文摘
慢性炎症导致多个摩根大通肌肉骨骼和神经退行性疾病、心血管疾病、哮喘、风湿性关节炎、炎症性肠病。最近,归因于慢性神经炎症帕金森症和阿尔茨海默病和患有孤独症谱系和强迫症。迄今为止,药物治疗炎症条件是主要基于非甾体类抗炎药与cytokine-suppressive消炎药不影响肿瘤坏死因子等细胞因子的产生或一氧化氮。然而,他们长期使用可引起胃肠道毒性和促进不良事件如高血压、充血性心力衰竭、血栓形成。因此,急需开发新颖的和更安全的非甾体类抗炎药物具有替代作用机理。在这项研究中,所使用的植物Dharawal土著人在澳大利亚治疗炎症的条件,例如,哮喘、关节炎、风湿、发烧、水肿,眼部炎症、膀胱和相关的炎性疾病和炎症的抗炎活性体外评价。Ethanolic提取物17桉树spp。(桃金娘科)的能力进行了评估抑制一氧化氮和肿瘤坏死因子-在原始生产264.7巨噬细胞。桉树benthamii显示最有力一氧化氮抑制作用(IC50 µg / mL),同时e . bosistoana e .葡萄簇状的e . saligna e . smithii大肠本影,大肠viminalis表现出一氧化氮抑制值在7.58和19.77之间µ克/毫升。
1。介绍
炎症是一个重要的生物过程,是至关重要的维持机体内稳态,有效地对抗病原体,并修复受损组织(1]。然而当失控和慢性炎症引起的(通常是年龄相关的)疾病包括哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病、克罗恩病、肌腱炎。此外,慢性炎症反应伴随氧化应激是一个重要的动力的发展周边动脉粥样硬化等疾病,糖尿病和代谢综合症,以及神经退行性疾病如多发性硬化、帕金森病、阿尔茨海默病(2- - - - - -5]。
虽然一些慢性/汇款神经系统疾病,如多发性硬化症,长期以来被认为是炎症,术语“存在”是现在应用于慢性激活的小胶质细胞和星形神经胶质不复制炎症在外围的经典特征可能导致神经退化(6- - - - - -8]。一些例子存在炎症为特征的疾病是阿尔茨海默病(AD)和帕金森病甚至患有孤独症谱系和强迫症9- - - - - -12]。小胶质和astroglial激活,伴随着增加的促炎介质如TNF水平,il - 1β和il - 6、前列腺素和活性氧和氮物种,以及羰基活性物种和先进的糖化终端产品,是大脑中观察到的广告在所有阶段的疾病(13- - - - - -18]。遗传和pharmacoepidemiological研究也指出,炎症在广告的重要性。例如,三个immune-relevant基因与风险增加有关的广告;这些是CLU (clusterin) CR1(补体受体1),和TREM2(髓细胞触发受体表达2)(19]。
因此,针对慢性神经炎症,例如,与植物的抗炎物质,被认为是一种很有前途的疾病修饰治疗许多神经退行性疾病包括广告(12,20.- - - - - -27]。
目前,两种甾体和非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)是用于治疗炎症。特别是非甾体抗炎药可以引起严重的副作用,最重要的是胃溃疡。非甾体抗炎药是专门设计为环氧合酶(COX)酶的抑制剂,在CSAIDs相比,不影响生产的促炎细胞因子如TNF -α或如一氧化氮自由基28]。CSAIDs p38 MAPK和NF -具体目标κB信号通路抑制cytokine-mediated事件证明疗效的动物模型(29日,30.]。
激活炎症细胞产生多种趋化因子和细胞因子,活性氧(ROS),活性氮物种(RNS)自由基,前列腺素(31日- - - - - -33),并停止产生神经保护因素,如谷胱甘肽(6,7]。
过度的炎性细胞因子的生产和活性自由基会损害细胞生物分子如蛋白质、脂质、碳水化合物以及核酸,导致细胞和组织损伤,这进一步加剧了炎症级联。因此,药物化合物的能力减弱这些炎症分子的生产可能有许多炎性疾病的潜在治疗包括广告(21,22,28,34,35]。
天然物质的使用,特别是那些来自植物,为了预防、管理、或治疗疾病是一个古老的实践,导致了许多现代药物的发现。近年来,寻找新的抗炎药物从范围广泛的药用植物资源已经加剧,和各种各样的植物次生代谢产物包括芹黄素、姜黄素,肉桂醛,已经发现白藜芦醇抑制炎症反应(21,22,28]。
例如,姜黄(姜黄)及其主要成分姜黄素,长期以来一直用于治疗风湿性疾病,发挥抗炎和antiatherosclerotic效应(23,36]。生姜提取物(姜zerumbet)及其主要活性化合物,3 -O甲基山柰酚,显著减毒carrageenan-induced老鼠爪子水肿的体内模型,也发现抑制一氧化氮(NO)的生产和前列腺素E2(铂族元素2),以及伊诺表达在细胞培养模型。水和hydroalcoholic ethanolic姜提取物来自另一个物种(生姜)表现出显著的抗炎活性和活性组分(姜辣素再次显示抗炎活动通过抑制生产和铂族元素2(37),也成功地抑制carrageenan-induced老鼠爪子水肿(38]。
三萜皂苷,从澳大利亚沙漠树金合欢victoriae,显示抗炎作用通过抑制NF -激活κB,通过阻止核本地化和抑制其与DNA结合的能力39]。另一个澳大利亚土著植物金果榄smilacina声称具有长链不饱和脂肪酸具有消炎作用[40]。澳大利亚本地卡卡杜李子的水果(榄仁树属ferdinandiana),Illawarra梅(罗汉松elatus),本机醋栗(Acrotriche depressa)也表现出显著的抗炎活性(41]。
有大范围调查澳大利亚本地植物的生物活性和化学成分(42]。传统医学仍实行的许多部落土著居民,尤其是在澳大利亚中部和北部和这ethnomedicinal知识记录在某些情况下(43]。“Dharawal药典”写的植物学家和土著老人弗朗西斯锥子(称为阿姨弗兰)是一个编译的土著药用和正式的使用(和相应的分类识别)成千上万的澳大利亚本土植物。我们感兴趣的研究,许多植物物种中描述Dharawal药典一直声称拥有抗炎活动(表1)[44,45]。植物桉树物种有特殊重要性Dharawal原住民和用于抗炎活动以及其他药用价值以及避难所和武器。如上所述的Dharawal药典,桉树林里。桉树主要分布在蓝色山脉,南部高地,Woronora高原,澳大利亚的新南威尔士和沿海地区。
我们的研究的目的是评估澳大利亚本地植物的抗炎活性ethnopharmacological重要性和随后描述生物活性成分。在这个手稿,干提取物17桉树抗炎活性种虫害进行评估通过没有和TNF -的抑制生产由脂多糖(LPS)和干扰素(IFN -γ264.7)在原始细胞。原油中提取的细胞毒性还研究了使用一个Alamar蓝色细胞生存能力分析。
2。材料和方法
2.1。植物材料
所使用的植物已知Dharawal人(也称为Tharawal)治疗炎症和相关疾病的指导下选择植物学家和土著老阿姨弗兰(Frances锥子)和Dharawal药典。叶材料17桉树种虫害收集在2015年8月,从“澳大利亚植物园”安南山,新南威尔士、澳大利亚(表1)。
2.2。化学药品和试剂
乙醇是购自Chem-Supply(吉尔曼、SA、澳大利亚);牛血清白蛋白、脂多糖(大肠杆菌血清型- 0127:B8)、EDTA、N——(1-napthyl)乙二胺盐酸盐,青霉素G钠盐、刃天青钠盐(10%)、链霉素、磺胺、3、3′,5、5′-tetramethylbenzidine(三甲),台盼蓝和杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)从Sigma-Aldrich购买(城堡山、新南威尔士、澳大利亚)。GIBCO、胎牛血清(的边后卫)和谷氨酰胺买来生活技术(Mulgrave,维多利亚,澳大利亚)。小鼠干扰素-(IFN -)和肿瘤坏死因子-ELISA试剂盒购自PeproTech亚洲(以色列Rehovot)。柠檬酸、味精碳酸二氢(不2有限公司3)来自AJAX化学品(奥本大学、新南威尔士、澳大利亚)。Tween-20是从Amresco(美国俄亥俄州梭伦)。甲醇,单磷酸(不2阿宝4)、磷酸二钠(Na2HPO4)、食盐(氯化钠)和硫酸(H2所以4)来自默克(达姆施塔特,德国)。碳酸钠(Na2有限公司3)是BDH默克公司提供的品牌企业。有限公司(Kilsyth,维多利亚,澳大利亚)。
2.3。提取植物叶子的生物分析和高效液相色谱法和MS分析
大约40 g的新鲜叶材料从每个工厂使用绝对乙醇提取。树叶是首先用剪刀切成小块,然后使用搅拌机粗粉。粗粉中弥漫的顶针加速溶剂萃取系统(瑞士Buchi b - 811),然后提取标准索格利特模式下(2×15分钟周期)。提取的体积减少到ca。2 - 4毫升用旋转蒸发器,然后蒸发干燥氮气的生物化验。百分比收益率(g / g %鲜重)记录在表中2。
2.4。维护和准备生264.7巨噬细胞
生264.7巨噬细胞种植在175厘米2DMEM培养瓶(杜尔贝科的修改鹰的介质)含有5%的边后卫(胎牛血清)补充用抗生素(1%)和谷氨酰胺(1%)。细胞行有限公司保持在5%2在37°C,与媒体所取代每3 - 4天。一旦细胞已经融合在培养瓶中,他们被使用橡胶警察细胞刮板,而不是使用胰蛋白酶,可去除膜结合受体如愤怒。集中了细胞悬液离心3分钟在900 rpm和resuspended体积小的新鲜DMEM的边后卫抗生素(1%和5%)。细胞密度估计使用纽鲍尔计数室。细胞浓度与DMEM调整的边后卫抗生素(1%和5%)获得60000细胞/ 100µL细胞悬液。100年μL细胞悬液被分发到96孔板的内部井。盘子在37°C和5%孵化有限公司218 h之前激活实验进行。
2.5。264.7激活的巨噬细胞
从每个好,媒体被拆除,代之以新鲜DMEM包含0.1%的边后卫。对于提取的化验,90μL体积稀释的DMEM(0.1%的边后卫)添加活化剂的前一个小时。由于经常不一致的LPS激活细胞的性质,有限合伙人(10的组合μ克/毫升)和干扰素-γ(10 U /毫升),无论是在DMEM的边后卫(0.1%),用于激活。使用提取的最大剂量是900µg / mL,连续稀释50%的最低10剂量(900、450、225,112.5,56.25,28.125,14.062,7.031,3.515,1.7578,和0.8789µ在井g / mL,职责)。激活后,细胞培养24小时37°C和5%股份有限公司2然后没有TNF -抑制和细胞生存能力测定。细胞与媒体仅被用作负控制和激活细胞作为积极的控制。
2.6。格里斯试验测定一氧化氮产量
一氧化氮是由格里斯试剂量化的亚硝酸盐,它的一个稳定的反应产物。格里斯试剂是刚由相同数量的1%磺胺和HCl naphthylethylene-diamine 0.1% 5%。在这个试剂亚硝酸盐的存在形成了一个紫色的颜色。从每个50μL上层清液被转移到一个全新的96孔板和混合着50μL格里斯试剂,产生的颜色测量在540 nm标(Bio-Rad、澳大利亚)。剩下的从每个被用于一个浮在表面的TNF -分析使用商业夹心ELISA开发工具包(产品目录号:900 - k54;美国PeproTech)。
2.7。决心Alamar蓝色细胞生存能力的分析
Alamar蓝试验是一个比色测定涉及细胞减少刃天青resorufin。Alamar[100蓝色的解决方案µL 10% Alamar蓝色(刃天青)在DMEM培养基)被添加到每个在37°C,孵化1 - 2 h。孵化后,荧光测量(激发在530 nm,排放在590海里)使用POLARstarω标(BMG Labtech,带到,澳大利亚),表示为一个百分比的控制井后减去背景荧光。
2.8。肿瘤坏死因子-α通过ELISA测定
从每个获得的上层清液(剩余的24小时内激活后上层清液)是用稀释剂稀释30倍0.1% (w / v v / v tween-20 0.05%牛血清白蛋白和PBS(1.9毫米不2阿宝4,8.1毫米Na2HPO4和154毫米氯化钠;pH值7.4])和用于测定肿瘤坏死因子-α使用商业夹心ELISA(产品目录号:900 - k54;美国Peprotech)根据制造商的协议。捕获抗体浓度为1.25μ在PBS g / mL。标准曲线TNF -(10 ng / mL标准)连续稀释50%的最低剂量10(10、5,2.5,1.25,0.625,0.312,0.156,0.078,0.039,0.019,和0.0097 ng / mL的井,职责),并作为内部标准。肿瘤坏死因子-α检测与生物素化的第二抗体和抗生物素蛋白过氧化物酶共轭与三甲检测试剂。~ 30分钟后,反应是停止使用0.5 M硫酸,和450海里的吸光度测量测量过滤器过滤655海里的参考。的吸光度数据被表示为一个百分比,在转换之后控制井使用标准曲线的浓度由定义的TNF浓度-。本标准曲线拟合曲线和实验数据外推法进行了使用非线性回归分析。
2.9。数据显示和分析
实验是在一式三份完成,结果表示为均值±SEM。此外,这些数据集的线性关系和意义测试也进行了。GraphPad Prism 6.01版本(GraphPad软件注册,美国)是用于生长曲线分析实验,确定集成电路存在剂量依赖的相关性50值和TNF -α抑制以及LC50。
3所示。结果与讨论
在这项研究中,从17个不同的树叶桉树种虫害收集在2015年8月。从每个大约40 g的叶子桉树acmenoides, e . benthamii e . bosistoana e .葡萄簇状的e . eximia e . globoidea e . gummifera大肠有污点的,e . notabilis e .香e . pilularis e .点状的e . resinifera e . saligna e . smithii大肠本影,大肠viminalis使用绝对乙醇提取(表吗2)。
生264.7小鼠巨噬细胞释放和TNF -当暴露在细菌有限合伙人和干扰素-这一原则,已成为建立实验模型来评估体外抗炎活性提取物(28]。为目的的解释,IC50的值没有抑制分为三组:提取与集成电路50< 20µg / mL被认为是高度有效的提取;21日和80之间的值µg / mL被认为是适度的,和一个集成电路50< 80µg / mL被认为是一个较低的提取能力。
的最高浓度ethanolic粗提物进行抗炎试验是在900年µg / mL系列稀释0.5倍。桉树benthamii, e . bosistoana e .葡萄簇状的e . saligna e . smithii大肠本影,大肠viminalis叶提取物显示最高的活动与IC没有抑制作用50值为5.57,7.58,16.65,19.77,17.62,17.69和8.0µ分别为g / mL(表3,5。图)。的提取桉树acmenoides, e . eximia e . notabilis和大肠pilularis没有显示适度抑制与IC50值为56.93,34.14,53.84和76.17µ分别g / mL。六其他物种,e . globoidea大肠gummifera,大肠maculata,e .香、大肠punctata和大肠resinifera与集成电路,抑制低没有50值为82.9,108.17,99.94,130.7,120.4和81.21µ分别为g / mL(增刊。图)。
植物提取物也表现出希望TNF -α抑制活性(表3与集成电路50值为2.06,8.53,19.02,3.41,2.41,10.2和16.68μ克/毫升e . benthamii e . bosistoana e .葡萄簇状的e . saligna e . smithii大肠本影,大肠viminalis分别是相同的植物在我们没有高度有效的抑制剂组。另一方面,适度有效的提取E . acmenoides大肠eximia、大肠notabilis和E pilularis显示肿瘤坏死因子-α集成电路50值为16.53,4.82,27.48和21.09μ分别为g / mL(增刊。图),而提取物e . globoidea e . gummifera e . maculata e .香大肠punctata,大肠resinifera表现出相对较低的抑制TNF -生产与集成电路50值为50.73,82.73,136.34,334.86,115.73和62.11μg / mL,分别是植物在我们的低能力组(5。图)。
使用Alamar蓝色(刃天青)来测量细胞毒性是一个既定技术(46]。细胞毒性(LD的结果50我们的叶提取物如表所示)3。植物的高度有效的集团也相对与LC有毒50值为22.34,37.17,108.40,101.01,38.96,236.5和31.92e . benthamii e . bosistoana e .葡萄簇状的e . saligna e . smithii大肠本影,大肠viminalis分别,而低能力组的植物显示低毒性较高的LD50值为464.74,313.45,540.46,268.59,522.84和268.59e . globoidea大肠gummifera,大肠maculata,e .香,大肠punctata,和大肠resinifera,分别。植物与温和的力量与LD显示广泛的细胞毒性50值为296.22,64.14,332.44和374.74e . acmenoides e . eximia e . notabilis和大肠pilularis分别(增刊。图)。
在以后的实验中,我们将去除最有效的提取识别最活跃的化合物。一个主要候选人携带抗炎活动可能是1,8 -桉树脑,桉树油的主要单萜,因为它可以代表挥发油的60 - 80%来自桉树叶取决于物种。治疗浓度的1,8-cineol (1.5µ克/毫升= 10−5米)显著抑制细胞因子的生产在淋巴细胞和单核细胞47,48]。必须指出的是,1,8-cineol已经获得市场接受其消炎漱口水和咳嗽抑制剂或平喘药药物(48,49]。
植物研究的基础上选择他们传统的用于治疗炎症性疾病的Dharawal人胡地区(西南悉尼澳大利亚)。所有的植物显示抗炎活性和抑制的差别影响对这些和TNF -生产不同的效能,支持他们在原住民传统医学使用。植物中抗炎化合物的内容,根据传统知识,也依赖于植物的环境。在Dharawal国家,什么是最重要的,当寻找特定的药物从植物是植物的生长,也就是说,与其说土壤,但周围的其他植物生长所需的特定的植物。例如,桉树林里。桉树,近距离的铁皮木(Muggago)和带树皮(Kai 'yeroo)需要从Burringoa抗炎药(小叶桉)是最有效的。另外一个例子,铁皮木本身不需要其他桉树林里。桉树关闭,但它确实需要Einadia (saltbushes之一)的速度增长。此外,如果它被闪电击中的可以证实(这一行中断树皮从树的顶端几乎基地),抗炎药物是最有效的,当使用桉树林里。桉树的叶子作为医学、7年以下的树木的叶子放在低火和烟吸入。然而,当树是轴承成熟的叶子,收集树叶,然后煮之前允许冷却摩擦的影响身体的一部分,这取决于物种。目前筛查研究,植物材料提供的植物园从随机树在花园里,但对于未来的研究,我们将调查收集实践基于Dharawal知识会提高固有的活动和/或产生抗炎化合物。
4所示。结论
目前的研究表明,大多数的桉树种虫害可能拥有有趣的体外抗炎化合物毒性和较低的活动似乎支持传统的使用。桉树benthamii, e . bosistoana e .葡萄簇状的e . saligna e . smithii大肠本影,大肠viminalis叶提取物表现出很强的抗炎活性通过抑制和TNF -在有限合伙人和正-生产264.7原始刺激巨噬细胞。这些提取纯化和结构鉴定的最目前正在进行中。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
确认
大多数a Akhtar是感谢西悉尼大学的博士奖学金和财政支持这个项目。作者还想谢谢Alejandra兰格尔,Dhanushka Gunawardena,利亚姆•Boukas和莱斯利Neuhold。作者也真诚地感谢Dharawal人,皇家植物园,和域的信任,悉尼。
补充材料
剂量反应曲线显示植物提取物的抗炎活性。