR细菌。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者承认马卡迪医疗中心和Ospital ng马卡迪,马卡蒂市,菲律宾、临床细菌隔离用于这项研究。这项工作是财务支持的LVV教育研究基金会,Inc .,德牧l .山谷,小。

引用

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