一种新型葛根素微球制剂的药动学研究及体内药效学评价

摘要

本研究旨在研究葛根素羧甲基壳聚糖微球（Pue-CCMs）的药代动力学和药效学用高效液相色谱法研究大鼠灌胃给予Pue-CCMs和葛根素后药代动力学参数的差异。为评估Pue-CCMs对大鼠心肌损伤的保护作用，测定血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA）水平除了病理检查和免疫组化染色外，我们目前的研究表明,,,和葛根素分别为20.176 mg·h/L、3.778 mg·h/Lμg / ml，1 h，4.634 h和9.474 mg·h / l，2.618 μG / ml，0.542小时和3.241小时。PUE-CCM缓解了心肌缺​​血性损伤。患有PUE-CCMS的预处理可显着降低CK，LDH和MDA水平，并增加血清中的T-SOD水平。PUE-CCMS下调BCL-2相关X蛋白（BAX）和上调B细胞淋巴瘤-2（BCL-2）表达的表达。与葛根素集团相比，普洱菌集团可以提高葛根素的口服生物利用度。Pue-CCM对心肌损伤的保护作用明显大于同一剂量的葛根素．总之，Pue-CCMS应该是一个合格和有前途的候选人，作为葛根素的新口服制剂。

1.介绍

缺血性心脏病(IHD)是由冠状动脉循环引起的冠状动脉血流与心肌需求不平衡引起的，是世界上发病率和死亡率的重要原因[1.]因此，显然需要一种有效治疗缺血性心脏病的药物。

葛根是植物的根Pueraria lobata.(Willd)。Ohwi。葛根素(7 4”-dihydroxyisoflavone-8β吡喃葡萄糖苷,图1.)是葛根的主要活性成分[2.,3.]．大量的药理学研究表明葛根素对心血管系统有保护作用。因此，常用于治疗冠心病、高血压等相关疾病[4.–6.]．

由于水溶性差，口服生物利用度低，静脉注射仍然是主要的给药方法[7.–9]．然而，由于在人体内消除半衰期短，需要频繁或高剂量的给药，导致严重的副作用，限制了其临床应用[10.,11.]．因此，提高葛根素吸收的口服制剂引起了广泛的关注。

壳聚糖具有无毒、高生物相容性、生物粘附性和生物降解性，是一种很有前途的药物传递系统候选者[12.]．然而，壳聚糖只能在酸性条件下溶解，这限制了它的应用[13.]羧甲基壳聚糖是壳聚糖的水溶性衍生物，在中性pH值下可显著增加壳聚糖的溶解度，而不影响其特性[14.]由于这些优点，羧甲基壳聚糖因其在药物传递系统中的潜在应用而备受关注。

在早期研究中，通过中央复合设计 - 响应面方法优化了戊二醛交联的戊二醛的制备[15.].在本研究中，我们评估了正常大鼠灌胃单剂量Pue CCMs后葛根素的药代动力学参数，并与葛根素在相同条件下的表现进行比较。其次，我们研究了相同剂量下Pue-CCMs和葛根素对心肌损伤的保护作用，并对Pue-CCMs保护心肌损伤的机制进行了初步研究。

2.材料和方法

2.1。化学品和试剂

葛根素标准品(纯度≥98%，批号:110752-201514)购自中国北京国家食品药品监督管理局。实验室自制Pue-CCMs。葛根素(纯度98%)购自陕西旭昂生物科技有限公司(中国陕西)。色谱级甲醇从Thermo Fisher Scientific(美国)获得。所有其他的化学试剂和试剂都是分析级的，水是去离子化和双蒸馏的。

ISO购自南京森倍佳生物科技有限公司(中国南京)。乙醛购自上海山普化工有限公司(中国上海)。普萘洛尔购自陕西永寿药业有限公司。肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒均购自南京建城生物工程研究所(中国南京)。b细胞淋巴瘤-2 (Bcl-2)抗体和Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体均购自中国武汉博时德生物科技公司。

2．2.实验动物

健康雄性SD大鼠(体重:g)由西安交通大学动物实验中心(中国陕西西安)提供。这些动物被饲养在标准的实验室条件下(温度)摄氏度，湿度%， 12/12 h光/暗循环)，实验前一周。大鼠通宵禁食，但在实验前被随意提供水。本研究得到了陕西中医药大学动物伦理委员会的批准。

２．３．Pue-CCMs的制备方法及特性

通过乳液交联方法制备促型CCM。将0.5g羧甲基壳聚糖溶于20ml蒸馏水中，向上述溶液中加入0.5g Puerarin。将含有葛根素的聚合物溶液滴入含有6％频率-80的120ml液体石蜡中，得到W / O乳液的形成。向W / O乳液中滴加1ml戊二醛，并继续混合以形成微球。最后，通过以2700×g离心5分钟并用石油洗涤几次，并在60℃下在真空烘箱中洗涤几次。PUE-CCMS的药物负载，包封效率和粒度为25.73％，51.47％和78.8 μm,分别。

２.４.药代动力学和生物利用度研究

2.4.1. 实验条件

采用高效液相色谱系统(Thermo Fisher Scientific, USA)进行分析。分析物在Thermo Hypersil GOLD C上分离_18.第（4.6）栏 毫米×250 嗯,五 μm).流动相体系由甲醇(A)和1%乙酸水(B)组成，程序如下(v/v): 21% A，在0-30 min。葛根素紫外检测器波长为250 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃。

2.4.2.样品制备

在该研究中，蛋白质沉淀方法用于提取葛根素。该过程如下：100次等分 μL解冻血浆样本转入EP管，400μ沉淀蛋白中加入甲醇和乙腈混合物(90:10,V/V) L，样品涡旋3分钟(vortex -genie2, Gene Company Limited, USA)，在9700 ×g离心5分钟。上清转移到另一个EP管中，在N下蒸发干燥_2.(氮蒸发器MG-2200，日本东京丽阁会株式会社)。100年之后μ加入L甲醇再溶解，旋流5min, 9700 ×g离心5min。上清液注入高效液相色谱系统进行分析。

2.4.3。方法验证

通过分析空白血浆、加葛根素标准品(LLOQ)水平的空白血浆以及给予Pue-CCMs、葛根素、葛根素注射液后的大鼠血浆样品，评价其特异性。

在0.53-53范围内的7个血浆浓度水平进行线性测试μg/mL (0.53, 1.06, 2.65, 5.3, 10.6, 26.5, 53μg / ml）。通过绘制葛根素的峰面积与葛根素浓度的峰值区域获得校准曲线。基于10：1的信噪比计算定量的下限（LLOQ）。

通过分析5个重复的1.06,5.3和26.5来确定精度和精度 μ在同一天和连续五天，g/mL。准确度表示为相对误差（RE%），精密度通过计算相对标准偏差（RSD%）进行评估。

通过比较萃取的加标样品与萃取后的加标样品在相应浓度下的峰面积来确定萃取回收率。

通过分析葛根素在室温下保存24小时和在冰箱(−20℃)保存1个月的血浆样品来评估短期和长期的稳定性。冻融稳定性通过检测样品进行三次冻融(−20°C) -解冻(室温)循环。

2.4.4。药物管理

18只大鼠随机分为3组:Pue-CCMs组、葛根素组和葛根素注射组。Pue-CCMs组给予Pue-CCMs 2 g/kg (ig，相当于500mg /kg葛根素)。葛根素组给予葛根素500 mg/kg (ig)。葛根素注射组给予葛根素20 mg/kg(静脉滴注)。给药后，用少量乙醚麻醉大鼠。Pue-CCMs组在预定时间点(0、0.167、0.333、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h)采集大鼠眼角静脉丛血液约0.5 mL;葛根素组分别为0、0.167、0.333、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10 h;葛根素注射组分别为0.08、0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、4 h)，并放入清洁的肝素化EP管中。血液样本立即在9700 ×g离心10分钟(离心机- x1, Gene Company Limited, USA)，血浆样本在−20℃保存至分析。

2.4.5.统计分析

通过DAS3.2.8药代动力学程序（中国上海上海中医药大学临床试验中心发明），包括从时间零点到最后采样时间点的浓度-时间曲线的面积，通过非房室分析计算药代动力学参数（)，浓度-时间曲线下从时间零点到无穷大的面积()，葛根素的最大血浆浓度(），葛根素最大血浆浓度的时间（)消除半衰期(T_1/2)、平均停留时间(MRT)、总间隙(Cl)和终端分布体积(Vz)。

葛根素生物利用度的计算公式如下：绝对生物利用度： 相对生物利用度：

数据以平均值±标准差表示。用T-使用IBM SPSS Statistics 19.0程序进行测试。被认为具有统计学意义。

2.5.药效学研究

2.5.1。实验议定书

30只大鼠随机分为5组：对照组、模型组、阳性对照组、Pue-CCMs组和葛根素组。Pue-CCMs组给予微球（2 g/kg/d，相当于500 葛根素组给予葛根素混悬液（500 mg/kg/d） 阳性对照组给予普萘洛尔（20 mg/kg/d） mg/kg/d）。对照组和模型组均给予生理盐水。所有治疗均采用灌胃给药。大鼠预处理7天，用ISO（80）制成模型 mg/kg，对照组除外），第5、6和7天皮下注射。30岁以后 最后一次ISO给药后min，称重大鼠，并通过腹腔注射20%乙基氨基甲酸乙酯溶液（1.0%）将其麻醉 g/kg）。在腹部做了一个中线切口。从大鼠腹主动脉将血样采集到聚丙烯管中。采血后，切除大鼠心脏，在冰冷的等渗盐水中冲洗，取出，并固定在10%福尔马林溶液中。血液样本在2700℃下立即离心 ×g为10 min，将血清样本转移至EP管中，并储存于−20°C，直到分析。

2.5.2。组织病理学检查

用标准组织学方法对心脏组织进行切片和染色。左心室切片用苏木精-伊红（HE）染色。使用400倍放大的光学显微镜（DP-73，日本奥林巴斯）检查每张载玻片。

2.5.3。血清CK、LDH、T-SOD、MDA的测定

采用商业酶联免疫吸附法测定T-SOD、CK和LDH水平。用分光光度诊断试剂盒测定MDA水平。所有的测量都是根据套件制造商的说明进行的。

2.5.4。免疫组织化学

免疫组化法检测Bcl-2、Bax蛋白表达水平。使用400倍放大的光学显微镜检查每个载玻片。

2.5.5。统计分析

分析统计差异T-使用IBM SPSS Statistics 19.0程序进行测试。结果以平均值±标准差表示，差异被认为具有统计学显著性，值为．

3.结果

３．１．药物动力学

3.1.1.方法验证

典型色谱图如图所示2.如图所示，内源性杂质不干扰葛根素的测定，说明该方法具有特异性。

葛根素校正曲线的回归方程为,= 0.9997。LLOQ对葛根素是0.53 μ克/毫升。

精度和精度量化的结果如表所示1.结果表明，该方法用于测定大鼠血浆中葛根素的含量准确、准确。

高、中、低浓度葛根素的回收率分别为85.03%、84.64%和86.65%，结果表明该方法用于样品制备是令人满意的。

表中总结了葛根素在大鼠血浆中的稳定性结果2.．葛根素在大鼠血浆中室温保存24小时和冷冻(−20℃)保存1个月后是稳定的，在大鼠血浆中冻融3次后是稳定的。

3.1.2。药代动力学数据分析

图中示出了平均等离子体浓度 - 时间曲线3.和4.．采用非室分析方法测定葛根素的药动学参数，汇总见表3.．结果表明和Pue-CCMs组显著高于葛根素组(与mg·h / L;μg/mL与μg / mL,).这个和Pue-CCMs组显著长于葛根素组( h versush; h versush,）.与葛根素组相比，PUE-CCMS组CL和VZ值显着降低（）.根据配方，Pue-CCMs的绝对生物利用度为8.96%，相对生物利用度为212.96%。

３.２．药效学

3.2.1之上。心肌组织病理学

he染色显示对照组心肌细胞(图5（a）)排列有序，而模型组(图5（b）)显示炎症细胞明显浸润，条纹消失，伴核改变。阳性对照组(图5（c））表现出清晰的条纹和少量炎症细胞浸润。与模型组相比，PUE-CCMS组在渗透炎症细胞面积显着下降（图5（d）)，而葛根素组没有明显下降(图5（e））.

3.2.2。Pue-CCMs对血清CK、LDH、T-SOD、MDA水平的影响

与对照组比较，模型组CK、LDH、MDA水平显著升高，SOD水平显著降低()与模型组相比，Pue CCMs预处理显著提高SOD水平，降低CK、LDH和MDA水平(， 数字6.）.

3.2.3。PUE-CCM对心肌损伤大鼠心肌组织BCL-2和Bax表达的影响

从数字7.和8.和表格4.与对照组相比，模型组Bcl-2水平显著降低，Bax水平显著升高。与模型组相比，Pue-CCMs组Bcl-2水平显著升高，Bax水平显著降低。

4.讨论

近年来，葛根素口服制剂受到了研究者的关注。研究人员使用不同的方法制备葛根素口服制剂，例如葛根素微乳液和纳米颗粒[5.,16.]目前，大多数研究者对葛根素口服制剂的药代动力学进行了研究，但对葛根素口服制剂的药效学研究较少，因此本研究不仅研究了Pue-CCMs的药代动力学，而且对Pue-CCMs的药效学进行了初步评价。

相关研究表明，cmc具有生物粘附和渗透特性。作为药物载体，可延长药物在体内的滞留时间，提高药物的生物利用度。其主要机理有以下两个方面:一是cmc分子中的氨基和羧基与黏液中的糖蛋白反应形成氢键，从而产生黏附特性。其次，羧甲基壳聚糖通过打开细胞间紧密连接，增强肠上皮的通透性，从而有利于细胞旁药物运输[17.]．本实验比较了正常大鼠单剂量灌胃普惠- ccms和葛根素后葛根素的药动学参数。与葛根素组相比,,， 和通过计算发现，Pue-CCMs的绝对生物利用度为8.96%，相对生物利用度为212.96%。药代动力学研究结果表明，Pue-CCMs可延缓葛根素的释放，提高口服葛根素的利用率葛根素的生物利用度。

模拟人类缺血性心脏病的动物模型在缺血性心脏病的治疗和预防方面做出了巨大的贡献β-肾上腺素能受体激动剂，可导致引起心肌损伤的生化和结构变化。ISO诱导的心肌损伤被认为是应用最广泛的实验模型之一．然而，一些研究表明雌激素可以保护心脏免受缺血性损伤；这意味着如果我们使用雌性大鼠，雌激素会影响实验结果[18.]因此，本研究采用雄性大鼠建立ISO诱导的急性心肌缺血模型。

日益增长的证据表明，活性氧物种（ROS）在心血管疾病中起重要作用，并且线粒体中ROS的积累可以导致凋亡细胞死亡[19.]．Bcl-2家族是线粒体通透性的主要调节蛋白，包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。促凋亡蛋白Bax触发促凋亡因子释放到细胞质中，从而诱导细胞凋亡;另一方面，Bcl-2与促凋亡蛋白形成异二聚体，抑制细胞凋亡[20.]．

葛根素已被证明具有清除自由基的能力，因为它具有抗氧化特性[21.]在本研究中，Pue-CCMs被证明有助于减轻心肌缺血损伤。Pue-CCMs预处理降低了血清中CK、LDH和MDA水平，并提高了T-SOD水平。Pue-CCMs下调了促凋亡蛋白Bax的表达，上调了Bcl-2的表达。结果表明，Pue-CCMs产生了在相同剂量下，Pue-CCMs的保护作用优于葛根素混悬液，Pue-CCMs的保护作用可能与其抗氧化作用有关。

然而，本研究还存在一些不足之处。微球在大鼠病理模型中的药代动力学和体外抗氧化分子机制有待进一步研究。

5。结论

综上所述，Pue-CCMs应被认为是一种合格的和有前途的候选葛根素口服制剂。

信息披露

小松、白熙惠和刘世玉是第一作者。

相互竞争的利益

作者声明不存在相互竞争的利益。

作者的贡献

宋晓辉、白希辉、刘诗玉等人对这部作品都有贡献。小宋提出了研究的主要思路。白希辉和刘世玉设计了实验方案，并进行了所有的实验操作和数据分析。董林娟、邓辉参与药代动力学实验。王昌利提供科研经费。手稿由宋晓辉、白希辉和刘诗玉撰写。

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(批准号:)。陕西省科技综合项目(批准号:81373944);分别2012 ktcq03-13)。

参考文献

1. Y.-n.唐，X.-c。他，M. ye等，“三种药用种类的”总皂苷的心脏保护作用“薯蓣属抗异丙肾上腺素引起的心肌缺血，”民族药物学杂志，第175卷，第451-455页，2015。查看在：出版商网站|谷歌学者
2. “葛根素通过调节NF-来抑制动脉粥样硬化中的炎症反应κ在兔子模型中的B通路，”药理学报告，第68卷，第5期，第1054-1059页，2016年。查看在：出版商网站|谷歌学者
3. 孙德强，薛爱英，吴建军，“液相色谱-串联质谱法同时测定大鼠血浆中乙酰葛根素和葛根素的含量:应用于静脉和口服给药后的药动学研究”，色谱法杂志B， vol. 995-996, pp. 24-30, 2015。查看在：出版商网站|谷歌学者
4. Lu，J.-X.Liu，Q.Wu等，“葛根素对斑马鱼和人类内皮细胞中Aß40诱导的血管功能障碍的保护作用，”欧洲药理学杂志，第732卷，第732号1, pp. 76-85, 2014。查看在：出版商网站|谷歌学者
5. 张炳扬。罗敏媛，硕士。“葛根素固体脂质纳米颗粒口服后的药代动力学、组织分布和相对生物利用度”，陈等，国际药剂学杂志第410卷1-2，页138-144,2011。查看在：出版商网站|谷歌学者
6. “葛根素口服自微乳化缓释颗粒配方的表征与评价，”国际药剂学杂志，第427卷，第2期。2, pp. 337-344, 2012。查看在：出版商网站|谷歌学者
7. 李慧东，王刚，乔颖，“葛根素的生物药物分类及灌流方法的比较，”国际药剂学杂志第466卷，第466号1-2，页133-138,2014。查看在：出版商网站|谷歌学者
8. 王玉英，马玉英，郑玉英等，“一种新型葛根素纳米悬浮液对结肠癌的体外和体内抗肿瘤活性，高效和低毒，”国际药剂学杂志号，第441卷。1-2, pp. 728-735, 2013。查看在：出版商网站|谷歌学者
9. Y. Yi，L.Tu，K. Hu，W.Wu和J. Feng，“葛根素纳米晶体的建设及其药代动力学和在vivo-in体外比格犬的相关（IVIVC）研究，“胶体与表面B:生物界面，卷。133，pp。164-170,2015。查看在：出版商网站|谷歌学者
10. “高效液相色谱法同时测定大鼠血浆中天麻素和葛根素的含量及其相互作用对药代动力学的影响”，色谱法杂志B，第915-916卷，第8-12页，2013年。查看在：出版商网站|谷歌学者
11. 涂林，易玉英，吴伟，胡芳，胡昆，冯建军，“葛根素纳米晶体和微晶体颗粒粒径对大鼠口服后药物动力学的影响”，国际药剂学杂志号，第458卷。1, pp. 135-140, 2013。查看在：出版商网站|谷歌学者
12. M. Dash, F. Chiellini, R. M. Ottenbrite，和E. Chiellini，“壳聚糖-生物医学应用中的一种多功能半合成聚合物”，高分子科学进展，第36卷，第8期，第981-1014页，2011年。查看在：出版商网站|谷歌学者
13. 刘玉芳，黄锦林，彭德明，丁炳，李国勇，“用于甲磺酸帕珠沙星控释的戊二醛交联邻羧甲基壳聚糖微球的制备和表征，”国际生物大分子杂志，第41卷，第1期，第87-93页，2007年。查看在：出版商网站|谷歌学者
14. L. Upadhyaya，J. Singh，V.Agarwal和R.P.Tewari，“羧甲基壳聚糖的生物医学应用”，碳水化合物聚合物第91卷第1期1，第452-466页，2013。查看在：出版商网站|谷歌学者
15. 刘树英，白晓红，董丽娟等，“葛根素羧甲基壳聚糖微球的处方优化及体外释放性能，”中国医药杂志，第47卷，第299-304页，2016年（中文）。查看在：谷歌学者
16. “葛根素微乳口服和鼻腔给药后的生物利用度及配方优化”，“葛根素微乳口服和鼻腔给药后的生物利用度及配方优化”，药学杂志，第100卷，第3期，第933-9411911页。查看在：出版商网站|谷歌学者
17. N. N. Inamdar, A. Tiwari，“羧甲基壳聚糖及其应用”，高级材料信件，卷。1，不。1，pp。11-33，2010。查看在：出版商网站|谷歌学者
18. Song，H.Li，J.Y.Sun和S.Wang，“肉桂酸和肉桂醛对异丙肾上腺素诱导的大鼠急性心肌缺血的保护作用，”民族药物学杂志，第150卷，第1期，第125-130页，2013年。查看在：出版商网站|谷歌学者
19. D.-E。Kim, B. Kim, h - s。Shin, H. J. Kwon和e - s。“组氨酸苷通过Akt/GSK-3对过氧化氢诱导的H9c2成心肌细胞凋亡的保护作用β以及ERK1/2信号通路。”实验细胞研究，卷。327，没有。2，pp。264-275,2014。查看在：出版商网站|谷歌学者
20. T. Kuwana和D. D. Newmeyer，“bcl -2家族蛋白和线粒体在细胞凋亡中的作用”，《细胞生物学最新观点》，第15卷，第5期。6，页691-699,2003。查看在：出版商网站|谷歌学者
21. 魏世耀，陈耀荣，徐锡耀，“葛根素药理研究进展：综述，”中国天然药物杂志，第12卷，第2期6, pp. 407-414, 2014。查看在：出版商网站|谷歌学者

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