多酚树皮提取物的降血糖及基因毒性作用评价Quercus sideroxyla

摘要

Quercus sideroxyla是一种树皮含有酚类化合物的木材，应被认为具有生物活性;的低血糖和基因毒性特性问．sideroxyla.本研究对树皮进行了评价。测定了粗提物(CE)和有机提物(OE)中总酚类化合物的含量。OE的苯酚含量最高(GAE / g)。CE和OE均表现出较强的抑制作用α淀粉酶体外．通过葡萄糖耐量曲线和曲线下的面积评估降血糖活性（UAC）;OE显示出最高的降血糖活动。此外，通过链脲佐菌素（65mg / kg）诱导糖尿病，并施用萃取液（50mg / kg）10天;与糖尿病对照相比，OE显示出降血糖作用，降低肝脂质过氧化。在Ce中评估急性毒性和遗传毒性;急性毒性的结果没有表现出任何死亡率。此外，彗星测定表明，在24小时的评估时，100mg / kg的剂量下的Ce未显示出任何遗传毒性效果，而它诱导200mg / kg的轻微损伤，形成1型彗星。

1.介绍

栎已被用于墨西哥传统医学[1];具体地说问:sideroxyla含有抗氧化化合物[2通过调节NF-kB的表达来降低炎症标志物如COX-2和IL-8的水平[3.］．据报道，这种树皮中含有10种不同的多酚[4]，这是生物活性植物化学物质[5]，并被发现具有降低血糖的特性[6，7］．

多酚是最丰富的膳食抗氧化剂，是许多植物食物来源的常见成分，包括水果，蔬菜，种子，巧克力，葡萄酒，咖啡和茶;因此，他们获得了重大兴趣[8］．

最近的研究表明，这些化合物在各种病理条件下，如糖尿病、癌症、动脉粥样硬化、心血管和神经疾病，都有很好的结果[9- - - - - -11］．

研究了多酚对碳水化合物代谢和葡萄糖稳态的疗效研究体外，用于动物模型及临床试验[12］．多酚通过抑制碳水化合物水解酶如α-淀粉酶和α-葡糖苷酶来调节餐后高血糖症[13］．

这些生物活性化合物的起源使它们对人类消费安全;但是，一些调查报告了植物造成的毒性效应[14- - - - - -16］．因此，进行毒理学和基因毒性分析十分重要[17，以评估其用于人类治疗的风险/益处。

因此，本研究的目的是评价多酚提取物的降血糖和遗传毒性问:sideroxyla糖尿病小鼠模型中的吠声。

2。材料和方法

2．1.化学物质

乙醇从Merck KGaA(达姆施塔特，德国)购买，没食子酸，福林- ciocalteu，链脲佐菌素，α-淀粉酶、阿卡波糖均购自Sigma化学公司。试剂均为分析级。

２.２.植物材料

这些树皮是在Pueblo Nuevo, Durango, México收集的。样品经过鉴定，植物标本保存在杜兰戈CIIDIR-Instituto Politécnico Nacional植物标本馆，凭单号为42842、428443和42844。将树皮混合，制成独特的样品，然后在室温(24°C)下干燥，研磨(目40)，最后放入纸袋冷藏，待进一步使用。

２.３.提取液的制备与纯化

The bark powder (10 g) was twice soaked with 50% ethanol (ethanol/water 50 : 50 v/v), (2 × 300 mL) at room temperature for 24 h, with stirring, followed by filtration through Whatman no. 1 filter paper. The extracts were combined, filtered, and then evaporated under vacuum at 40°C until ethanol was removed. A portion of the remaining aqueous extract was taken to dryness and identified as crude extract (CE), while another portion was subjected to liquid partition with ethyl acetate (3 × 100 mL). The organic phase was evaporated to dryness under vacuum at 40°C and identified as the organic extract (OE).

２.４.酚类化合物的评价

采用Folin-Ciocalteu比色法测定总酚(TP)的浓度，稍加修改[11］．测量进行了重复和计算基于校准曲线得到没食子酸。总酚浓度用每克干提取物中没食子酸当量(GAE)的毫克表示。

2．5．α淀粉酶测定

对α -淀粉酶的抑制由Kwon等人测定[18]具有一些修改的方法。IC.₅₀使用四种不同浓度的阿卡波糖(1000、2000、4000和5000)，通过线性回归分析确定值μg/mL)、CE、OE(500、1000、1500、2000)μg / mL)一式三份。阿卡波糖分别作为药物参考和对照。用1.0 mL显色剂(含二硝基水杨酸96 M和酒石酸钠钾0.005 M的混合物)终止反应;结果显示数据的平均值。

2.6。动物

健康Wistar大鼠取自美国国家生物科学学院(National Polytechnic Institute, México)生物库，ICR小鼠取自保法喜(PROPECIA S.A)， México。所有实验均由国家生物科学学院(National Polytechnic Institute, México)的实验动物护理委员会批准，并按照墨西哥官方标准(NOM-062-200-1999)生产、护理和使用实验动物的技术规范进行。这些动物被一群一群地安置在聚碳酸酯笼子里，笼子的环境是受控的，温度是恒定的(12小时的光/暗循环，并获得食物和淡水随意．

2.7。健康大鼠低血糖特性的评价

采用雄性Wistar大鼠称重葡萄糖耐量试验评价其低血糖活性g。实验前禁食12 h，从尾尖取基础血样。三组5只动物分别灌胃给予CE。各组分别饲喂体重为50 mg/kg (CE50)、100 mg/kg (CE100)、200 mg/kg (CE200)的粗提物;同样，两组动物(/组)在零时间分别给予25 (OE25)和50 mg/kg体重(OE50)的OE。根据酚类物质的含量选择剂量。15分钟后，所有动物口服35%浓度的葡萄糖(3克/公斤体重)。另设对照组6只，只给予葡萄糖。在给药后0、30、60、90、120 min，用血糖仪(Accu-Check Performa with Softclix, Roche)中的葡萄糖试纸测量血糖，然后计算曲线下面积以估算糖耐量。

2.8。糖尿病大鼠的降糖作用

采用链脲佐菌素(STZ, 65 mg/kg体重，pH 4.4)腹腔注射，对已诱发1型糖尿病的雄性Wistar大鼠(5只/剂量)进行降糖作用试验。24小时后，通过测量尾巴尖的血液样本中的葡萄糖水平，确定了糖尿病。5 d后，给予50 mg/kg体重的CE和OE问:sideroxyla10天;通过它们在部分之前显示的低血糖作用选择剂量。用葡萄糖试验条（Accu-Check PerficeA，roche）测定血糖，并与非糖尿病对照组和未经治疗的糖尿病对照组进行比较。在使动物进行安乐死之后，捕获的肝脏样品用于脂质过氧化测定。

2.9。肝脂过氧化测定

Rivera-Ramírez等人通过肝脏中丙二醛(MDA)的浓度来评估氧化应激水平。[19］．用摩尔消光系数1.56 × 10计算MDA浓度⁻⁵米⁻¹厘米⁻¹．结果在Mmol MDA / g组织中表达。

2.10。健康小鼠的急性毒性研究

毒性的评价问:sideroxyla树皮提取物根据洛克[20.］．四组健康雄性ICR小鼠(/组)接受CE，剂量分别为1000、2000、3000和5000 mg/kg体重。毒理学效应以死亡率表示，以LD表示₅₀．特别注意观察惊厥、腹泻、嗜睡和勃起。记录了某一时期动物死亡的数量。

2.11。基因毒性试验

36只体重25-30 g的雄性小鼠被分为6组，每组6只。将粗提物悬浮在1% Tween-80水溶液中，以100和200 mg/kg体重灌胃。阴性组给予1%吐温-80水溶液，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(CPA) 50 mg/kg体重。根据Almonte-Flores等人的说法，DNA损伤的评估是通过彗星试验完成的[21通过检查每只动物随机选择的100个细胞(每个编码幻灯片50个细胞)来评估。这些细胞根据尾巴大小目视评分，分为以下四类:0类，没有尾巴;第1类，尾短于头(核)的直径;2类，尾长1-2倍头部直径;第三类，尾长超过头部直径的两倍。彗星积分计算公式如下:

2.12。统计分析

结果用平均值和标准差表示。进行单因素方差分析(ANOVA)，然后在显著性水平下用Fisher-LSD检验进行多重平均数比较．使用统计分析软件包(Statistica 7)进行分析。

3.结果

CE和OE中酚类化合物的评价问:sideroxyla结果显示，OE的这些代谢物浓度显著高于CE (） （桌子1）.在同一表格中，CE和OE提取物的抗糖尿病活性通过较高的抑制作用(IC₅₀分别为1979.3和1703.3)α-淀粉酶活性与阿卡波糖(IC₅₀4030.1)。

在大鼠葡萄糖耐量试验中，有机提取物也观察到类似的行为(图)1(一)）.OE50、OE25和CE50提取物可显著降低血糖水平(mg / dL最小;mg / dL最小;和mg/dL min，相对于对照组( g/L min) (Figure1 (b)）.OE50和OE25均显示出高血糖性活性，并选择前者与CE50进行比较;这是为了观察提取物中所有化合物的作用，以及使用溶剂半尿化合物的提取物与组分的选择性的作用。

重复口服CE50和OE50对stz型糖尿病大鼠血糖水平的影响见表2．与糖尿病对照相比，OE50对糖尿病大鼠的葡萄糖显示出降低影响（)，在降低血糖方面比CE50 (）.

肝脂质过氧化的评价显示，糖尿病对照中丙二醛（MDA）的浓度显着较高（图2）.另一方面，接受CE50和OE50的糖尿病大鼠MDA浓度降低，在OE50的情况下甚至低于健康对照组(）.

5000 mg/kg体重的健康大鼠给药无死亡率，故LD₅₀≥5000毫克/公斤。这些动物没有出现任何抽搐、腹泻、嗜睡或勃起的迹象。

遗传毒性试验结果见表3.和图3.．测试表明，根据检测到的彗星类别(彗星类别2和3)，CPA组的损害水平最高，而阴性对照组的彗星类别为零。

在遗传毒性方面，CE100在24 h后的评价显示，与阴性对照相比，没有显著差异(）;而4 h后的CE200和24 h后的CE200均出现光损伤，形成1型彗星，与阴性对照差异显著(）.

4.讨论

提取物中总酚含量问:sideroxyla树皮(CE和OE)差异显著，OE最高(724.1±12 GAE/g)，说明溶剂对这些代谢物有浓缩作用。酚类化合物如没食子酸，儿茶素，表儿茶素，没食子儿茶素，二聚体，二聚原花青素已被鉴定问:sideroxyla树皮(4］．这些多酚是具有抗氧化特性的生物活性植物化学物质。抗氧化剂在预防糖尿病等疾病方面很重要，所以血浆抗氧化剂水平低意味着疾病发展的风险因素[22］．

本研究证实了CE和OE的抑制活性α淀粉酶酶。由于阿卡波糖对该酶的抑制活性较低，因此该作用可能是由于提取物中酚类化合物的协同作用。此外，抗氧化剂已被报道，因为它们的抗炎特性有助于预防2型糖尿病[23];因此，两种机制抗氧化效果和α-淀粉酶抑制可以总结为产生抗高血糖作用。

抑制肠中的葡萄糖摄取可能有助于控制血糖，因为已知α-淀粉酶是胰腺腺体和唾液腺分泌的主要产物之一，通过参与肠道吸收，在消化中起重要作用;人们认为，抑制这些酶可以显著降低餐后血糖水平的升高，这对糖尿病的治疗很重要[24，25］．由于这个原因，树皮问:sideroxyla可以作为一种有效的治疗方法来管理餐后高血糖和限制糖尿病的并发症。

CE (50 mg/kg b.w.)和OE (50 mg/kg/b.w.)对糖尿病大鼠的抗高血糖活性与糖尿病组有显著差异。此外，OE还能消除高血糖高峰，使血糖水平保持在较为稳定的水平。尽管CE和OE在治疗开始时表现出降糖作用，但随着治疗的继续，这一作用在CE中消失了。因此，有可能抑制α- 酚类化合物的淀粉酶活性和由儿茶素的化合物的抗氧化效果是与生物活性化合物的药理学特性相关的机制问:sideroxyla树皮。OE具有较强的降糖作用，可能是由于与CE相比，OE的苯酚浓度较高。需要进行更多的实验来证明CE和OE提取物对肠道碳水化合物吸收有抑制作用。

一些研究表明，含有酚类的植物提取物通过槲皮素和儿茶素等类黄酮的存在降低了葡萄糖水平，这些类黄酮促进了肝糖原的储存[26，27］．其他可能的机制包括原花青素的活性，它抑制碳水化合物水解酶的活性(在结果中发现α-淀粉酶试验)，表儿茶素诱导胰腺β细胞再生，以及儿茶素和酚醛酸酸，其抑制由肠道葡萄糖吸收的肠道葡萄糖吸收[28，29］．

在糖尿病中，组织损伤是由自由基介导的，通过脂质过氧化攻击细胞膜。MDA的浓度反映了脂质过氧化的程度，MDA产生的增加是糖尿病胰腺损害进展的关键因素[22，30.］．因此，降低脂肪酸的过氧化作用和改善抗氧化状态有助于预防糖尿病并发症。在我们的研究中，与CE和OE治疗的糖尿病大鼠相比，糖尿病对照组的MDA水平更高(）.这可以用两种提取物中多酚的抗氧化作用来解释，这在其他从植物中提取的研究中已经观察到[31，32］．

毒性结果表明，CE100在本研究中不被认为是基因毒性药物;但CE200的基因毒性较低。一些研究显示了剂量依赖关系，甚至讨论了不同的细胞通路可能的激活取决于测试的剂量[21，33］．已有研究表明，黄酮类化合物对各种遗传毒性物质诱导的DNA损伤具有抑制作用，主要是通过保护活性氧产生的能力以及调节遗传毒性物质的生物激活和解毒酶。已报道黄酮类化合物的结构和活性在保护遗传物质方面的关系[34］．

本研究首次报道了该提取物的降血糖和基因毒性作用问:sideroxyla树皮。多酚可以解释这种活性;但仍需进一步研究其作用机制;此外，还需要对OE进行毒理学分析。

5.结论

我们得出结论提取物Quercus sideroxyla剂量为50mg /kg可有效降低餐后高血糖。然而，CE提取物在200毫克/公斤的剂量下产生低水平的DNA损伤。有必要进行更多的研究来评估其作为糖尿病辅助治疗的潜在用处。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

本项工作得到了墨西哥国家研究院(Instituto Politécnico Nacional) 20140428、20150338、20150212、20160498和20160397项目的资助。Norma Paniagua-Castro, Martha Rosales-Castro和Gerardo N. Escalona-Cardoso是EDI和COFAA/Instituto Politécnico national项目的研究员。Marcela Soto-García感谢CONACYT Mexico提供的奖学金。

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