抗菌和Antibiofilm Methanolic植物提取物对医院微生物的活动

文摘

生物膜是一个复杂的微生物群落高度耐抗菌素。在生物和非生物表面生物膜的形成与住院患者的高发病率和死亡率。新的替代控制感染提出了关注的治疗特性药用植物及其抗菌效果。在目前的研究8 methanolic植物提取物的抗菌和antibiofilm活动进行评估与临床孤立的微生物。初步筛选通过扩散试验显示的抗菌活性Prosopis laevigata,仙人掌属植物ficus-indica,Gutierrezia microcephala。的最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定从0.7 > 15毫克/毫升。特定的生物膜的形成指数(SBF)评估之前和之后的植物提取物(MBC×0.75)。仙人掌属植物ficus-indica主要在SBF剂量依赖性的方式减少造成的。细胞毒性植物提取物的活性决定使用盐水虾杀伤力测试(卤虫盐沼l .)。致死剂量浓度(LD₅₀植物提取物的值)计算。LD₅₀值p . laevigata和g . microcephala分别为141.6和323.3µg / mL,分别o . ficus-indica出现了轻微的杀伤力与939.2µ克/毫升。植物化学的分析揭示了类黄酮的存在,单宁和香豆素。

1。介绍

微生物生物膜是细菌的社区,嵌入在一个self-producing矩阵,形成生活和无生命的固体表面(1]。Biofilm-associated细胞有能力坚持不可逆转地在各种表面,包括活组织和留置导管医疗设备,阀门,假肢,等等2]。

他们被认为是一个重要的毒力因子,引起持续的慢性和复发性感染;他们是高度耐抗生素和宿主免疫防御系统(3]。细菌生物膜胞内保护1000倍对抗生素的抗药性要比浮游细胞(自由浮动)4),这对治疗产生严重的后果,严重复杂的治疗方案(5]。估计有75%的生物膜细菌感染涉及保护由一个细胞外基质(6]。

生物膜阻力是由于几个原因,比如限制抗生素扩散到生物膜矩阵,表达多种药物射流泵、IV型分泌系统,降低渗透率,antibiotic-modifying酶的作用[7]。增加生物膜抵抗常规治疗提高了需要开发新的控制策略(8]。

生物膜抑制被认为是主要的药物目标治疗各种细菌和真菌感染,这个药物药理的发展是现在广泛研究9]。近年来,一些绿色不致命的生物膜控制策略已经被开发出来,因为这些小说antibiofilm代理的作用方式是更容易受到耐药性的出现10]。然而尽管他们承诺策略,他们有缺点,因为没有完全有效5]。

一个有前途的替代方法是寻找天然植物来源的化合物能够阻止生物膜的形成(11]。从历史上看,植物提取物及其生物活性化合物天然产物的重要来源,它起到了核心作用在疾病的预防和治疗,帮助维持人体健康(12]。此外,他们是被广泛接受的认为他们是安全的和历史悠久的使用自古以来民间医药治疗疾病和疾病(13]。

考虑上述基于先前的结果在我们的实验室,在目前的研究中我们提出评估8植物提取物对5的antibiofilm效果临床孤立的病原体。

2。材料和方法

2.1。植物材料

新鲜的和健康的植物野生在卡萨布兰卡社区,位于圣卡塔琳娜州,新莱昂州,墨西哥(25°39 11.33′′′N 100°42 41.09′′′W),收集在2014年3月和4月之间。凭证样本存放标本的植物生物科学系的学校,新莱昂州大学用于识别目的。收集植物(表1)在自来水清洗彻底,其次是连续在蒸馏水洗涤。洗植物被切成小块,风干在室温下(°C)下阴凉处。最后,干物质是建立在手动粗粉粒机和存储在塑料容器进行进一步分析。

2.2。菌株和文化条件

本研究中使用的微生物5医院病原体,4革兰氏阴性(肺炎克雷伯菌,粪肠球菌,大肠杆菌,Stenotrophomonas maltophilia)和1革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)。所有菌株都请由半径标注。埃尔韦拉加尔萨Gomzalez,医学院UANL。压力保持在Mueller-Hinton (MH)琼脂(Difco)在4°C。活跃的文化是通过接种铂环量的每个倒入分开5毫升MH肉汤(Difco)和孵化18 h在37°C。

2.3。植物提取物的制备

提取准备后,桑切斯等人提出的方法。14),小的修改。简单地说,一百克(100克)的干燥植物材料和500毫升的甲醇浸泡24小时在室温下(°C),在偶尔的颤抖。提取重复了三次,提取得到结合,透过绘画纸1号滤纸。之后,他们集中在减压干燥使用旋转蒸发器在45°C。股票的解决方案(200毫克/毫升)准备在甲醇和储存在4°C在黑暗中进行进一步的实验。

2.4。定性的植物化学成分筛选

提取受到标准植物化学的测试,以评估他们的化学成分不同的有效成分;这个提取(3 - 5毫克/毫升),他们分别悬浮在1毫升的绝对乙醇或蒸馏水(碳水化合物测定)使用干净的试管。

2.5。拜耳未饱和的测试

在这种情况下KMnO水1%₄添加一滴一滴地提取解决方案。一个积极的测试证明KMnO的紫色的消失₄和一个棕色的固体沉淀(MnO的外观₂)[15]。

2.6。检测三萜烯/类固醇(Liebermann-Burchard试剂)

一毫升的乙酸酐和5滴浓硫酸(H₂所以₄)被添加到提取。颜色变化从紫色到蓝色证实类固醇的存在(16)和蓝绿色的形成环表示萜类化合物的存在(17]。

2.7。香豆素类

2 N三毫升氢氧化钠加入2毫升的水提物。形成黄色表示香豆素的存在。确认测试是由添加1毫升盐酸5 N;在这种情况下是一种无色溶液形成上层是积极的(18]。

2.8。生物碱

Ethanolic提取物(20μL)是应用于薄层色谱板(硅胶60克,5×10厘米),筛选了使用toluene-ethyl acetate-diethylamine(70: 20: 10)作为溶剂系统。生物碱被发现后喷洒Dragendorff试剂为黄褐色的斑点TLC板(19]。

2.9。筛查倍半萜烯内酯

Baljet反应(1%苦味酸10%氢氧化钠)是用于检测倍半萜烯内酯的提取。试剂混合在一个1:1的比例和加入1毫升的提取(2 - 3毫克)。苦味酸盐钠溶液的黄颜色的变换橙红色颜色确认阳性反应(20.]。

2.10。测试醌类

悬浮在乙醇提取物(1毫升)服用1毫升的浓硫酸。红色显示的形成醌类的存在(21]。

2.11。羧基

羧基的存在证明了加入10滴10%碳酸氢钠溶液;可见泡沫的二氧化碳被认为是一个积极的反应(21]。

2.12。测试单宁

提取服用1毫升5%氯化铁是补充道。单宁的存在表明了蓝色黑色或绿色黑色沉淀的形成(22]。

2.13。信田测试

几个片段镁金属丝带(3 - 4块)被加入1毫升ethanolic提取,其次是一滴一滴地加浓盐酸。形成粉红色或红色表示的类黄酮(23]。

2.14。皂苷

两毫升蒸馏水被添加到悬浮在乙醇提取物和大力动摇了。丰富的泡沫层的形成表明皂苷的存在(23]。

2.15。碳水化合物

碳水化合物测试,提取(10毫克)停牌1毫升蒸馏水;后来2毫升0.2%蒽酮试剂和5滴浓硫酸是补充道。深绿色颜色显示存在的碳水化合物(21]。

2.16。抗菌活性的评价

抗菌活性的植物提取物使用agar-well扩散进行了生物测定。简单地说,100年μL新鲜文化(约10⁶CFU /毫升)均匀扩散到Mueller-Hinton琼脂(尼古拉斯)板块无菌Driglasky循环。然后,接种盘子被允许在室温下干燥20分钟。之后,6毫米直径的井是在使用消毒cup-borer琼脂和100年μ每个提取倒在井的L。甲醇作为控制。盘子在37°C 18 h孵化。证明了抗菌活性存在明显的抑菌圈的每个。该区域的直径测量和记录14]。

2.17。评估最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)

麦克风和MBC测定显示抗菌活性的植物提取物,由一个肉汤诺维提出的采用的方法等。24),小的修改。简单地说,100年μL (Mueller-Hinton肉汤(Difco)加不同浓度的植物提取物制备和转移到每个微型板块获得活性提取物的稀释,从1.0到25毫克/毫升。然后,10μL新的文化(最后1×10的浓度⁶CFU /毫升)的测试生物补充道。微型板块在37°C孵化24小时(25]。麦克风被定义为最低浓度的提取限制微生物测试的明显增长。

确定MBC, 100μL从每个显示没有明显增长reinoculated MH琼脂板;然后板块在37°C孵化24 h。MBC被定义为最低的提取浓度没有细菌生长。甲醇作为空白和四环素(西格玛奥德里奇,墨西哥城,墨西哥)积极控制。一旦MBC记录,亚致死的活动确定细菌生长;为此,浓度的75年,50岁和25%的MBC在96孔酶标检测和微生物细胞的数量是由平皿计数技术,如前所述。

2.18。生物膜的形成抑制

提取生物膜形成的影响评估在96孔聚苯乙烯的平底盘子26]。简单地说,300年μL接种新鲜trypticase大豆发酵肉汤(TSY)(最终浓度10⁶CFU /毫升)整除到每个微型板块和培养存在的亚致死浓度(75、50和25%的MBC)之前确定。井含有介质和那些没有与甲醇提取,只有被用作控制。盘子在37°C孵化48 h。孵化后,上层清液被移除和每个被用无菌蒸馏水彻底消除自由浮动的细胞;此后盘子风干了30分钟和生物膜形成是染在室温下15分钟了。0.1%的水溶液结晶紫。孵化后,多余的污点被用无菌蒸馏水洗板的三倍。最后,染料绑定到细胞可溶性增加250μL(95%乙醇每15分钟后孵化,吸光度测量使用微型板块读者波长570纳米。生物膜的决心使用公式SBF = (AB−CW) / G,其中SBF是特定的生物膜的形成,AB是连接和彩色的OD570纳米细菌,CW的OD570 nm彩色控制井只包含无菌培养基,和G的OD630纳米细胞生长在肉汤27]。

2.19。毒性生物测定

盐水虾(卤虫盐沼)杀伤力进行生物测定按照梅耶提出的方法论et al。28)来确定提取植物的毒性。为此,盐水虾囊肿被孵出浅矩形容器,分为两个不平等的隔间,满是无菌的人工海水(由溶解海盐38 g / L和调整pH值8.5使用1 N氢氧化钠)在不断曝气和适当的光。囊肿(ca。50毫克)被洒到较大的舱,这是黑暗的,而较小的照明。添加0.06%酵母溶液孵化室喂养幼虫。收集后48 h向光性的自由无节幼虫从点燃。

杀伤力进行生物测定使用10收集无节幼虫,被转移到瓶中测试了天然植物提取物,在10,100年和1000年μg / mL,和人工海水。适当数量的甲醇作为消极的控制。

孵化24小时后,生活无节幼虫被数和LC₅₀值是用概率单位回归分析估计。提取给信用证₅₀价值超过1000μg / mL被认为是无毒的。

2.20。统计分析

所有的实验结果都表示为平均值±标准偏差(SD)分析在至少重复三次。统计分析的数据是由方差分析(方差分析)和平均使用学生的比较以及,使用SPSS软件17.0版。LC₅₀的生物测定答:盐水湖确定根据Probit统计方法。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

总共有8 methanolic植物提取物临床细菌隔离测试5。甲醇被选为萃取剂,因为它是一个最好的溶剂用于抗菌物质的提取29日,30.]。此外,甲醇的极性确保极性和中等极性活性化合物的提取植物与微生物萜类、单宁、黄酮和多酚(31日]。

初步的抗菌测试的结果,由扩散法,非常变量之间植物提取物从0到2.8厘米(表2)。p . laevigata提取有效地对抗所有的临床分离株n双壳类灯泡没有显示任何微生物的活动。获得了最高的抑制直径p . laevigata提取(厘米),金黄色葡萄球菌应变,紧随其后的是g . microcephala(厘米),o . ficus-indica(厘米)也对金黄色葡萄球菌。与此同时大肠杆菌不容易受到这些提取物的直径,,厘米,分别。k .肺炎和粪大肠更耐提取,只有被p . laevigata和o . ficus-indica抑制区从来;另一方面,美国maltophilia是唯一没有抑制的微生物提取物。

然而,扩散试验被认为是一个定性的技术和主要用于选择粗提物的抗菌活性,通常是在抑制≥10毫米直径区域(32]。重要的是要认识到,抑制区域的大小不同的提取可能是由于极性的化合物,由于扩散但不活跃提取能给一个更大的直径比nondiffusible抑制但更积极的提取(33]。

最低抑制浓度(MIC)的结果相媲美的agar-well扩散技术,因为得到了最低的麦克风使用提取显示最好的抗菌活性(数据没有显示)。与此同时最低杀菌浓度(MBC)的结果列在表中3,在那里p . laevigata提取最低MBC值2毫克/毫升大肠杆菌,2.8毫克/毫升粪大肠,3.8毫克/毫升k .肺炎和0.7毫克/毫升金黄色葡萄球菌。提取并o . ficus-indica有招商银行从最高1.0≥15毫克/毫升。CMBs的g . microcephala分别为2.8和8.3毫克/毫升反对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,分别。MBC结果表明,金黄色葡萄球菌是更敏感的微生物,抑制8 methanolic提取物、美国maltophilia没有被任何提取。广泛地说,我们的结果同意先前的报道,提到更高活性的提取物对革兰氏阳性微生物相比,革兰氏阴性微生物(34]。这些差异可能是由于结构和细胞壁和细胞膜的成分差异25]。革兰氏阴性细菌的外膜作为屏障对于许多分子;同时,射流泵系统已经证明,可调节抗天然化合物(35]。大肠杆菌是最敏感的革兰氏阴性细菌;这一发现也同意先前的报道(36]。

根据前面提到的结果,决定选择3植物提取物(p . laevigata,o . ficus-indica,g . microcephala)这是积极的反对大肠杆菌(革兰氏阴性)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性);而且这些提取物显示MBC最低。

植物化学的筛查结果表的选择植物提取物进行了总结4并显示不同官能团的存在。香豆素类、生物碱类、单宁和类黄酮被发现p . laevigata提取。类似的化合物在不同种类的已报告这种植物p . juliflora单宁的存在,酚醛树脂,类黄酮,类固醇,萜烯和生物碱报道(37]。同样,报告Prosopis种虫害提到这种植物含有骆驼蓬碱,prosopine这是一种生物碱报告数篇论文,酪胺,prosopinine和juliflorine生物碱,插入到DNA和可以解释这种提取物的抗菌活性(31日,38]。

在的情况下o . ficus-indica结果表明三萜的存在,香豆素类、醌类、单宁,碳水化合物,黄酮类化合物;类黄酮引起细菌死亡通过抑制DNA或RNA合成和单宁包括可能抑制细胞外微生物酶(39,40]。

与此同时,三萜,香豆素类、醌类、单宁类黄酮,倍半萜烯内酯被发现g . microcephala。根据Goren et al。41]倍半萜烯内酯是主要的次生代谢物在菊科家庭负责抗菌活性。而麦克丹尼尔和罗斯(42报告生物碱、皂苷的存在赋予一些在这种植物毒性。

生物膜的形成抑制结果添加subinhibitory浓度(75、50和MBC的25%)的植物提取物大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表明,获得的效果摄入量有关。最好的减少生物膜是在更高浓度的提取白细胞(75%)。类似的结果被报道伊萨克亚伯拉罕et al。43)报道,methanolic雀跃提取显著抑制生物膜的形成和EPS生产大肠杆菌,粘质沙雷氏菌,铜绿假单胞菌,变形杆菌。Ravichandiran et al。(44)报道,ethanolic提取的树皮米利亚dubia引起了强烈的抑制溶血,聚集活性,生物膜的形成大肠杆菌。结果对应于50%和75浓度的影响引起的MBC显著()减少特定的生物膜的形成(SBF)大肠杆菌(图1)从大约3(强大的生物膜)水平的0.2 (MBC弱生物膜,75%)和1.2 (MBC主持生物膜,50%)。SBF分类类别都提到了米塔尔et al。45]提到强烈生物膜生产商(SBF指数> 2.00),中间生物膜生产商(SBF指数1和2之间)和弱生物膜生产商(SBF指数< 1.00)。也得到了类似的结果金黄色葡萄球菌(数据没有显示)。抑制生物膜的形成可以解释为黄酮类化合物的存在,之前报道如槲皮素、山柰酚、柚苷配基,和芹黄素能够减少生物膜合成,因为他们可以抑制autoinducer-2负责细胞间通讯的活动(46]。

答:盐水湖生物测定用于评价植物提取物的毒性和的优点是便宜,可靠和可再生的(47]。在先前的研究中,艾哈迈德et al。48确定甲醇提取物的毒性Prosopis spicigera报告无节幼虫在100 60%幸存下来μg / mL符合这项工作的结果,因为LD₅₀获得的p . laevigata是141.6μg / mL表明提取中等毒性;这可能是由于特定的生物活性化合物的存在可能与抗菌活性有关。为g . microcephala是适度和LD有毒吗₅₀323.3μg / mL,一些研究提到,这毒性可能是由于皂苷的存在,精油,mono和倍半萜烯,丹宁酸,生物碱(42,49]。的结果o . ficus-indica显示轻微的毒性(939.2μg / mL);这报道是一致的Deciga-Campos et al。50]。常用的低毒性可以解释这种植物在传统医学。此外,体内和体外实验的扁平的叶状茎和水果有利于健康的影响由于黄酮类化合物的存在,与健康有关的属性,是建立在他们的抗氧化活性51,52]。

4所示。结论

一些植物提取物的评估在研究潜在的抗菌和antibiofilm活动反对孤立院内细菌,可替代控制微生物形成的生物膜或可以作为模型来寻找新的药物。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的项目Investigacion Cientifica y Tecnologica (PAICyT 2012),新莱昂州大学。作者希望表达他们的感谢乔治阿曼德博士Verduzco马丁内斯,他出色的在收集植物的鉴定工作。

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