基于HMG-COA还原酶的抗胰酸钾的胆固醇降低效应及其分子机制

摘要

本研究测定泽泻中药主要活性成分泽泻醇B 23-乙酸乙酯和泽泻醇A 24-乙酸乙酯对高脂血症小鼠总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的影响。采用试剂试剂盒和western blotting技术结合分子模拟技术，研究了木素B 23-乙酸酯和木素A 24-乙酸酯与TC代谢关键酶-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶的结合。结果显示，醋酸alisol显著降低高脂血症小鼠TC、TG和LDL-C浓度，同时提高HDL-C浓度。醋酸Alisol以剂量依赖的方式降低HMG-CoA还原酶活性在活的有机体内和体外. 这两种泽泻醇醋酸酯均未显著降低HMG-CoA的蛋白表达。这表明乙酰泽泻醇通过其原型药物抑制HMG-CoA还原酶的活性来降低TC水平，该原型药物可能通过直接和竞争性结合HMG-CoA来显示抑制作用。通过分子模拟，以泽泻醇醋酸酯的侧链为指导组。

1.介绍

泽泻是泽泻的根茎泽泻东方(山姆。)在橘子树中，属于泽泻科。泽泻是一种重要的利尿剂，其利尿作用与采收季节、药用部位、加工方法、给药途径和被试生物种类有关。真正泽泻的利尿作用在冬季采集时最强，春季采集时效果略有降低。除其盐溶液外，其他加工产品有明显的利尿作用。泽泻醇提物及其三萜具有降低尿蛋白的利尿作用。泽泻三萜有泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇B 23-乙酸酯、泽泻醇A 24-乙酸酯等[1，2]。此外，泽泻是一种调脂中药，常用于治疗高脂血症。研究表明，其主要调脂活性成分为泽泻醇醋酸酯，主要为泽泻醇B 23醋酸酯和泽泻醇a 24醋酸酯。泽泻的临床应用已在利米缺乏对其分子相互作用机理的分子研究[3.- - - - - -9]．本文中描述的研究研究了Alisol A 24-乙酸盐和alisol B 23-乙酸盐对总胆固醇（Tc），甘油三酯（Tg），高密度脂蛋白 - 胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白 - 的不同效果胆固醇（LDL-C）的高脂质化小鼠并获得脂质调节胰酸碱的宏观规则。在这项研究中，我们研究了Alisol醋酸盐的机制首先降低了TC水平，以及Alisol醋酸盐对TG，HDL-C和LDL-C水平的调节机制将是我们集团的未来研究内容。参与Tc代谢的主要酶是3-羟基-3-甲基戊齐律 - 辅酶A（HMG-COA）还原酶。该酶通过催化来自HMG-COA的甲戊酯（MVA）的合成，促进胆固醇合成，进一步通过Squalene进一步产生Tc。降低的HMG-CoA还原酶活性可以有效地降低TC代[10- - - - - -13]．采用试剂试剂盒法测定HMG-CoA还原酶活性在活的有机体内和体外在添加泽泻醇醋酸酯前后使用高脂血症小鼠的肝匀浆。结果表明，泽泻醇醋酸酯可能通过抑制HMG-CoA还原酶活性来降低TC，而原型药物泽泻醇醋酸酯抑制HMG-CoA活性而不是其活性在活的有机体内代谢物。Western blotting检测醋酸alisol对高脂血症小鼠HMG-CoA还原酶蛋白表达的影响。结果表明，醋酸alisol可能不会通过下调HMG-CoA还原酶的蛋白表达而抑制其活性。相反，它可能通过与HMG-CoA还原酶直接竞争结合而抑制HMG-CoA还原酶作用。采用分子模拟技术研究了醋酸alisol与HMG-CoA还原酶的结合作用。该技术得到了以下参数:结合常数、结合能、氢键、疏水/亲水基团、静电能和范德华力。建立了醋酸alisol与HMG-CoA还原酶的相互作用模型。将这些实验结果与药理学结果进行比较，以确定该类化合物的导向基团和酶的关键氨基酸残基。这可能在分子水平上揭示醋酸alisol的降胆固醇机制。研究结果对泽泻的临床应用具有重要的指导意义。

2.材料和方法

2．1．试剂和仪器

主要试剂如下:辛伐他汀(中国杭州MSD制药有限公司)、胆固醇(中国北京国家化学试剂有限公司)、去氧胆酸钠(中国北京国家化学试剂有限公司)、丙基硫脲片(中国南通京华制药有限公司)、猪油(从当地市场购买的叶猪油精制而成)、聚山梨酯80 (Tween 80，强顺化学试剂有限公司，中国，上海)、丙二醇(强顺化学试剂有限公司，中国，上海)、基础饲料(Slac实验动物有限公司，中国，上海)、放射免疫沉淀法(RIPA)组织细胞裂解缓冲液(Solarbio，北京，中国，猫号R0010)，二苯二酚酸(BCA)蛋白定量试剂盒(Thermo, MA，美国，猫号PICPI23223)， alisol A 24-acetate标准品(Mansite生物科技有限公司，中国，成都，批号:MUST-15022104, 98%纯度)和alisol B 23-醋酸盐标准品(Mansite生物科技有限公司，中国成都，批号:MUST-149091210, 98%纯度)。醋酸alisol的结构如图所示1［2，14]．

进一步的试剂如下：小鼠TG酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（凤翔生物科技有限公司，上海，中国，批号：201207），小鼠HDL-C ELISA试剂盒（凤翔生物技术有限公司，上海，中国，批号：201302），小鼠LDL-C ELISA试剂盒（凤翔生物科技有限公司，上海，中国，批号：201301），小鼠TC ELISA试剂盒（凤翔生物技术有限公司，上海，中国，批号：201202），HMG-COA还原酶活性测定套件（Genmed Scientifics Inc.，上海，中国，批号：20080717），HMG-CoA还原酶抗体（Ray Biotech Inc.，亚特兰大，美国，批号：168-10733），内标（甘油醛-3-磷酸脱氢酶[GAPDH]）蛋白抗体（CST，BOSTON，US，批号：5174）和硝化纤维素膜（Millipore，Boston，US，批号：Hatf00010）。所使用的所有其他化学物质都是分析级，并从中国获得。

本研究使用了以下仪器：高速ben离心机（中国上海医疗分析仪器厂，H1850）、电子分析天平（中国上海阳光恒平科学仪器有限公司，FA1104）、移液管（中国上海佳安分析仪器厂，WKYII），一台紫外可见分光光度计（中国北京珀西通用仪器有限公司，TU-1901）、一台精密数字高速均质机（上海硕光电子科技有限公司，SG-3048A）、一台电泳仪（美国加利福尼亚州BIO-RAD，mini-protean 3细胞）、一台电穿孔器（中国大连景迈科技有限公司，PS-9）一个微孔板阅读器（芬兰Labsystems Multiskan MS，型号352）、一个水浴（德国莱卡，HI1210）和一个成像系统（塔农有限公司，中国上海，塔农-5200）。

2．2.动物

雄性清洁级ICR小鼠(18-22 g)购自南京医科大学动物中心(许可证号:SCXK (Su)-2013-0005)。将动物置于20-24°C、55%±5%湿度的洁净级动物室。光明和黑暗的周期各为12小时。在实验前，这些老鼠被免费喂养了一周。南京中医药大学动物伦理委员会批准了所有动物实验方案。

２．３．检测TC、TG、HDL-C和LDL-C水平

2.3.1。高脂血症动物模型的诱导[15- - - - - -19］

将99只雄性小鼠按体重随机分为9组。正常空白组小鼠每天早晨灌胃蒸馏水(10 mL/kg);另一组小鼠灌胃脂乳10 mL/kg。脂乳液的配方为:25%猪油，15%胆固醇，10%聚山梨醇80,30%丙二醇，2%丙基硫氧嘧啶，2%胆酸钠，1%糖。连续5周，小鼠被自由喂食基础饮食，同时灌胃蒸馏水或脂乳。小鼠在最后一次灌胃后禁食12小时(允许喝水)。采集小鼠血样，分离血清。按试剂盒说明书测定血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C浓度，比较模型组与空白组血脂水平。根据表中的结果1，模型组TG、TC、LDL-C升高，HDL-C下降。提示高脂血症模型建立成功。将模型动物均匀分为8组:模型组、辛伐他汀组、alisol b23 -acetate高、中、低剂量组、alisol a24 -acetate高、中、低剂量组。

2.3.2.高脂血症小鼠的药物供应[19］

称取适量的泽泻醇A 24-乙酸酯、泽泻醇B 23-乙酸酯和辛伐他汀，溶于0.3%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，稀释至26 mL。

各组灌胃剂量如下:阳性对照组(辛伐他汀，7 mg/kg/天)、alisol A 24-acetate低剂量组(0.64 mg/kg/天)、alisol A 24-acetate中剂量组(1.28 mg/kg/天)、alisol A 24-acetate高剂量组(2.56 mg/kg/天)、alisol B 23-acetate低剂量组(0.64 mg/kg/天)、alisol B 23-acetate中剂量组(1.28 mg/kg/天)、alisol b23 -acetate高剂量组(2.56 mg/kg/d)。

每组小鼠每天上午灌胃脂乳10 mL/kg，下午给予相应药物治疗，连续3周。

2.3.3.TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的测量

最后一次给药后，小鼠禁食12小时（允许喝水）。采集血样并静置20-30分钟。血清通过在3000℃下离心血液样本获得 r/min，持续15分钟。收集的血清按照TC、TG、HDL-C和LDL-C试剂盒的说明进行测量。

2.4. 测量体内/体外HMG-CoA还原酶活性[19- - - - - -25］

2.4.1。测量在体外β-还原酶活性

小鼠高脂血症模型的建立按本节方法进行２．３．1．最后一次灌胃后(步骤见本节)２．３．1)，小鼠禁食12小时（允许喝水），然后斩首。断头后立即用10%乙醇冲洗小鼠腹腔 将小鼠的肝脏迅速冷冻在液氮中，并储存在室温下−70°C进行进一步分析。

在4°C温度下称取每个肝脏0.5 g，置于磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.2, 0.25 g/mL)中，均质。4℃，4000r /min离心10分钟。收集上清。收集肝脏匀浆上清1 mL，用10 mL 95%乙醇在60℃下提取。接下来是真空过滤。残基溶解在PBS中。将样品调至一定浓度，保存于−70℃。

在5ml肝脏匀浆样品中分别加入0.04 mg/mL辛伐他汀、0.16 mg/mL、0.08 mg/mL、0.04 mg/mL(高、中、低剂量)泽泻醇A 24-乙酸酯和泽泻醇B 23-乙酸酯。待样品静置24小时后，按照说明书使用HMG-CoA还原酶活性测定试剂盒测定HMG-CoA还原酶活性。

2.4.2。测量体内β-还原酶活性

高脂血症动物模型的诱导按本节方法进行２．３．1.按照第节所述进行胃内给药２．３．2．小鼠被禁食12小时(允许喝水)，并在最后一剂药物后斩首。小鼠腹腔立即用10ml冷盐水冲洗，小鼠肝脏在液氮中迅速冷冻，然后在−70℃下保存以供进一步分析。4℃，取每只肝脏0.5 g，置于pH 7.2, 0.25 g/mL的PBS中，均质。4℃，4000r /min离心10分钟。收集上清。每只小鼠取1 mL肝匀浆上清液，用95%乙醇10 mL, 60℃，分3次提取。接下来是真空过滤。残基溶解在PBS中。将溶液调至一定浓度，保存于−70℃。 The HMG-CoA reductase activity of the liver homogenate samples was measured in accordance with the instructions given in the HMG-CoA reductase activity assay kit.

2.5。通过蛋白质印迹测量HMG-COA还原酶蛋白表达水平[26- - - - - -29］

按照本节方法建立高脂血症动物模型的高脂血诱导２．３．1．胃内给药遵循本节所述的程序２．３．2，而肝脏匀浆样品则按本节所述制备2.4.2. 样本储存在实验室−70°C以供进一步使用。

为了检测每个样品上清液中的蛋白质浓度通过Bradford法测量吸光度值并绘制牛血清白蛋白蛋白的校准曲线。当量体积为2×十二烷基硫酸钠（SDS）向肝匀浆样品中添加缓冲液。混合物在100°C下变性三分钟。随后，使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白质然后电转移至硝化纤维素膜。将硝化纤维素膜移除，并在含有5%脱脂奶粉的tris缓冲盐水（含吐温20（TBST）溶液中封闭1至2小时。随后，用TBST清洗膜，并将其放入一级抗体（1）中 : 2500兔抗大鼠HMG-CoA还原酶（多克隆抗体）在4°C下过夜。第二天，用TBST清洗膜，并在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中封闭2小时。每次清洗时，用TBST清洗膜3次，每次清洗10–20分钟。用碱性磷酸酶结合的小鼠抗兔IgG在稀释度为1的条件下孵育膜1小时 : 在二级抗体中培养后，再次清洗膜并使用电化学发光（ECL）观察。将膜置于抗体洗脱缓冲液中10分钟，在TBST溶液中冲洗5分钟。然后用5%脱脂奶粉将膜封闭在TBST溶液中，并在室温下摇动30分钟。用TBST反复冲洗膜，然后与内标GAPDH的一级抗体在一定温度下孵育稀释1 : 随后冲洗膜，并在稀释度为1的条件下与二级抗体一起孵育 : 250.清洗后，观察薄膜。使用凝胶成像分析系统测量薄膜条的灰度值。计算的灰度比（HMG-CoA还原酶/GAPDH）代表HMG-CoA还原酶蛋白表达的相对量。

2.6。醋酸泽泻醇与HMG-CoA还原酶相互作用的研究[30.- - - - - -35］

进行了分子模拟。使用Discovery Studio 2.1 (DS2.1 Accelrys, US)生成了乙酸alisol的初始分子结构。HMG-CoA还原酶的结构来源于蛋白数据库(PDB)的晶体结构(PDB code: 1HW9)。HMG-CoA还原酶是一种含n -连接高甘糖寡糖的糖蛋白，由4个相同的亚基组成，分子量为97 ku。每个亚基包含888个氨基酸残基，磷酸化位点位于第872个氨基酸。每个亚基有三个不同的结构域:n端339(1-339)氨基酸组成跨膜结构域，110(340-449)氨基酸组成连接结构域，c端439(450-888)氨基酸组成催化结构域。n端8次穿过内质网膜，通过短环固定在膜上。跨膜结构域由167个氨基酸残基组成。由于四个亚基相同，根据其与药物的相互作用，选择A链作为受体进行对接模拟。在去除水分子、杂原子和晶体结构中氨基酸残基的多构象后，进行了哈佛大学化学大分子力学(CHARMM)力场中的柔性对接。 Subsequently to the solvation calculation, the compensation ions Na⁺和Cl^-，以模拟人体所处的环境。通过最小化计算确定了最可能确定的结果综合体。

2.6.1.泽泻醇B 23醋酸盐和HMG-CoA还原酶的分子模拟

Alisol B 23-乙酸盐定义为配体。在对接之后，全面地考虑了Libdock评分，Cdocker能量，Cdocker相互作用能和配体 - 受体复合物的氢键形成，以确定最终稳定构象。选择该构象以进一步分子动态模拟。

2.6.2。泽露醇A 24-乙酸酯和HMG-CoA还原酶的分子模拟

应用分段法2.6。1最终形成了乙酸alisol a24 -acetate的稳定构象。选择该构象以进一步分子动态模拟。

2.7.数据分析

使用SPSS版本15.0（美国芝加哥SPSS公司）中的单向方差分析（ANOVA）对实验数据进行分析。值小于0.05()，差异有统计学意义。结果以平均数()±标准差(SD)。

3.结果

３．１．检测TC、TG、HDL-C和LDL-C水平

空白组、阳性组、模型组、alisol b23 -acetate高、中、低剂量组和alisol a24 -acetate高、中、低剂量组的血脂水平见表1．本研究发现，alisol a24 -acetate高、中、低剂量组以及alisol b23 -acetate高、中、低剂量组的TC、TG、LDL-C、HDL-C水平与模型组有显著差异。提示乙酸乙醇具有调脂作用，可显著降低高脂血症小鼠TC、TG和LDL-C浓度，同时提高HDL-C浓度。

３.２．测量体内/体外β-还原酶活性

3.2.1之上。测量在体外β-还原酶活性

作为桌子2结果表明，醋酸alisol呈剂量依赖性降低HMG-CoA还原酶活性。木素B 23-乙酸酯降低HMG-CoA还原酶活性的程度超过木素A 24-乙酸酯降低HMG-CoA还原酶活性的程度。

3.2.2。测量体内β-还原酶活性

表中的结果3.说明Alisol醋酸盐降低在活的有机体内HMG-CoA还原酶活性呈剂量依赖性，对泽泻醇B 23-乙酸酯的酶抑制程度大于泽泻醇a 24-乙酸酯。

３．３．Western Blotting检测HMG-CoA还原酶蛋白表达水平

western blotting结果显示醋酸alisol并没有显著降低HMG-CoA还原酶的蛋白表达(图)2）.

3.4. 泽泻醇醋酸酯与HMG-CoA还原酶相互作用的研究

3.4.1. 泽泻醇B 23醋酸酯和HMG-CoA还原酶的分子模拟结果

alisol B 23醋酸盐和HMG CoA还原酶之间相互作用的分子模拟结果如图所示3.．数字3（a）说明了交互的总体模式。alisol B 23醋酸盐与HMG CoA还原酶结合的相互作用袋含有以下氨基酸：Leu521、Val522、Met523、Gly524、Ala525、Cys527、Glu528、Asn529、Val530、Met588、Thy589、Arg590、Gly591、Asp653、Ala654、Met655、Gly656、Met657、Asn658、Met659、Ile660、Ser661、Lys662、Gly663、Thy664、Glu665、Cys688、Asp690、Lys691，Lys692、Arg702、Lys704、Ile760、Try761、Ile762、Ala763、Cys764、Glu801、Ile802、Gly803、Thr804、Val805、Gly806、Gly807、Gly808、Thr809、Asn810和Leu811。它们位于C端439（450–888）个氨基酸组成的催化结构域中。进入相互作用袋后，泽泻醇B 23醋酸盐通过氢键和疏水和亲水作用与周围氨基酸残基相互作用。图中的氢键图3（b）显示了alisol B 23-acetate与氨基酸Lys691和Asp767之间的两个氢键。表格4提供有关氢键的详细信息。计算了疏水氨基酸残基与小分子间的相互作用能为−12.8 KJ/mol，而亲水性氨基酸残基与小分子的相互作用能为−135.3 KJ/mol。这表明小分子与周围氨基酸之间的亲水性相互作用更强。

对接后，alisol B 23醋酸盐的构象发生变化，如图所示3（c）. 计算的均方根偏差（RMSD）为2.89 Ǻ. 小分子的构象由簇片状结构转变为开放式结构。对接前，小分子的侧链和环结构折叠，如图所示3（d）和3（e）．C和C之间的夹角₂- c₁₀- c₁₉是109.5°，C₁₀- c₁₉- c₂₀和−59.9°C之间₂- c₁₀- c₁₉- c₂₀．如图所示3（f）和3（g），对接后，C₂- c₁₀- c₁₉c是113.6°，在c之间115.6°₁₀- c₁₉- c₂₀， C之间126.0°₂- c₁₀- c₁₉- c₂₀．母环与侧链的夹角明显增大。二面角的扭曲导致侧链打开并插入蛋白质，从而导致相互作用。侧链上有一个亲水醚键，外周氨基酸以亲水为主(图)3（h）和3（i））.这在侧链周围创造了一个亲水环境，最终形成稳定的结合。计算得到它们之间的范德华力能为−151.9 KJ/mol，静电能为−236.6 KJ/mol。由于静电能量低于系统间的范德华力能量，因此静电相互作用是该小分子与大分子之间的主要相互作用。结合能(ΔG与HMG-CoA还原酶之间的温度为- 103.3 KJ/mol。

3.4.2。Alisol A 24-乙酸盐和HMG-COA还原酶的分子模拟结果

alisol A 24醋酸盐和HMG CoA还原酶之间相互作用的分子模拟结果如图所示4．数字4（a）显示该化合物和HMG-COA还原酶的整体相互作用模式。其与HMG-CoA还原酶结合的相互作用袋含有以下氨基酸：Tyr519，Ser520，Leu521，Val522，Met523，Gly524，Ala525，Cys527，Glu528，Asn529，Val530，ILE531，GLY532，TRY533，MET588，THY589，ARG590，GLY591，ASP653，ALA654，MET655，GLY656，MET657，ASN658，MET659，ILE660，SER661，LYS662，GLY663，THY664，GLU65，CYS688，THE689，ASP690，LYS691，LYS692，CYS764，GLY765，GLN766，ASP767，ALA768，ALA769，GLN770，ASN771，VAL772，GLY773，SER774，GLU801，ILE802，GLY803，THR804，VAL805，GLY806，GLY807，GLY808，THR809和ASN810。C-末端的催化结构域中有439（450-888）氨基酸。进入相互作用口袋后，Alisol A 24-乙酸盐表现出与外周氨基酸残基的氢键和亲水性相互作用。数字4（b）显示氢键接触图。泽泻醇A 24醋酸盐和氨基酸Asn658之间有一个氢键（表1）4）.计算得到疏水氨基酸残基与小分子的相互作用能为46.5 KJ/mol，而亲水氨基酸残基与小分子的相互作用能为−102.3 KJ/mol。这表明亲水基团比疏水基团具有更强的作用。小分子与周围氨基酸表现出更强的亲水性相互作用，从界面图可以看出(图)4（f）和4（g））.

对接后，泽泻醇A 24醋酸盐构象发生变化（图4（c）)。经计算，RMSD为3.34 Ǻ.构象角C_3.- c₁₈- c₂₆- c₂₈从对接前的60.0°更改为对接后的124.2°（图4（d）和4（e）)。这表明小分子侧链在对接后发生了较大的扭转，由此拉伸的开放状态变为环状片状状态。因此，侧链很难插入蛋白质中并与蛋白质的活性袋相互作用。这导致与alisol B 23醋酸盐相比，结合力大大降低。测定泽泻醇A 24醋酸盐和HMG CoA还原酶的静电能为−88.6 当范德华力的能量被确定为−164.9 KJ/mol。范德华力的能量低于静电能，表明该小分子与大分子之间的主要相互作用是范德华相互作用。ΔG泽泻醇A 24醋酸盐和HMG CoA还原酶的度数计算为−2.3 KJ/mol。

4.讨论

泽泻及其制品不同溶剂提取物(特别是水和醇提取物)的降血脂作用受到各种实验和临床研究的关注[36- - - - - -38]．但泽泻成分的作用机制尚不清楚。泽泻可能干扰外源性胆固醇吸收和内源性胆固醇代谢，从而降低TC水平。此外，醋酸alisol可能会干扰内源性胆固醇的代谢[39]．

因此，我们研究了基于HMG-CoA还原酶的醋酸alisol降低tc的作用及其分子机制。HMG-CoA还原酶是内源性胆固醇的主要来源，是TC代谢的关键酶之一，是目前首次发现的胆固醇合成限速酶在活的有机体内．此外，其活化直接影响胆固醇合成速度和TC水平在活的有机体内．

采用试剂盒法和westernblotting技术，结合分子模拟技术，研究泽泻主要活性成分泽泻醇醋酸酯的降TC作用及其分子机制。建立了泽泻醇醋酸酯的相互作用模型，其中参与TC代谢的关键酶是HMG-CoA还原酶。本研究表明，泽泻醇醋酸酯能显著降低高脂血症小鼠的TC水平。泽泻醇B 23醋酸酯显示出比泽泻醇a 24醋酸酯更高的TC降低程度。

符合体外结果，泽泻醇醋酸酯也可以降低在活的有机体内与alisol a24 -acetate相比，HMG-CoA还原酶活性呈剂量依赖性，对alisol b23 -acetate有更高程度的酶抑制。这些结果表明，醋酸alisol可能通过调节HMG-CoA还原酶活性来降低TC水平。结果的一致性在活的有机体内和体外实验表明，乙酸泽泻醇原型药物抑制HMG-CoA还原酶活性，而不是在活的有机体内代谢物。

western印迹结果显示，泽泻醇醋酸酯可能通过直接竞争性结合HMG-CoA还原酶而不是通过下调其蛋白表达来抑制HMG-CoA还原酶的活性。

采用分子模拟技术研究了醋酸alisol与HMG-CoA还原酶的相互作用。结果(数据3.和4和桌子4)揭示了泽泻醇醋酸酯与HMG-CoA还原酶相互作用的分子机制。这两种泽泻醇醋酸酯在其催化结构域的C端与HMG-CoA还原酶结合。泽泻醇B 23醋酸酯与HMG-CoA还原酶形成两个氢键。亲水作用强于疏水作用，而静电作用强于范德华力。在相互作用后，小分子的结构从原来的折叠片急剧改变为开放结构。此外，侧链被拉伸并插入蛋白质中。外周氨基酸形成亲水性环境并与之稳定结合。通常，长度小于3.5的氢键 Å和90–180°的角度被认为是很强的。这两个氢键相对较强，可能是小分子扭转的部分原因。泽泻醇A 24醋酸酯与HMG-CoA还原酶形成一个氢键，与泽泻醇B 23醋酸酯相比，该氢键较弱。亲水作用强于疏水作用，范德华力强于静电作用。在相互作用后，分子侧链发生了较大的扭转，从原来的拉伸开放状态转变为环状片状状态，难以插入蛋白质中。泽泻醇b23醋酸酯与HMG-CoA还原酶的结合能低于泽泻醇a24醋酸酯与HMG-CoA还原酶的结合能，表明泽泻醇b23醋酸酯与HMG-CoA还原酶的结合是稳定的。根据药理学结果，泽泻醇B 23醋酸酯比泽泻醇A 24醋酸酯更能降低HMG-CoA还原酶活性。这表明活性中心是由这些氨基酸构成的相互作用袋，涉及Lys691、Asp767和Asn658的氢键是该蛋白质与泽泻醇醋酸酯相互作用的关键氨基酸残基。

泽泻醇B 23醋酸盐与HMG-CoA还原酶的结合比泽泻醇A 24醋酸盐与HMG-CoA还原酶的结合强得多。泽泻醇A 24醋酸盐与HMG-CoA还原酶的结合相对较弱可能是由于其独特的侧链结构。泽泻醇B 23醋酸盐的侧链含有一个很强的醚键泽泻醇醋酸酯具有亲水性，可以插入蛋白质的亲水环境中形成强烈的相互作用。以前的研究发现泽泻醇醋酸酯的侧链是它们的活性基团[40].在本研究中，这一结论得到了验证。折叠的侧链/母环比开放的侧链/母环更牢固地结合到大分子上。因此，侧链起着指导组的作用，因为它指导泽泻醇醋酸酯和大分子之间的相互作用。这可能是与大分子相互作用的关键基团，因为它对此类化合物与大分子的相互作用具有决定性影响。我们之前的研究表明，在人类胃环境中，泽泻醇B 23醋酸盐部分转化为泽泻醇A 24醋酸盐。然而，泽泻醇A 24醋酸盐与HMG-CoA还原酶的结合较弱[14，41，42]．因此，建议的药物显影剂开发一种剂型，这些剂型将避免胃中的Alisol B 23-乙酸酯的转化。

先前发表的研究表明[43，44]降低TC水平的机理是两个乙酰辅酶A分子在乙酰辅酶A硫代酶(AACT)的催化下缩合为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA, HMG-CoA在HMG-CoA还原酶的催化下还原为MVA。MVA进一步用角鲨烯生成TC。高水平的细胞内游离脂肪酸(FC)刺激微粒体酰基辅酶a -胆固醇酰基转移酶(ACAT)，促进胆固醇的酯化。随后，胆固醇以胆固醇酯(CE)的形式储存，这是对HMG-CoA还原酶合成的反馈抑制，使胆固醇合成限速酶受到抑制，从而减少细胞内胆固醇的合成。这个过程有三个重要的酶:AACT, HMG-CoA还原酶和ACAT。AACT和ACAT是否参与醋酸alisol酯的作用将是未来深入研究的课题。

研究结果表明，醋酸alisol不仅能降低TC水平，还能降低TG和LDL-C水平，提高HDL-C水平。进一步研究醋酸alisol对TG、HDL-C和LDL-C的调节机制。

5.结论

本研究表明，泽泻醇醋酸酯可显著降低高脂血症小鼠的TC水平。泽泻醇b23醋酸酯对HMG-CoA还原酶的影响强于泽泻醇a24醋酸酯。泽泻醇醋酸酯能以剂量依赖性方式降低HMG-CoA还原酶活性在活的有机体内和体外．两种醋酸alisol均不能显著降低HMG-CoA的蛋白表达。这说明醋酸alisol通过其原型药物抑制HMG-CoA还原酶的活性从而降低TC水平，而HMG-CoA还原酶可能通过与HMG-CoA直接竞争结合而起到抑制作用。通过分子模拟，在醋酸alisol与HMG-CoA还原酶的结合作用中，HMG-CoA还原酶的关键氨基酸残基可能是Lys691、Asp767和Asn658。乙酸丙醇侧链为导向基团。此外，折叠侧链/母环与HMG-CoA还原酶的结合较开放侧链/母环弱。本研究从分子水平探索醋酸alisol的降tc机制，为其临床应用提供指导。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

国家自然科学基金项目(no . 81303173, no . 81673534);江苏省自然科学基金项目(no . BK20161576);江苏省高校自然科学基金项目(no . 14KJB360001);江苏省高等学校拔尖学科建设项目(PPZY2015A070)。

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