Chamaecyparis obtusa抑制变形链球菌毒力基因 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果

文摘

Chamaecyparis obtusa (c . obtusa)是已知抗菌效果和用作药用植物和森林浴”。本研究旨在评估anticariogenic活动的精油c . obtusa在变形链球菌,这是最重要的一个细菌引起的龋齿和口腔生物膜的形成。精油的c . obtusa提取,及其对细菌生长的影响,酸生产、生物膜的形成是评估。c . obtusa精油表现出浓度抑制细菌生长超过0.025毫克/毫升,99%抑制浓度为0.2毫克/毫升。细菌生物膜的形成和酸产量也显著地抑制浓度大于0.025毫克/毫升。生活的结果/死®BacLight™细菌生存装备显示浓度杀菌作用变异链球菌和几乎所有的细菌都死了超过0.8毫克/毫升。实时PCR分析表明,基因表达的一些毒性等因素brpA、gbpB gtfC,和gtfD也被抑制。在GC和GC - ms分析,被认为是主要的组件α萜品烯(40.60%)、乙酸龙脑酯(12.45%),α蒎烯(11.38%)、β蒎烯(7.22%)、β-phellandrene (3.45%)α异松油烯(3.40%)。这些结果表明,c . obtusa植物精油anticariogenic影响变异链球菌。

1。介绍

龋齿是最常见的感染性口腔疾病,困扰人类包括儿童和青少年(1]。它是一种多因素疾病,这是由有害细菌生态学变化导致生物膜的形成,坚持齿面(2]。在过去的几十年里,许多报道全球显示龋齿的整体下降趋势。然而,最近的研究报道以惊人的速度增加龋齿患病率,尤其是弱势群体(3]。

变异链球菌可以在口腔,形成细菌生物被膜。它有能力在酸性环境中生存和互动与其他微生物殖民这个生态系统(2]。

龋齿的结果去矿化作用和补充矿质的牙齿结构之间的不平衡。引起酸化的细菌发酵碳水化合物的饮食,从而产生有机酸、启动溶解牙釉质和崩溃的牙科组织(4]。pH值下降的程度是受很多因素的影响,包括微生物群落的组成,以及糖摄入量的类型和频率5]。

变异链球菌生产葡糖基转移酶(GTF)酶被认为是毒性因素龋齿的病因。GTF酶合成胞外葡聚糖和大大加剧牙菌斑基质多糖形成(6]。斑块的形成是基于GTF的sucrose-dependent机制产生的变异链球菌结合glucan-binding蛋白质(GBPs)。合成葡聚糖提供的可能性细菌粘附牙釉质和附着的微生物相互2]。

去矿化作用可以改变钙和磷酸盐,加上氟化物,扩散到牙齿和沉淀新单板晶体残余noncavitated病变,和被称为补充矿质4]。氟化已经作为“第一选择”预防龋齿的7),和其他anticariogenic天然产物或木糖醇等化合物也被引入了8]。

c . obtusa是一个热带树种发现在日本和韩国的南部地区,和精油提取的树叶和树枝c . obtusa树。精油有几种类型的萜烯和商业中使用香皂,牙膏,化妆品作为功能性添加剂(9]。的精油c . obtusa是集中疏水液体含有挥发性化合物和天然抗生素属性,抵御有害昆虫、动物和微生物。吸入精油被称为c . obtusa芳香疗法或c . obtusa森林浴”(10),被证明能起到抗菌和抗真菌作用[11]。

本研究进行分析anticariogenic效应c . obtusa在变异链球菌并确定其化学成分采用气相色谱法(GC) /气相色谱分析-质谱法(GC - ms)分析。

2。材料和方法

2.1。植物材料和精油

c . obtusa收集从Jeollanam-do省2013年10月,韩国。新鲜的叶子和树枝c . obtusa(1公斤)地面机械和hydrodistilled使用Clevenger-type装置3小时。的收益率c . obtusa精油是黄色浅1.08%的石油,基于植物的鲜重。的c . obtusa精油是存储在冰箱(−70°C)挥发性化合物的损失降到最低。

2.2。抑制细菌生长

变异链球菌(写明ATCC 25175)从美国购买类型文化集合(写明ATCC;美国马里兰州罗克维尔市)和培养在脑心浸液(BHI;美国Difco、底特律、MI)汤在有氧条件下在37°C。的增长变异链球菌检查在37°C 0.95毫升的脑心浸液肉汤含有不同浓度的c . obtusa。这些管注射0.05毫升的一夜文化生长在BHI肉汤(最后:5×10⁵菌落(CFU) /毫升)和孵化24小时37°C。细胞光密度(OD)使用分光光度计测量在550海里。每个浓度的提取进行了一式三份。

2.3。酸生产

酸生产变异链球菌检查评估的影响c . obtusa精油使用先前描述的修改方法(12]。的c . obtusa精油是0.2 filter-sterilized用膜过滤μ米孔隙大小和添加到0.95毫升的酚红汤含有1%葡萄糖,当时接种0.05毫升的种子的文化变异链球菌。培养24小时后,文化决定的pH值用酸度计(美国纽约康宁,Inc .,康宁)。三个复制为每个测试提取物的浓度测定。

2.4。生物膜的形成分析

生物膜的分析是基于先前所描述的方法(13,14]。生物膜的形成是通过测量与红色染料染色和扫描电子显微镜(SEM)观察到。c . obtusa精油加入BHI汤含0.1%蔗糖在35毫米聚苯乙烯菜肴。文化被接种一个种子的文化变异链球菌(最后:5×10⁵CFU /毫升)和孵化24小时在37°C。孵化后,上层清液被移除,菜肴与蒸馏水冲洗。生物膜的形成是沾0.1%红色染料和拍照。绑定发布了红色染料的染色细胞和30%醋酸溶液的吸光度测量在530海里。此外,生物膜在35毫米聚苯乙烯菜肴是SEM观察到15]。盘子上的生物膜的形成与蒸馏水冲洗,与2.5%戊二醛固定0.1钠甲次砷酸盐缓冲(pH值7.2)在4°C 24 h,并与乙醇梯度脱水系列(60%,70%,80%,90%,95%,和100%)。样本冻干,sputter-coated用金(108年溅射涂布机;Cressington科学仪器有限公司,沃特福德,英格兰,英国),扫描电镜观察到(JEOL地产——6360年,东京,日本)。

2.5。共焦激光扫描显微镜

确定的杀菌效果c . obtusa精油在变异链球菌,染色与生活/死®Bac光™细菌生存工具包执行并通过共焦激光扫描显微镜检查。的培养变异链球菌在BHI稀释使用BHI媒体1×10⁷CFU /毫升和治疗的精油在有氧条件下37°C。经过30分钟的孵化,细菌与PBS和沾住/洗死®Bac光™细菌生存工具包(分子探针,尤金,或者美国),准备根据制造商的协议。15分钟后染色,观察细菌使用共焦激光扫描显微镜(LSM 510、蔡司、从德国)。

2.6。实时聚合酶链反应分析

实时PCR检查执行的效果c . obtusa精油对毒力因子的基因表达变异链球菌。subminimal抑制浓度(0.025 - -0.1毫克/毫升)精油的使用。文化的24 h后,总RNA被隔绝变异链球菌使用试剂盒®试剂(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)和互补脱氧核糖核酸合成。使用StepOnePlus放大进行实时PCR系统SYBR®绿色主人混合(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)。16 s rRNA作为内部控制。

2.7。GC和GC - ms分析

GC分析进行一系列惠普6890型气相色谱仪和火焰离子化检测器(FID)和30的分流比:1使用DB-5HT熔融石英毛细管柱(30 m×0.32毫米,身份证。,0.10μ米膜厚度)。列的温度程序从40°C到230°C,在2°C / min,然后保持不变在230°C为20分钟。注入器和检测器温度为230°C和250°C,分别。使用的气体运输船是氮,0.80毫升/分钟的流量。峰地区衡量电子集成和单个组件的相对量测定的基础上,峰值区域。安捷伦科技的GC - ms分析进行了GC - 5975 c 7890质量选择检测器(MSD)操作在70 eV EI模式,配备了一个DB-5MS熔融石英毛细管柱(30 m×0.25毫米,身份证。,0.25μ米膜厚度)。列温度设定在40°C到230°C 2°C /分钟,然后保持不变在230°C为20分钟。注射器和离子源温度为250°C,分别。气体运输船氦在1.0毫升/分钟的流量。单个组件的识别是基于与威利7 n / NIST 05质谱库和保留指数与参考文献数据。线性保留指数的计算与n-paraffin (C6-C26)系列16]。

2.8。统计分析

所有实验进行了一式三份。数据使用SPSS软件分析了12.0(美国芝加哥,IL)。数据表示为平均值±标准偏差值。使用学生的进行了统计分析以及。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。抑制细菌生长

提取后c . obtusahydrodistillation精油,油的抗菌活性进行了测试变异链球菌。c . obtusa精油显著抑制增长变异链球菌浓度的方式。细菌用0.025,0.05,0.1,和0.2毫克/毫升c . obtusa精油。当处理0.025毫克/毫升的精油、细菌生长明显抑制相比对照组()。积极的控制(0.1%氟化钠)也表现出抗菌活性(图1)。

3.2。抑制体内酸性物质的产生

调查是否c . obtusa精油可以抑制变异链球菌有机酸生产、细菌培养在各种浓度的存在(0.025 - -0.2毫克/毫升)精油和pH值的变化来衡量。的pH值控制细菌培养后降至5.30,而媒体在细菌培养前的初始pH值为7.40。然而,额外的0.025,0.05,0.1,和0.2毫克/毫升c . obtusa精油导致pH值为5.38,5.73,7.12,和7.40,分别。这些结果表明,c . obtusa精油可以抑制有机酸生产的变异链球菌。氟化钠(0.1%)也用于积极控制抑制体内酸性物质的产生、pH值为7.10(表1)。


场骗局(毫克/毫升)	pH值(孵化之前)	pH值(孵化之后)

控制	7.40±0.00	5.30±0.00
0.025	7.40±0.00	5.38±0.01
0.05	7.39±0.00	5.73±0.00
0.1	7.40±0.00	7.12±0.00
0.2	7.40±0.00	7.40±0.00
0.1%氟化钠	7.40±0.00	7.10±0.00

数据(pH)表示为平均值±标准偏差。
⁢孵化后与对照组相比。

3.3。抑制生物膜的形成

以确定是否c . obtusa精油可以抑制生物膜的形成变异链球菌,细菌培养在各种浓度的存在c . obtusa精油在聚苯乙烯的菜肴。生物膜的形成进行了研究使用红色染料染色,吸光度测量在530海里。生物膜的形成,变异链球菌显著抑制治疗c . obtusa精油在0.025毫克/毫升剂量依赖性的方式c . obtusa精油。当处理0.1%氟化钠(积极的控制),完全抑制(图所示2)。SEM结果一致与红色染料染色(图3)。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

3.4。杀菌作用

评估的杀菌效果c . obtusa精油、变异链球菌在高浓度的培养(0.2 - -1.6毫克/毫升)的精油、沾住/死®吗Bac光™细菌生存装备并使用共焦激光扫描显微镜观察。治疗c . obtusa精油减少生活的细菌(绿色荧光标记细胞染色,SYTO®9)并增加死亡的细菌(红色荧光标记细胞染色π)。的杀菌效果c . obtusa精油也观察到剂量依赖性的方式(图4)。然而,低浓度(小于0.2毫克/毫升)的精油没有显示杀菌作用(数据没有显示)。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

图4

杀菌的效果c . obtusa精油。培养变异链球菌是处理c . obtusa提取(0.2 - -1.6毫克/毫升)和沾住/死®Bac光™细菌生存工具包。彩色的细菌被共焦激光扫描显微镜观察。治疗c . obtusa减少green-labeled活细菌(SYTO®9染色)和增加red-labeled死细菌(PI染色)剂量依赖性的方式。(一)控制;(b) 0.2毫克/毫升;(c) 0.4毫克/毫升;(d) 0.8毫克/毫升;(e) 1.6毫克/毫升;和(f)积极控制(0.1%氟化钠)。酒吧= 100μm。

3.5。抑制毒性因子的基因表达

评估的影响c . obtusa毒力因子的基因表达变异链球菌,细菌处理subminimal抑制浓度(0.025 - -0.1毫克/毫升)的c . obtusa,基因的表达各种毒性因素评估实时PCR。我们评估了基因的表达brpA,gbpB,gtfC,gtfD。的表达式brpA,这有助于控制(PTS)和磷酸转移酶系统与酸宽容,和gbpB造成细菌的依从性,降低为0.025毫克/毫升的吗c . obtusa。的表达gtfC和gtfD编码GTFase C和D蛋白显著减少什么时候变异链球菌0.025毫克/毫升的对待吗c . obtusa(图5)。

图5

的抑制作用c . obtusa精油对毒力因子的基因表达。变异链球菌是培养和处理subminimal抑制浓度(0.025 - -0.1毫克/毫升)的吗c . obtusa提取和实时聚合酶链反应(PCR)进行了分析。的brpA、gbpB gtfC,和gtfD表达式在0.025毫克/毫升的显著抑制c . obtusa。每个值表示为平均值±标准偏差。确定在与对照组相比。

3.6。的组成c . obtusa精油通过GC和GC - ms分析

59选民中标识c . obtusa精油、材料占总数的97.38%。因此,所有未知的化合物只有较小的组件。的主要组件包括α萜品烯(40.60%)、乙酸龙脑酯(12.45%),α蒎烯(11.38%)、β蒎烯(7.22%)、β-phellandrene (3.45%)α异松油烯(3.40%)(表2)。


保留时间(分钟)	保留指数	复合	峰面积(%)

8.849	801年	n-Hexanal	0.18
11.982	852年	反式2-hexenal	0.28
13.110	870年	n-Hexanol	0.06
15.125	902年	Bornylene	0.12
16.419	919年	三环萜	0.77
16.763	925年	α-Thujene	0.12
17.742	936年	α蒎烯	11.38
18.650	952年	莰烯	2.87
20.228	975年	桧烯	0.46
21.345	980年	δ3-carene	0.37
22.047	983年	β蒎烯	7.22
24.483	1023年	α萜品烯	40.60
24.927	1029年	柠檬烯	0.57
25.474	1036年	β-Phellandrene	3.45
27.317	1061年	γ萜品烯	0.21
28.393	1072年	独联体桧烯水合物	0.35
29.742	1089年	α异松油烯	3.40
29.983	1092年	脱氢-p甲基异丙基苯	0.53
30.874	1102年	反式桧烯水合物	0.09
31.769	1115年	1-Octen-3-yl醋酸	0.06
33.199	1133年	反式- - - - - -p2-menthen-1-ol	0.05
36.312	1173年	Cryptone	0.11
36.461	1175年	p-Cymen-8-ol	0.10
36.965	1181年	Terpinen-4-ol	0.23
37.889	1193年	α松油醇	0.11
38.960	1207年	Verbenone	0.09
39.699	1217年	葑醋酸	0.07
42.535	1256年	乙酸芳樟酯	0.08
45.552	1296年	乙酸龙脑酯	12.45
49.502	1352年	α松油基酯	0.62
51.422	1380年	α-Copaene	0.28
53.780	1414年	α雪松烯	0.52
54.015	1417年	β石竹烯	0.16
54.331	1422年	β雪松烯	0.25
55.009	1431年	独联体-Thujopsene	0.07
55.419	1434年	β-Gurjunene	0.06
56.378	1453年	α蛇麻烯	0.37
56.976	1462年	独联体5-diene -Muurola-4 (14)	0.24
57.656	1472年	β杜松烯	0.06
57.927	1476年	Germacrene D	0.13
58.150	1490年	β-Himachalene	0.10
59.003	1492年	α-Muurolene	0.16
59.519	1497年	α-Chamigrene	0.05
60.024	1508年	γ杜松烯	0.38
61.079	1525年	δ杜松烯	0.15
61.522	1530年	Cadina-1, 4-diene	0.09
61.937	1539年	Selina-3 7 ()二烯	0.07
63.011	1551年	Elemol	0.07
63.406	1562年	反式橙花叔醇	0.25
64.651	1578年	Spathulenol	0.05
64.916	1586年	石竹烯氧化物	0.10
66.435	1603年	雪松醇	0.97
67.079	1622年	1 -epi-Cubenol	0.08
67.835	1635年	γ-Eudesmol	0.58
68.123	1239年	τ-Cadinol	0.57
68.964	1648年	α-Cadinol	0.09
69.973	1670年	Bulnesol	0.07
70.829	1685年	α没药醇	0.13
82.676	1898年	Rimuene	0.27
84.836	1926年	Hibaene	2.33
85.085	1945年	海松二烯	0.10
86.747	1977年	13-Isopimaradiene	1.42
88.068	1998年	Dolabradiene	0.09
90.446	2051年	Dehydroabietane	0.07

总			97.38

保留指数DB-5HT列上。

4所示。讨论

氟化起着重要的作用在龋齿的预防和控制。然而,一个不幸的副作用氟氟中毒。摄入氟化物在2到3岁之前被认为是可能的氟中毒的关键在永久齿列(17]。因此,天然产品目前正在接受特别关注一个好的选择预防龋齿的合成化学物质18]。

精油的挥发性成分主要是通过蒸馏植物和由各种萜类化合物的混合物。萜烯的化学物质存在于药用植物治疗(19]。从多种植物精油提取已知抗菌活性(20.]。一些天然提取物等衍生品肉豆蔻,桂花,Lippia sidoides,Hyptis pectinata,姜黄,Baccharis dracunculifolia已经被证明是有效的反对变异链球菌(21- - - - - -25]。本研究评估anticariogenic活动执行c . obtusa精油在变异链球菌。

评估anticariogenic性质c . obtusa精油、变异链球菌因为使用这些细菌被认为是一个主要原因为龋齿的形成(2]。我们的研究结果显示,经济增长的变异链球菌治疗抑制了吗c . obtusa精油。此外,生活/死®的结果Bac光™还显示,细菌生存工具包c . obtusa精油具有杀菌效果变异链球菌。这些结果表明,c . obtusa精油有潜力anticariogenic效应,这很有趣因为的生长的抑制作用变异链球菌的策略来预防龋齿。

的增长变异链球菌治疗抑制了吗c . obtusa精油浓度的方式超过0.025毫克/毫升的浓度。在牙菌斑的形成,pH值的一个主要因素,由于低pH值导致软化羟磷灰石和致龋性(26]。变异链球菌可以代谢出饮食糖类和有机酸。低ph值环境生物膜基质导致解散搪瓷,从而引发龋齿的发病机制。因此,pH值的变化作为一个指标来确定anticariogenic代理的影响(27]。在这项研究中,c . obtusa精油抑制pH值的减少引起的变异链球菌结果表明c . obtusa精油可以抑制龋齿通过抑制体内酸性物质的产生变异链球菌。

生物膜微生物群落,坚持生物或非生物的根基和产生细胞外基质通常组成的多糖和蛋白质。牙菌斑是一种生物膜上发现一颗牙齿表面,嵌入在一个矩阵主机和细菌的聚合物(28]。在生物膜,称为口腔菌斑,特定的细菌与成分之间的相互作用的饮食导致龋齿(27]。生物膜的形成,变异链球菌也抑制了治疗c . obtusa精油的聚苯乙烯的菜肴。这些结果表明,c . obtusa精油直接抑制生物膜的形成变异链球菌。

此外,一些毒力基因的因素变异链球菌与致龋性的各个方面,如酸宽容,细菌粘附和生物膜的形成2]。的brpA已被证明导致生物膜的形成过程中起着重要作用细胞信封生源论/体内平衡和调节应激反应以及耐酸碱(29日,30.]。g摄影领域,编码surface-associated glucan-binding蛋白质(英镑)介导的细菌绑定到葡聚糖,使生物膜的发展。g交通和gtfD编码葡糖基转移酶(GTFase)是至关重要的毒力因子在斑块发展和负责葡聚糖形成从蔗糖2]。在这项研究中,评价相关性的抑制作用c . obtusa精油和毒力因子表达式,我们几个毒性的信使rna表达水平因素决定使用一个实时PCR分析。我们评估的基因表达水平brpA,gbpB,gtfC,gtfD。c . obtusa精油明显抑制转录水平的brpA,gbpB,gtfC,gtfD。

基于我们的GC / ms法分析的结果,主要包括组件α萜品烯(40.60%)、乙酸龙脑酯(12.45%),α蒎烯(11.38%)、β蒎烯(7.22%)、β-phellandrene (3.45%)α异松油烯(3.40%)(表2)。虽然生物的活动c . obtusa精油还没有完全理解,一些以前的研究报道,几种类型的萜烯c . obtusa已经被证明对抗菌和抗真菌作用[11]。最近的研究也报道其他有益的属性c . obtusa等药理活性治疗特应性皮炎(31日),改善认知功能的中枢神经系统对大鼠实验模型(10),和促进头发生长32]。此外,c . obtusaantinociceptive和消炎作用,增加其适用性在口腔护理9,33]。

根据我们的结果,我们得出这样的结论:c . obtusa可能有实用与生龋齿的细菌在口腔和建议进一步调查的c . obtusaperiodontopathic和生龋齿的细菌。

5。结论

这项研究已经证明了这一点c . obtusa精油表现出显著的抑制细菌生长、酸生产、生物膜的形成变异链球菌。也c . obtusa精油杀菌作用。此外,c . obtusa精油也抑制转录水平的一些毒性等因素brpA,gbpB,gtfC,gtfD的变异链球菌。在GC和GC - ms分析,主要组件α萜品烯(40.60%)、乙酸龙脑酯(12.45%),α蒎烯(11.38%)、β蒎烯(7.22%)、β-phellandrene (3.45%)α异松油烯(3.40%)。因此,这项研究的结果表明c . obtusa精油显示anticariogenic效果好变异链球菌似乎是一个有前途的新代理,可以预防龋齿。还需要进一步的研究来开发新药临床使用。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部、科学和技术(没有。2013 r1a1a4a03011203)。

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以证据为基础的补充和替代医学

天然产物的传染病