通心络预防同型半胱氨酸硫内酯所致内皮功能障碍在活的有机体内通过抑制氧化应激

摘要

目的．探讨中药通心络对同型半胱氨酸硫内酯(HTL)诱导的内皮功能障碍是否有积极作用，并探讨其可能的作用机制。方法和结果．经MTT检测，将培养的人脐静脉内皮细胞与HTL (1 mM)孵育24小时显著降低了细胞活力，并提高了活性氧的产生。用TXL(100、200、400)预处理细胞μg/mL）1小时可逆转HTL诱导的这些效应。此外，与GW9662（0.01,0.1）共立方 mM）消除了TXL对HTL处理细胞的保护作用体外实验，大鼠离体主动脉环暴露于HTL（1 1小时后，乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张功能显著受损，SOD活性降低，主动脉组织中丙二醛含量增加。用TXL（100、200和400）预孵育主动脉环 μg/mL)使HTL引起的疾病正常化。GW9662可逆转TXL诱导的所有效应。在活的有机体内结果表明，TXL (1.0 g/kg/d)能显著抑制HTL (50 mg/kg/d)喂养8周大鼠的氧化应激，预防内皮功能障碍。结论．TXL可改善HTL喂养大鼠内皮功能，这与PPAR有关γ- 依赖抑制氧化应激。

1.介绍

高同型半胱氨酸血症可能在血管疾病的发病机制中发挥作用，1969年被认为是动脉粥样硬化的独立危险因素[1]．同型半胱氨酸在人类血浆中以几种形式出现，包括最活跃的一种，即环硫酯的HTL，占血浆同型半胱氨酸总量的0.29% [2]．HTL通过游离碱性氨基酰化与蛋白质反应。特别是赖氨酸残基的ε -氨基形成加合物，诱导血浆蛋白的结构和功能变化[3.]．高水平的同型同型植物损害内皮功能并导致人类和动物模型的内皮损伤[4，5，提示内皮单层对血浆同型半胱氨酸水平的变化非常敏感。

Tongxinluo（TXL）是一种传统的中国复合处方，并于1996年通过中国的国家食品和药物管理局批准用于治疗心绞痛和缺血性卒中。越来越多的证据表明TXL具有心脏保护功能。用TXL处理有效降低血清脂质水平，抑制斑块炎症，增强脆弱斑块的稳定性[6]．还可减少心肌无再流和缺血-再灌注损伤，调节血管内皮功能[7]．基于上述研究，我们验证了TXL可能通过抑制氧化应激对高同型半胱氨酸诱导的内皮功能障碍产生保护作用的假设。在这里，我们报道了过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPAR)的药理学激活γ)可改善高同型半胱氨酸血症大鼠内皮功能。

2。材料和方法

2．1.材料

TXL来自中国石家庄以岭药业公司。GW9662 (2-Chloro-5-nitro-N-phenylbenzamide猫。: M6191，纯度>98%)、吡啶二硫代氨基甲酸酯(PDTC)、二氢乙锭(DHE)、罗布宁(apocynin)、乙酰胆碱(Ach)、硝普钠(SNP)、苯肾上腺素(PE)均购自Sigma公司。用于测定丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的商业试剂盒来自Cayman公司。

２.２.TXL的成分、制备及化学分析

如前所述，TXL中草药根据《2005年中国药典》鉴别和标记化合物标准化[8]．TXL含有12种药用成分:Panax Ginseng.c.a最大经济产量1.677;Ziziphus枣机。var。spinosa，1.173％;芍药笼罩。，1.558％;檀香L。, 0.354%;德伯利亚奥多芬·陈，4.005％;Boswellia Carteri Birdw。, 5.927%;博雁合成, 3.626%;山莨菪亚种，3.623％;Buthus martensii Karsch, 18.111%;Steleophage plancyi, 18.111%;Hirudo nipponica.，27.330％;Cryptotympana pustulata腔上囊, 18.111%。它们被磨成直径为10的超细粉末μm或更小，并制成胶囊。为减少TXL胶囊在不同批次间的剂量变异，严格规范了各成分的种类、产地、采收时间、药用部位和炮制方法。采用高效液相色谱法对TXL胶囊的成分进行定量分析。通心络胶囊水提物中含有五种主要成分Paeoniflorin.（6.142 mg / g），人参皂苷Rg1(0.884 毫克/克），人参皂苷Rb1(0.730毫克/克),jujuboside一(0.661毫克/克)jujuboside B(0.646毫克/克)。此外，在TXL胶囊的气相色谱指纹图谱上还鉴定出了两个峰，分别为异龙脑和婆罗洲．

２.３.动物

雄性Sprague-Dawley大鼠(周大, g） 从中南大学（中国长沙）实验动物中心购买。大鼠被关在温度控制的笼子里，光暗循环12小时。江汉大学和华中科技大学对动物议定书进行了审查和批准。

2.4。细胞培养

来自美国类型收集中心(ATCC)的人脐血管内皮细胞(HUVECs)在内皮细胞基础培养基(Clonetics Inc.， Walkersville, MD)中培养，添加2%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100μg / mL)。在所有实验中，细胞都在第3代到第8代之间。所有细胞均在37°C、5% CO的湿化气氛中培养₂和95%的空气。细胞生长到70-80%融合，然后用不同的药剂处理。

2.5.器官室

如前所述进行器官室研究[9]．麻醉下静脉注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)处死大鼠。将降主动脉切成3- 4mm长环状，将降主动脉切成3- 4mm长环状。用两个不锈钢夹将主动脉环悬挂并固定在器官腔内。将环置于器官浴槽中，其中加入三羧酸缓冲液(mM): NaCl, 118.3;氯化钾,4.7;MgSO₄0.6;KH₂阿宝₄，1.2；氯化钙₂，2.5；NaHCO_3.25.0;EDTA, 0.026;pH值7.4在37°C和气体95% O₂+ 5%股份有限公司₂．收缩前，给主动脉环施加2g张力90分钟。在此期间，每15分钟更换一次克雷布斯溶液。平衡后，用60 mM KCl刺激主动脉环。洗涤后，再经过30分钟的平衡期，PE (1μ在收缩平台期，累积Ach (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3)μ或SNP (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10)μM)加入到器官浴中诱导内皮依赖性或非依赖性舒张。

为了体外实验，环通过PE收缩（1 μM)，再随Ach累积浓度(0.01-3μM） 评估内皮的完整性。Ach（3）诱导的最大松弛环 μM)超过80%的患者被认为有完整的内皮，并被用于以下研究。然后用TXL(100,200,400)对环进行预处理μg/mL)处理30分钟后，加入HTL (1 mM)处理90分钟。洗后分别测定ache诱导的内皮依赖性舒张和snp诱导的内皮依赖性舒张。实验结束时，用液氮收集主动脉环匀浆后，测定NO和MDA含量。

2.6。MDA含量，SOD活性和一氧化氮（NO）水平的测量

采用商业试剂盒按照推荐方案检测主动脉组织或血液中MDA含量、SOD活性和NO水平。

2.7。细胞活力评估

如前所述，使用3-(4,5)-二甲基噻嗪(-z-y1)-3,5-二苯四唑脲(MTT)测定细胞活力[10]．细胞以10000/mL的密度接种于96孔板，孵育24小时。治疗后,10μL MTT（5 mg/mL）添加到每个孔中的培养基中2-4小时，直到可见紫色沉淀物。去除培养基后，75 μ每孔加入L二甲基亚砜，室温避光2小时。记录在570 nm处的吸光度。

2.8。活性氧的检测

如前所述，通过测量DHE荧光测定培养细胞中的ROS生成[11].简而言之，在治疗结束前，10 μ在培养基中加入M DHE, 37℃孵育30 min, PBS洗涤2次。图像由荧光显微镜拍摄。用荧光阅读器记录DHE在激发波(485 nm)和发射波(545 nm)下的荧光强度。控制设置为100%。

2.9。统计分析

数据以平均值±SEM报告。所有数据采用1-或2-way ANOVA进行分析，然后采用多因素方差分析测试,被认为是统计学意义的。

结果

3.1。TXL剂量依赖性地使htl处理的内皮细胞的活力正常化

我们首先研究了同型半胱氨酸中反应性最强的HTL是否影响培养的HUVEC中的细胞活性。如图所示1(一)MTT法检测到，HTL (1 mM)孵育24小时显著降低了HUVECs细胞的活力，表明同型半胱氨酸的有害影响与HTL的高反应性有关。接下来，我们研究了TXL是否能保护内皮细胞免受HTL的侵袭。如图所示1(一)，单独TXL不影响内皮细胞活力，但HTL剂量依赖性逆转细胞活力降低。

３．２．TXL剂量依赖性地抑制htl诱导的内皮细胞氧化应激

然后我们研究了TXL通过抑制氧化应激维持血管内皮细胞的正常表型。如图所示1 (b)和1 (c)在实验中，HUVECs与HTL (1 mM)孵育24小时显著增加了培养细胞中ROS的产生。然而，将这些细胞与TXL预孵育后，会以剂量依赖的方式抑制HTL诱导的ROS生成的增强。综上所述，TXL可以保护被HTL降低的细胞活力，这可能与氧化应激的抑制有关。

３．３．通过PPAR TXLγ保护htl处理的内皮细胞

PPAR的激活γ据报道，激动剂对内皮细胞氧化应激产生保护作用[12，13].我们接下来通过激活PPAR确定TXL是否γ通过使用PPAR的特异性拮抗剂GW9662在内皮细胞中提供有益作用γ破坏PPARγ信号(14]．正如预期的那样，抑制PPARγ明显消除TXL对提高细胞活力的保护作用(图6)2（a）)和减少ROS的产生(图2（b）和2（c））以剂量依赖的方式。将这些数据携带在一起，它表示通过PPAR的TXLγ激活抑制氧化应激，保护细胞活力。

3．4．通过PPAR TXLγ通过HTL孤立的主动脉圈的HTL抑制内皮依赖性放松

然后,我们执行体外实验检测TXL是否通过HTL孵育离体小鼠主动脉环来保护血管内皮功能。主动脉环暴露于HTL可显著损害疼痛诱导的内皮依赖性舒张(图)3（a）)．类似于体外通过培养细胞观察，TXL剂量依赖性逆转了HTL孵育的主动脉环中乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张（图3（a）)，表明TXL具有保护血管内皮的作用。

我们接下来确定TXL是否通过激活PPARγ使用GW9662对内皮细胞产生有益作用[14]．正如预期的那样，抑制PPARγGW9662明显消除了TXL对ACH引起的内皮依赖性松弛的保护作用（图3（b）)，表明TXL通过PPARγ激活可以保护内皮功能。此外，snp诱导的内皮依赖性舒张在所有组中均未发生改变(图)3（c）)，提示TXL对血管功能的保护作用仅限于内皮细胞而非血管平滑肌。

3．5．通过PPAR TXLγ在主动脉中保留氧化还原状态，该状态受到HTL的干扰

NO生物利用度降低，这是由于NO产量减少或NO向ONOO的异常转化⁻通过活性氧，有助于损害ache诱导的心血管系统内皮依赖性舒张[15]．然后，我们检查HTL是否在大鼠隔离主动脉环中保持正常的氧化还原状态。我们发现HTL显着降低了SOD活动（图4（a）)增加MDA含量（图1）4 (b))，当ROS与膜脂中的多不饱和脂肪酸链反应时形成[16]．然而，GW9662预处理细胞可显著消除htl培养的主动脉中TXL挽救的异常，提示TXL通过PPARγ/SOD-MDA维持抗氧化系统的正常平衡。

3.6。TXL可改善HTL喂养大鼠的内皮功能

然后,我们执行体内实验证实TXL是否改善高同型半胱氨酸血症大鼠血管内皮功能。同型半胱氨酸以不同的种类循环，主要是蛋白质结合，约1%为其还原形式和环状硫酯HTL。尽管血浆硫代内酯水平明显较低，同型半胱氨酸的有害影响与HTL的高反应性有关[17].我们给大鼠喂食HTL（50 以模拟高同型半胱氨酸血症诱导的内皮功能障碍模型。通过测量乙酰胆碱诱导的血管扩张来测定内皮功能。如图所示5(一个)， HTL显著抑制ache诱导的血管松弛。重要的是，给药TXL可逆转疼痛引起的血管松弛的减少。HTL和TXL均未改变snp诱导的血管松弛(图)5 (b))提示TXL对HTL喂养大鼠血管生物活性的改善是由于维持内皮功能。

3.7。TXL对HTL大鼠氧化应激有抑制作用

我们最终确定了TXL是否能维持htl喂养大鼠的正常氧化还原状态。正如预期的那样，HTL引起了一些变化，如血清NO水平的降低(图5 (c))，血清MAD水平升高(图5 (d))．HTL诱导的所有这些缺陷通过TXL施用来标准化。这个证据表明了体内TX1的保护作用可能与抑制氧化应激有关。

4.讨论

本研究首次证明HTL体外或体内导致加速氧化应激和内皮功能障碍，所有这些都被TX1脱落。机械地，TXL对血管功能的保护作用是归因于PPARγ激活，导致氧化应激的抑制。在高同型半胱氨酸血症大鼠中，TXL调节内皮细胞氧化还原状态，保护内皮功能。

本文的主要发现是TXL可预防htl诱导的内皮功能障碍。近年来研究发现同型半胱氨酸向HTL的转化在高同型半胱氨酸血症患者心血管疾病的进展中起着至关重要的作用。在本研究中，我们使用HTL治疗离体主动脉环体外或老鼠体内，两者均受损ache诱导的内皮依赖性舒张，这与我们之前的研究一致[18]．这证实了同型半胱氨酸的有害影响与HTL的高反应性有关，尽管血浆硫内酯水平非常低。最重要的是，htl诱导内皮功能障碍体外和体内通过TXL逆转，这是依赖的方式。集体，我们的结果表明TXL用作内皮细胞的保护剂。该发现也得到了培养的内皮细胞中的几项发布研究[19，20.或动物[21，22]已显示TX1保护内皮功能。然而，最近对人类的研究报道了TXL导致正常志愿者的内皮功能障碍。当然，健康和高管抑制因素之间这种差异的原因需要进一步调查。

总之，这些研究支持激活PPAR的TXL的新功能γ抑制nf-κB依赖性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氢化酶NAD（P）H氧化酶。这反过来抑制内皮细胞中的氧化应激，导致内皮功能的改善。TXL通过抑制氧化应激减轻HTL诱导的内皮功能障碍的发现可能在心血管疾病中有广泛的应用，因为内皮功能障碍是b在包括动脉粥样硬化在内的许多血管疾病的研究和进展中[23，24]及糖尿病[25]．因此，TXL可能是一种更有效的治疗动脉粥样硬化和高血压的药物。

利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

张毅设计并进行了实验，分析了数据，并撰写了论文。潘铁成、钟晓萱和蔡成进行了部分实验。

承认

本课题由湖北省科技厅纵向资助项目(2012FFB03401)资助。

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